Summary
Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Messung des mitochondrialen Massen- und Membranpotenzials in ex vivo kultivierten hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen.
Abstract
Ein feines Gleichgewicht aus Ruhe, Selbsterneuerung und Differenzierung ist der Schlüssel, um den hämatopoetischen Stammzellpool (HSC) zu erhalten und die lebenslange Produktion aller reifen Blutkörperchen aufrechtzuerhalten. In den letzten Jahren hat sich der Zellstoffwechsel zu einem entscheidenden Regulator der HSC-Funktion und des Schicksals entwickelt. Wir haben bereits gezeigt, dass die Modulation des mitochondrialen Stoffwechsels das Schicksal des HSC beeinflusst. Insbesondere konnten wir durch die chemische Entkopplung der Elektronentransportkette die HSC-Funktion unter Kulturbedingungen aufrechterhalten, die normalerweise eine schnelle Differenzierung induzieren. Die Begrenzung der HSC-Zahlen schließt jedoch häufig die Verwendung von Standard-Assays aus, um den HSC-Stoffwechsel zu messen und daher ihre Funktion vorherzusagen. Hier berichten wir über einen einfachen Durchflusszytometrie-Assay, der eine zuverlässige Messung des mitochondrialen Membranpotenzials und der mitochondrialen Masse in knappen Zellen wie HSCs ermöglicht. Wir diskutieren die Isolierung von HSCs aus dem Knochenmark der Maus und die Messung von mitochondrialen Masse- und Membranpotenzialen nach ex vivo Kultur. Als Beispiel zeigen wir die Modulation dieser Parameter in HSCs über die Behandlung mit einem Metabolenmodulator. Darüber hinaus erweitern wir die Anwendung dieser Methode auf menschliche periphere, blutabgeleitete T-Zellen und menschliche Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TILs), die dramatische Unterschiede in ihren mitochondrialen Profilen aufweisen, die möglicherweise verschiedene T-Zellen widerspiegeln. Funktionalität. Wir glauben, dass dieser Assay in Screenings eingesetzt werden kann, um Modulatoren des mitochondrialen Stoffwechsels in verschiedenen Zelltypen in verschiedenen Kontexten zu identifizieren.
Introduction
Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) sind eine kleine Population von Zellen, die im Knochenmark leben und die Blutproduktion und Homöostase während der gesamten Lebensdauer eines Organismus gewährleisten. HSCs vermitteln diesen Prozess, indem sie Vorläufer hervorrufen, die wiederum endlos differenzierte reife Blutzelllinien über mehrere Zellteilungsrunden und gut orchestrierte Differenzierungsschritte1erzeugen. Wichtig ist, dass HSCs ihre Energie über anaerobe Glykolykose erzeugen. Im Gegensatz dazu schalten engagiertere und aktive hämatopoetische Vorläufer ihren Stoffwechsel in Richtung mitochondrialer Stoffwechsel2,3,4. Dieser ausgeprägte Stoffwechselzustand wird geglaubt, um die HSCs vor zellulären Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) durch aktive Mitochondrien verursacht zu schützen, wodurch ihre langfristige in vivo Funktion5,6,7,8. Die direkte Messung des HSC-Stoffwechselzustands ist eine Herausforderung und aufgrund ihrer begrenzten Anzahl oft geringer Durchsatz. Hier beschreiben wir einen strömungszytometriebasierten Assay zur robusten Messung des mitochondrialen Membranpotentials (M) mit Tetramethylrhodinmethylester (TMRM) Fluoreszenz und mitochondrialer Masse unter Verwendung eines grünen fluoreszierenden mitochondrialen Flecks (Mitotracker Green) in HSCs. Wir haben bereits gezeigt, dass low 'm ein bona-fide funktioneller Marker von hochgereinigten HSCs9 und metabolischen Modulatoren ist, die in der Lage sind, die HSCs-Funktion9,10zu verbessern. Hier schlagen wir die Verwendung unserer Methode auf HSCs mitochondriale Profilierung als Strategie zur Identifizierung neuartiger Moleküle vor, die in der Lage sind, das langfristige Rekonstitutionspotenzial der HSCs zu verbessern.
Als Beispiel zeigen wir, dass dieser Assay zuverlässig die Senkung von HSC-M bei Exposition gegenüber Vitamin B3-analogem Nicotinamid-Ribosid (NR) misst. Dementsprechend zeigen wir in unserer kürzlich veröffentlichten Studie, dass NR die Blutrückgewinnung nach der Transplantation sowohl in Maus- als auch in humanisierten Maussystemen stark verbessert, indem es die hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferfunktionen direkt verbessert10. Die Kapazität solcher metabolischen Modulatoren ist von großem klinischen Wert, wenn man bedenkt, dass eine 25% Sterberate mit Verzögerungen bei der Blut- und Immunregeneration bei posttransplantierten Patienten verbunden ist11,12.
Darüber hinaus liefern wir Beweise dafür, dass diese Methode für die Charakterisierung des metabolischen Profils und der Funktion menschlicher T-Zellen angewendet werden kann. In den letzten Jahren ist die Entwicklung der Adoptivzelltherapie (ACT) mit autologen Tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) zum effektivsten Ansatz für bestimmte Arten von fortgeschrittenem Krebs mit extrem ungünstiger Prognose (z. B. metastasierendes Melanom, bei dem >50% der Patienten auf eine Behandlung ansprechen und bis zu 24% der Patienten eine vollständige Regression haben)geworden. TiLs, die eine ausreichende Antitumoraktivität haben, sind jedoch schwierig,14zu erzeugen. Die umfangreiche Proliferation und Stimulation, die TILs während der Ex-vivo-Expansion erfahren, verursacht T-Zell-Erschöpfung und Seneszenz, die die T-Zell-Antitumorreaktion dramatisch beeinträchtigen15. Wichtig ist, dass die antitumorale Kapazität der TILs eng mit ihrem Stoffwechsel16,17 verbunden ist und Ansätze, die darauf abzielen, den Stoffwechsel durch die Hemmung des PI3K/Akt-Signalwegs zu modulieren, ermutigende Ergebnisse hervorgebracht haben18,19. Aus diesem Grund vergleichen wir die von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) und patientenabgeleiteten TILs gewonnenen T-Zellen und zeigen, dass weniger differenzierte PBMC-abgeleitete T-Zellen eine niedrigere Und mitochondriale Masse aufweisen als endlos differenzierte TILs.
Wir stellen uns vor, dass dieser Assay verwendet werden kann, um neuartige metabolische Modulatoren zu identifizieren, die die HSC- und T-Zellfunktion durch die Modulation von m verbessern.
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Protocol
Alle im Manuskript beschriebenen Experimente folgen den Richtlinien unserer Institution und wurden nach schweizerischem Tierversuchsrecht (Zulassung: VD3194) und für die Forschung an menschlichen Proben durchgeführt (Protokoll: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. Hämatopoetische Stammzellextraktion
- Kaufen Sie wilde Mäuse des Typs C57BL6/J und halten Sie sie mindestens eine Woche im Tierheim, um transportassoziierten Stress zu reduzieren.
- Am Tag des Experiments, euthanisieren Sie die Maus mit CO 2-Erstickung.
- Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, um das Fell zu sterilisieren und schneiden Sie die Maus am Bauch mit Standard-Chirurgischen Werkzeugen, wie Sezierschere und Zange, um den Oberschenkelknochen und Tibiaknochen von den Hinterbeinen zu schneiden.
- Entfernen Sie die Muskeln, die an Oberschenkelknochen, Tibia und Becken befestigt sind, mit einem weichen Papiertuch und legen Sie die gereinigten Knochen in ein 50 ml-Rohr mit PBS mit 1 mM EDTA (Puffer) auf Eis.
- Einen Mörtel und Einen Stößel mit 70% Ethanol besprühen und in eine Zellkulturhaube geben. Sterilisieren Sie es mit UV für 30 min. Nach der Sterilisation spülen Sie den Mörtel und Stößel mit Puffer, um Spuren von Ethanol zu entfernen.
- Legen Sie die sauberen Knochen mit etwas Puffer (ca. 10 ml) in den Mörtel und zerkleinern Sie sie vorsichtig, um das Knochenmark in Suspension heraus zu bekommen. Sammeln Sie nun die Zellsuspension und leiten Sie sie durch ein 70-m-Zellsieb in ein 50 ml-Rohr, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Wiederholen Sie Schritt 1.6, bis das gesamte Knochenmark extrahiert wurde und der Knochenrest weiß geworden ist.
- Legen Sie die 50 ml Tube(n) mit der Einzelzellsuspension des Knochenmarks auf eine Zentrifuge. Führen Sie die Zentrifuge bei 300 x g 10 min bei 4 °C, um die Zellen zu pellet.
- In der Zwischenzeit 10 ml 1x RBC-Lysepuffer in autoklaviertem destilliertem Wasser vorbereiten. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-mm-Filter.
- Sammeln Sie das Probenrohr aus der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Pipette den 1x RBC Lyse Puffer (Tabelle der Materialien) auf dem Zellpellet. Das Pellet austreiben und eine homogene Lösung vorbereiten, indem man ein paar Mal auf und ab pfeift. Lassen Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 1-2 min für die RBC-Lyse auftreten. Stoppen Sie den Lyseprozess, indem Sie das Rohr mit dem Puffer füllen.
- Das Rohr auf eine Zentrifuge legen und bei 300 x g bei 4 °C 5 min drehen. Sammeln Sie das Rohr von der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie 10 ml Puffer hinzufügen und filtern Sie die Lösung über ein 70-ml-Zellsieb in ein neues 50 ml-Rohr, um die Trümmer aufgrund der RBC-Lyse zu entfernen.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Sammeln Sie das Rohr von der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in 500 l Puffer aus.
- Entfernen Sie ein 100 L Aliquot und halten Sie es in einem separaten 1,5 ml-Rohr auf. Fügen Sie den verbleibenden 450 l Biotin-L-Antikörper-Antikörpercocktail aus dem Vorläuferanreicherungskit(Tabelle der Materialien) zu den restlichen 450 l Zellsuspension hinzu. Bei 4 °C auf einem Shaker 15 min inkubieren.
- 15 ml Puffer hinzufügen und das Rohr bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrieren. Sammeln Sie das Rohr von der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in 460 L Puffer aus. Entfernen Sie ein 10 L Aliquot und halten Sie es in einem separaten 1,5 ml-Rohr auf.
- Fügen Sie der verbleibenden 450-L-Zellsuspension 50 L Streptavidin-Magnetperlen aus dem Vorläuferanreicherungskit(Materialtabelle)hinzu. Bei 4 °C auf einem Shaker 15 min inkubieren.
- 15 ml Puffer hinzufügen und das Rohr bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrieren. Sammeln Sie das Rohr von der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Das Pellet in 5 ml Puffer wieder aufhängen und die Lösung in ein 15 ml Rohr übertragen.
- Nehmen Sie das Rohr zu einem automatisierten Zellabscheider (Tabelle der Materialien). Führen Sie ein Waschprogramm aus, um die Schläuche des Zellabscheiders zu spülen und zu grundieren. Legen Sie die Probe und zwei Sammelrohre auf den Rohrhalter. Führen Sie die Trennung mit dem Programm "Deplete" durch. Sammeln Sie die positiven und die negativen Brüche aus dem automatisierten Zelltrennzeichen, sobald der Lauf beendet ist.
HINWEIS: In Ermangelung eines automatischen Zellabscheiders können die Benutzer manuelle Magnetsäulen und entsprechende Magnete gemäß der Bedienungsanleitung verwenden. Die Benutzer sollten bedenken, dass der Prozess der manuellen Trennung langsamer ist als der automatisierte. Außerdem sind die manuellen Spalten anfälliger für Verstopfungen. Daher wird Benutzern empfohlen, die Probe zu verdünnen und die Spalte langsam zu belasten. - Entsorgen Sie den positiven Bruch. Füllen Sie das negative Bruchrohr mit Puffer. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
- In der Zwischenzeit bereiten Sie den Antikörpermix in 1 ml Endvolumenlösung und die einfarbigen Steuerungen in 200 l Endvolumenlösung vor, wie in Tabelle der Materialien und Tabelle 1beschrieben.
HINWEIS: Wenn das TMRM und der grüne fluoreszierende mitochondriale Fleck mit Stammzellmarkerfärbung kombiniert werden sollen, dann ersetzen Sie CD150-PE durch CD150-PEcy5 und Streptavidin-Tx rot durch Streptavidin-Pac Orange. - Sammeln Sie das Probenrohr aus der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Das Pellet in 1 ml Antikörpermischung wieder aufhängen. Fügen Sie in jedem der einfarbigen Steuerröhrchen (außer Linie) 10 L Zellen (ab Schritt 1.13) hinzu. Fügen Sie 10 L Zellen (ab Schritt 1.14) in die Einfarbigröhre der Abstammung ein.
- Inkubieren Sie die Proben- und einfarbigen Steuerrohre bei 4 °C auf einem Shaker für 45 min. Bedecken Sie den Eiskübel mit einem Deckel oder einer Aluminiumfolie.
- Füllen Sie alle Rohre mit Puffer und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und setzen Sie die Probe in 1 ml Puffer- und einfarbigen Steuerelementen in 200 L Puffer wieder aus.
- Übertragen Sie die Probe und die einfarbigen Steuerungen auf 5 ml Filteroben-FACS-Rohre.
- Nehmen Sie die Rohre zur Sortiermaschine und sortieren Sie die HSC-Population (Gating-Strategie in Abbildung 1A) in 1,5 ml-Rohren, die 400 l Stammzellausdehnungsmedium enthalten.
2. Ex-Vivo-Kultur hämatopoetischer Stammzellen
- Sammeln Sie Rohre mit sortierten Zellen (siehe Abschnitt 1 für die Zellextraktion). Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstandes, ohne das Pellet zu lösen, und lassen Sie 50–80 l auf dem Zellpellet. Dadurch wird der Zellverlust minimiert.
- Das Zellpellet im Stammzellexpansionsmedium abhängig von der Anzahl der zu testenden Bedingungen auf ein endgültiges Volumen aussetzen (Anzahl 100 l pro Brunnen/Kulturzustand).
- Vorbereitung eines 2x Kulturmediums mit Stammzellexpansionsmedium, Stammzellfaktor (200 ng/ml), FLT3-Ligand (4 ng/ml) und Pen-Strep-Antibiotika (1%) (2x Basalmedium; Materialtabelle).
- Nehmen Sie eine sterile Gewebekultur behandelt 96 U-Boden-Brunnenplatte (Tabelle der Materialien) und identifizieren Sie die Brunnen, in denen die Zellen kultiviert werden (Plattendesign in Abbildung 1B).
HINWEIS: Benutzern wird empfohlen, marginale Brunnen zu vermeiden, da sie anfälliger für Verdunstung sind. - Legen Sie 100 l 2x Basalmedium, das zuvor in Schritt 2.3 hergestellt wurde, in diese Brunnen. In der markierten NR gut 2 l einer 100x NR-Lösung (Materialtabelle )hinzufügen. Nr alle 24 h auffüllen.
HINWEIS: Die Auffüllung ist spezifisch für NR. Andere Stoffwechselmodulatoren können nachgefüllt werden oder auch nicht. - Samen 100 l Zellen, die in Schritt 2.2 auf den Brunnen mit 2x Basalmedium hergestellt werden. In diesem Experiment lagen die HSCs pro Bohrkörper zwischen 800 und 1.000 Zellen.
- Bereiten Sie fünf zusätzliche Brunnen mit 2x Basalmedium vor. In jeder dieser addieren 100.000 ganze Knochenmarkzellen (ab Schritt 1.13) resuspendiert in 100 l Stammzellausdehnungsmedium als Färbung Spirierungssteuerungen für die Postkultur-Flow-Zytometrie-Analyse verwendet werden.
HINWEIS: Wenn Benutzer Stammzellmarker und mitochondriale Marker für die Postkulturanalyse kombinieren möchten, wird empfohlen, zusätzlich die Vorläuferpopulation zu sortieren (entweder Ckit+-Zellen oder LKSCD150-Zellen). Samen diese sortierten Vorläufer in den Färbekontrollbrunnen für die Postkultur-Flow-Zytometrie-Analyse. Bereiten Sie einen Brunnen pro einzelnen Fleckenfarbe vor. - Legen Sie 200 l autoklaviertes Wasser in alle umliegenden Brunnen, um die Verdunstung aus Brunnen, die Zellen enthalten, zu reduzieren. Lassen Sie die Platte ungestört in einem Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 für die Dauer des Kulturzeitraums (72 h). Entfernen Sie die Platte, um NR alle 24 h aufzufüllen und legen Sie sie wieder in den Inkubator.
3. Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotentials
- Am Ende der Kulturperiode bereiten Sie eine 100-fache Lösung von TMRM (20 m) und Mitotracker grün (10 m) (grüner fluoreszierender Fleck) im Stammzellausdehnungsmedium(Materialtabelle)vor.
- Fügen Sie in jeder der Testbrunnen 2 l 100x TMRM-Lösung und 2 l 100x grüne fluoreszierende Fleckenlösung hinzu. Fügen Sie 2 l von 100x TMRM in die TMRM-Steuerung ein. Fügen Sie 2 l von 100x grünen fluoreszierenden Fleck in der Mitotracker-Steuerung gut hinzu. Legen Sie die Platte für 45 min wieder in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2. Bedecken Sie die Plattenoberseite mit Aluminiumfolie.
HINWEIS: Eine zusätzliche Steuerung mit Verapamil (ABC-Pumpenhemmer) kann vorbereitet werden, wenn ABC-Pumpe vermittelten Farbstoff Efflux getestet werden muss. Dazu fügen Sie 50 M Verapamil in eine der Testbrunnen 1 h vor der Färbung für TMRM und grüne fluoreszierende Flecken. - Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 5 min. Umkehren Sie die Platte, um den Überstand zu entfernen. Fügen Sie 200 l Standard-FACS-Puffer (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS) hinzu, zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3x. Der Anwender muss sicherstellen, dass die Platte immer mit Folie bedeckt ist, um eine minimale Lichteinwirkung zu gewährleisten.
HINWEIS: Wenn Benutzer die mitochondriale Färbung mit Stammzellfärbung kombinieren müssen, muss die Probe mit einem Antikörpermix aus allen Stammzellmarkern inkubiert werden, und die einfarbigen Kontrollen müssen mit einzelnen Antikörpern separat bei 4 °C für 30–45 min gefärbt werden.
HINWEIS: Bei allen Schritten müssen die Benutzer die Platte mit Aluminiumfolie bedeckt halten. Benutzer müssen beachten, dass dieser zusätzliche Färbeschritt und nachfolgende Waschschritte zu einem zusätzlichen Zellverlust führen können. - Setzen Sie die Zellen in 200 L FACS-Puffer aus und übertragen Sie sie in FACS-Rohre.
- Führen Sie die Proben auf dem Durchflusszytometer aus (siehe Abbildung 1). Einfarbige Röhren, die WBM enthalten, sind: (1) Unstained; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) grüner fluoreszierender Fleck (FITC); (5) Voller Fleck (PE und FITC).
- Erwerben Sie zunächst die einfarbigen Steuerelemente, um die Maschine einzurichten. Verwenden Sie die laufende Software auf dem Computer, um die Kompensation zu berechnen. Sobald die Kompensation angewendet wurde, erwerben Sie die HSC-Probe und zeichnen Sie so viele Ereignisse wie möglich auf.
HINWEIS: Wenn die Stammzell- und mitochondrialen Marker kombiniert werden, müssen die Anwender besonders vorsichtig sein mit der Kompensation zwischen TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) und Sca-1 (APC). Außerdem sollten die Proben sofort nach der Färbung ausgeführt werden. - Exportieren Sie die FACS-Dateien aus dem Zytometer und analysieren Sie die Daten auf einer Analysesoftware (Tabelle der Materialien).
- Öffnen Sie für die Analyse die Datei auf der Analysesoftware. Identifizieren Sie mit FSC-A und SSC-A gating die Zellpopulation. Identifizieren Sie Singlets in den nächsten Gates, bevor Sie den negativen DAPI-Anteil (live cells) plotten. Im Live-Zell-Tor erstellen Sie ein Konturdiagramm im TMRM- und grünen fluoreszierenden Fleckenkanal, um die Größe bzw. masse zu messen (Abbildung 2A). Exportieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) dieser beiden Kanäle im Live-Zell-Gate.
- Das TMRM Low Gate wird basierend auf der Schulterpopulation im TMRM-Kanal eingestellt. Die TMRM Einfarbigsteuerung kann verwendet werden, um diese Schulterpopulation zu identifizieren, um das Tor einzustellen. Exportieren Sie den Anteil der Lebenden Zellen im TMRM Low Gate in Ihrer Steuerung und testen Sie Proben zum Plotten.
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Representative Results
In Abbildung 1 zeigen wir die Gating-Strategie zur Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus dem Mausknochenmark und das Layout der Platte für ihre Ex-vivo-Kultur. Abbildung 1A zeigt die Identifizierung des Lymphozytenanteils im SSC-A/FSC-A-Diagramm. Doublets wurden im Singlet-Gate entfernt, gefolgt von der Identifizierung von lebenden Zellen durch das Fehlen eines DAPI-Signals. Die LKS-Population, definiert durch Abstammung - Sca1+cKit+, wurde identifiziert. Es ist bekannt, dass diese Population Stamm- und Vorläuferzellen enthält. HSCs bilden etwa 5–10% der Zellen in der LKS-Population und wurden durch Gating für CD150+CD48- Population identifiziert. Abbildung 1B stellt das Layout der 96-Well-Platte für die Ex-vivo-Kultur dar. Sortierte HSCs wurden unter unterschiedlichen Kulturbedingungen plattiert: In diesem Fall ergänzten Kontroll- und NR-Kulturbedingungen. Ganze Knochenmarkzellen wurden auch als einfarbige Kontrollen plattiert, wie im Protokoll beschrieben. Es ist wichtig, alle umliegenden Brunnen mit Wasser zu füllen, um eine Verdunstung von Medien aus zellhaltigen Brunnen zu vermeiden. Darüber hinaus wurden, wie bereits erwähnt, Randbrunnen für die Zellkultur vermieden, weil sie anfälliger für Verdunstung sind.
Abbildung 2 zeigt die Messung des mitochondrialen Membranpotentials (M) und der Masse in HSCs nach der Kultur. Abbildung 2A zeigt repräsentative Parzellen mit TMRM-Spiegeln (oben) und grünen fluoreszierenden mitochondrialen Flecken (unten) in HSCs, die unter Kontrolle kultiviert sind, und NR-ergänzten Bedingungen. Die NR-Behandlung zeigte einen deutlichen Anstieg derTMRM-Niedrigen Population. Abbildung 2B zeigt die Quantifizierung aus drei unabhängigen Stichproben. Die NR-Behandlung erhöhte den Anteil der Zellen imTMRM-Low-Gate signifikant und zeigte eine signifikante Senkung der TMRM-Fluoreszenzintensität. Mitochondriale Masse (dargestellt durch grüne Fluoreszenzintensität) änderte sich bei der NR-Supplementierung nicht. Zusätzlich kombinierten wir Stammzellmarkerfärbung mit mitochondrialer Färbung post kultur. Abbildung 2C zeigt die Gating-Strategie zur Identifizierung von HSCs aus Abstammungsnegativen und LKS-Populationen nach der Kultur in den beiden Kulturbedingungen. Das TMRM- und das grüne fluoreszierende mitochondriale Fleckprofil dieser geschlossenen HSCs ist in Abbildung 2D zusehen. Die Exposition gegenüber NR zeigte einen signifikanten Anstieg derniedrigen TMRM-Bevölkerung von %TMRM und einen signifikanten Rückgang der TMRM-Fluoreszenzintensität in geschlossenen HSCs. Das grüne fluoreszierende mitochondriale Fleckgrünsignal blieb in den beiden Bedingungen unverändert.
Abbildung 3 zeigt die Messung des mitochondrialen Membranpotentials (M) und der Masse in verschiedenen menschlichen T-Zellen: periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie CD4+ und CD8+ Tumor infiltrierende Lymphozyten (TILs) nach dem Schnellexpansionsprotokoll (REP). Abbildung 3A zeigt repräsentative Diagramme der TMRM-Spiegel (oben) und grünfluoreszierender mitochondrialer Flecken (unten) zirkulierender (PBMC) und tumorinfiltrierender (TIL) CD4+ und CD8+ T-Zellen. TILs zeigten einen deutlichen Anstieg des TMRM- und grünen fluoreszierenden mitochondrialen Flecksignals im Vergleich zu zirkulierenden T-Zellen. Abbildung 3B zeigt die MFI-Quantifizierung von TMRM und grüner fluoreszierender mitochondrialer Färbung. TILs zeigten höhere TMRM- und grüne fluoreszierende mitochondriale Färbungssignale im Vergleich zu PBMC-abgeleiteten T-Zellen. Diese Daten deuten darauf hin, dass TILs ein ausgeprägtes metabolisches Profil mit erhöhter Masse von 'm und mitochondrialen' aufweisen.
Abbildung 1: Isolierung und Kultur hämatopoetischer Stammzellen. (A) Gating-Strategie zur Isolierung hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) auf Basis von Zelloberflächenmarkern. HSCs wurden als Abstammung identifiziert- Sca1+ cKit+ (LKS) CD150+CD48-. (B) Design von 96 Brunnenplatte in Kultur gesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mitochondriale Profile von HSCs. (A) FACS-Konturdiagramm, das HSCs post kultur in basalen oder NR-ergänzten Bedingungen zeigt. TMRM (oben) und grüne fluoreszierende mitochondriale Fleckenprofile (Mitotracker) (unten) werden angezeigt. (B) Quantifizierung von TMRM und grünem fluoreszierendem mitochondrialem Fleckensignal. NR-Supplementierung führte zu einer Abnahme des TMRM-Profils unter Beibehaltung des grünen fluoreszierenden mitochondrialen Flecksignals. (C) Konturdiagramme, die die Identifizierung der HSC-Bevölkerung unter Kontrolle und NR-ergänzungen Bedingungen nach der Kultur zeigen. (D) Konturdiagramme und Quantifizierung von TMRM und grünem fluoreszierendem mitochondrialem Fleckensignal in phänotypic HSCs post culture. DIE NR-Supplementierung reduzierte das TMRM-Signal, während das grüne fluoreszierende mitochondriale Flecksignal in HSCs unverändert blieb. Student t test ***p < 0.001, ** p < 0.01, * p < 0.05, nicht signifikant > 0.05, Fehlerbalken = SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Mitochondriale Profile menschlicher PBMCs und TILs: (A) FACS-Konturdiagramm mit CD4+ und CD8+ frisch isoliert von PBMCs oder tumorabgeleiteten CD4+ und CD8+ post REP (Schnellausdehnungsprotokoll). TMRM (oben) und grüne fluoreszierende mitochondriale Fleckenprofile (Mitotracker) (unten) werden angezeigt. (B) Quantifizierung von TMRM und grünem fluoreszierendem mitochondrialem Fleckensignal. TILs zeigten eine geringere mitochondriale Aktivität und Masse. Student t-test ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, nicht signifikant > 0.05, Fehlerbalken = SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| S.No | Antikörpername | Arbeitsverdünnung |
| 1 | Streptavidin Tx rot | 1/200 |
| 2 | Sca1 APC | 1/200 |
| 3 | Ckit PeCy7 | 1/100 |
| 4 | CD150 PE | 1/100 |
| 5 | CD48 PB | 1/100 |
| Nur dann zu verwenden, wenn Stammzell- und mitochondriale Marker kombiniert werden. | ||
| 6 | Streptavidin Pac orange | 1/200 |
| 7 | CD150 PE-Cy5 | 1/100 |
Tabelle 1: Verdünnungen von Antikörpern.
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Discussion
Eine strenge Regulierung der HSC-Funktion ist wichtig, um eine stabile Hämatopoese während der Lebensdauer eines Organismus aufrechtzuerhalten. Wie verschiedene andere Zelltypen im Körper ist ein Schlüsselbestandteil, der zur Regulierung der HSC-Funktion beiträgt, der Zellstoffwechsel. Frühere Studien aus unserem Labor9 und anderen2,3 haben die Bedeutung von Mitochondrien für die Aufrechterhaltung eines ausgeprägten Stoffwechselzustandes in HSCs impliziert. Aufgrund der extrem geringen Anzahl von HSCs, die aus dem murinen Knochenmark isoliert sind, ist es schwierig, sie über Standard-Metabolische Assays (z.B. Sauerstoffverbrauch mit SeaHorse) zu analysieren. Basierend auf unserer bisherigen Arbeit standardisierten wir einen einfachen Flow-Zytometrie-Assay, um das mitochondriale Masse- und Membranpotenzial (eine indirekte Auslesung der Aktivität) in einer geringen Anzahl von Zellen (d.h. HSCs) zuverlässig zu messen. Dieser Test ermöglicht die Messung an lebenden Zellen, ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen9, so dass sie für alle nachgeschalteten funktionellen Assays (wie KBE oder Knochenmarktransplantationen) zur Verfügung stehen, die Benutzer durchführen möchten. Wir sehen vor, dass dieser Test in Screening-Experimenten verwendet wird, was eine schnelle Lektüre des mitochondrialen Profils von HSCs mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund oder Knockout-Modellen ermöglicht. Wichtig ist, dass unser Assay mit CFSE-Färbung kombiniert werden kann, um eine doppelte Auslesung der HSC-Proliferation und ihres mitochondrialen Profils9,10zu haben, was die Analyse des metabolischen Schicksals der Teilung von HSCs ermöglicht. Da es sich um ein schwieriges Färbeverfahren handelt und wir mit einer geringen Anzahl von Zellen (HSCs) arbeiten, ist es wichtig, dass die Benutzer nach der Zentrifugation immer 80–100 l lösungsmittel in den Rohren lassen, um den Zellverlust zu minimieren. Darüber hinaus sollten die Rohre oder Platten bei allen Nachfärbeschritten vor Licht geschützt werden, entweder durch Bedecken in Folie oder durch Arbeiten in einer umgebung mit geringem Licht. Wenn die Benutzer sich entscheiden, HSC-Färbung mit mitochondrialen Farbstoffen zu kombinieren, müssen sie überprüfen, ob die Kompensation korrekt durchgeführt wird, insbesondere zwischen TMRM (PE), PeCy5 und APC.
Wichtig ist, dass eine kürzlich erschienene Veröffentlichung die Verwendung von mitochondrialen Farbstoffen in HSCs in Frage stellt, da sie anfällig für Pumpenausfluss sein könnten. Diese Studien berichten, dass die meisten primitiven hämatopoetischen Fächer haben eine höhere Anzahl von Mitochondrien im Vergleich zu ihren engagierten Vorfahren20. Nach unserer Erfahrung unterstützt die QPCR-Analyse die Verwendung von Maus-Genmodellen (Mito eGFP-Mäuse21), mitochondrien-dye-unabhängigen Färbemethoden (TOM20-Antikörper), qpCR-Analyse unterstützt die Vorstellung, dass die meisten primitiven hämatopoetischen Kompartimente einen niedrigeren mitochondrialen Gehalt10aufweisen. Wir sind der Meinung, dass weitere Studien durchgeführt werden müssen, um diese Diskrepanz auf diesem Gebiet zu verdeutlichen.
Parallel dazu zeigen wir, dass die Verwendung von mitochondrialem Profiling genutzt werden könnte, um die metabolische Eignung menschlicher TILs zu bestimmen und metabolische Strategien zu entwickeln, die darauf abzielen, die Funktion erschöpfter T-Zellen wiederherzustellen. Tatsächlich zeigen T-Zellen, die von PBMCs isoliert sind, eine geringere mitochondriale Aktivität (TMRM) und Masse (Mitotracker Green), während mehr erschöpfte T-Zellen wie TILs eine höhere mitochondriale Aktivität und Masse aufweisen, was auf eine mögliche metabolische Umprogrammierung während der Erschöpfung hindeutet. Dementsprechend haben frühere veröffentlichte Studien gezeigt, dass Stammzell-ähnliche Gedächtnis-T-Zellen (TSCM), T-Zellen mit verbesserter Persistenz und in der Lage, langfristige Rückrufreaktionen, haben niedrigere m und Behandlungen, die auf den T-Zellstoffwechsel abzielen, ihre Funktion stark beeinflussen können22,23.
Schließlich glauben wir, dass unser Ansatz ein wertvolles Werkzeug für die Identifizierung neuartiger Verbindungen sein könnte, die dysfunktionale HSCs (z. B. Alterung oder hämatologische Malignome) reparieren können, indem sie ihre mitochondriale Tauglichkeit wiederherstellen.
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Disclosures
Einige Elemente dieser Arbeit wurden als Anmeldung P1828EP00 beim Europäischen Patentamt eingereicht.
Acknowledgments
Wir danken der UNIL Flow Cytometry Core Facility für ihre Unterstützung, insbesondere Dr. Romain Bedel. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der Kristian Gerhard Jebsen Stiftung an N.V. und O.N. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
- Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
- Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
- Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
- Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
- Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
- Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
- Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
- Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).
