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Evaluación de la toxicidad aguda por inhalación de partículas transmitidas por el aire mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido

Published: February 23, 2020 doi: 10.3791/60572
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 5, 3,4, 2, 2, 1, 3,4, 1,2
1Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology, 2Walther Straub Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Munich, 3Cultex Laboratories GmbH, 4Cultex Technologies GmbH (formerly Cultex Laboratories GmbH), 5seh consulting + services

Summary

Presentamos un sistema de exposición in vitro robusto, transferible y predictivo para el cribado y seguimiento de partículas transmitidas por el aire relativas a su citotoxicidad pulmonar aguda mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido (ALI).

Abstract

Aquí, presentamos un sistema modular de exposición in vitro especialmente diseñado que permite la exposición homogénea de células pulmonares humanas cultivadas en la ALI a gases, partículas o atmósferas complejas (por ejemplo, humo de cigarrillo), proporcionando así exposición de la superficie apical de la región alveolar humana al aire. A diferencia de los modelos de exposición secuencial con guía lineal de aerosoles, el diseño modular del sistema de flujo radial cumple con todos los requisitos para la generación y transporte continuo de la atmósfera de prueba a las células, una distribución y deposición homogénea de las partículas y la eliminación continua de la atmósfera. Este método de exposición está diseñado principalmente para la exposición de células a partículas en el aire, pero puede adaptarse a la exposición de aerosoles líquidos y gases altamente tóxicos y agresivos dependiendo del método de generación de aerosoles y el material de los módulos de exposición .

En el marco de un estudio de validación recientemente completado, este sistema de exposición se demostró como un método de cribado transferible, reproducible y predictivo para la evaluación cualitativa de la citotoxicidad pulmonar aguda de partículas en el aire, potencialmente reducir o reemplazar experimentos con animales que normalmente proporcionarían esta evaluación toxicológica.

Introduction

La inhalación de partículas tóxicas en el aire es un problema de salud pública, lo que lleva a una multitud de riesgos para la salud en todo el mundo y muchos millones de muertes al año1,2. El cambio climático, el desarrollo industrial en curso y la creciente demanda de productos energéticos, agrícolas y de consumo han contribuido al aumento de las enfermedades pulmonares en los últimos años3,4,5,6. El conocimiento y la evaluación de sustancias inhalables en relación con su toxicidad aguda por inhalación proporcionan la base para la evaluación del peligro y la gestión del riesgo, pero esta información sigue faltando para una amplia gama de estas sustancias7,8. Desde 2006, la legislación química de la UE REACH (Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de Productos Químicos) exige que los productos ya existentes y de nueva introducción se sometan a una caracterización toxicológica, incluida la vía de inhalación antes de su comercialización. Por lo tanto, REACH se centra en métodos alternativos y libres de animales, la aplicación del principio "3R" (reemplazo, refinamiento y reducción de experimentos con animales) y el uso de modelos in vitro apropiados9. En los últimos años, se han desarrollado muchos modelos de prueba de toxicidad por inhalación no animal diferentes y adecuados (por ejemplo, cultivos de células in vitro, modelos de pulmón en un chip, rodajas pulmonares cortadas de precisión (PCLS)) con el fin de evaluar la toxicidad aguda por inhalación de partículas en el aire5,7,10,11. En términos de modelos de cultivo celular in vitro, las células cultivadas pueden exponerse en condiciones sumergidas o en la ALI(Figura 1). Sin embargo, la validez de los estudios de exposición sumergida es limitada con respecto a la evaluación de la toxicidad de los compuestos en el aire, especialmente las partículas. Las técnicas de exposición sumergida no se corresponden con la situación humana in vivo; el medio de cultivo celular que cubre las células puede afectar a las propiedades fisicoquímicas y, por lo tanto, las propiedades tóxicas de una sustancia de ensayo12,13. Los modelos de inhalación in vitro DE ALI permiten la exposición directa de las células a las sustancias de ensayo sin interferencias del medio de cultivo celular con partículas de ensayo, imitando así la exposición humana con mayor similitud fisiológica y biológica que las exposiciones sumergidas12,14.

No obstante, en el caso de procesos reglamentarios como REACH, sólo se dispone de modelos animales en el ámbito de la toxicología aguda por inhalación, ya que hasta el momento no se han validado suficientemente suficientemente y aceptado oficialmente métodos in vitroalternativos. A tal fin, los modelos de ensayo deben validarse de acuerdo con los requisitos del Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para alternativas a ensayos con animales (EURL-ECVAM) sobre la validez de los ensayos15.

Un antiguo estudio de prevalidación y un estudio de validación recientemente completado demostraron con éxito el área de aplicación del sistema de exposición CULTEX RFS y su transferibilidad, estabilidad y reproducibilidad13. Este sistema de exposición es un sistema de exposición in vitro basado en células que permite la exposición homogénea de las células a gases, partículas o atmósferas complejas (por ejemplo, humo de cigarrillo) en la ALI debido a su concepto de distribución radial de aerosoles y la conducción del aerosol de ensayo en un flujo continuo sobre las células16. El módulo básico de este sistema de flujo radial consiste en el adaptador de entrada, el módulo de guía de aerosol con una distribución radial de aerosoles, el módulo de muestreo y zócalo, y un módulo de bloqueo con una rueda de mano(Figura 2). Las partículas generadas llegan a las células a través del adaptador de entrada y el módulo de guiado de aerosol y se depositan en las plaquitas de cultivo celular, que se encuentran en las tres cámaras de exposición dispuestas radialmente del módulo de muestreo. El módulo de guía de aerosoles, así como el módulo de muestreo se pueden calentar mediante la conexión a un baño de agua externo17.

En el marco de ambos estudios, se utilizaron células A549 para todos los experimentos de exposición. La línea celular A549 es una línea celular epitelial inmortalizada humana que está muy bien caracterizada y se ha utilizado como modelo in vitro para células epiteliales alveolares de tipo II en numerosos estudios toxicológicos. Las células se caracterizan por cuerpos lamelares, la producción de surfactante y una serie de factores relevantes para la inflamación18. También muestran propiedades de las células epiteliales bronquiales debido a su producción de moco19. Además, se pueden cultivar en la ALI. Aunque esta línea celular es deficiente en la construcción de contactos de células celulares, el cultivo de estas células es mucho más conveniente, menos costoso costo y los resultados derivados de las mismas son independientes del donante en comparación con las células primarias20.

Las células A549 fueron sembradas en insertos de cultivo celular de 6 polos (membrana PET, 4,67 cm2,tamaño de poro 0,4 mm) con una densidad de 3,0 x 105 células por inserto y se cultivaron durante 24 h en condiciones sumergidas. Las células fueron expuestas en tres laboratorios independientes para limpiar el aire y tres dosis de exposición diferentes (25, 50 y 100 g/cm2) de 20 sustancias de ensayo en la ALI. La dosis de exposición se correlaciona con el tiempo de deposición, lo que da como resultado una velocidad de partícula constante de 25 g/cm2, 50 g/cm2 y 100 g/cm2 en las células después de 15, 30 o 60 min, respectivamente. Las partículas depositadas, sin embargo, no fueron lavadas después de la deposición, sino que permanecieron en las células durante 24 h. Los tiempos de deposición de las partículas eran por lo tanto 15, 30 y 60 min, pero la exposición de las células duró 24 h en total. La tasa de deposición de las sustancias de ensayo se determinó en experimentos preliminares de acuerdo con los métodos anteriores17.

La viabilidad celular como indicador de toxicidad se evaluó 24 horas después de la deposición de partículas utilizando un ensayo de viabilidad celular. Se centró especial mente en la calidad de los controles de aire limpio, la optimización y el refinamiento del protocolo de exposición, la reproducibilidad intra e interlaboratorio y el establecimiento de un modelo de predicción (PM). Sustancias que llevaron a una disminución de la viabilidad celular por debajo del 50% (PM 50%) o 75% (PM 75%) en cualquiera de las tres dosis de exposición se consideró que ejercen un riesgo agudo de inhalación. Los resultados se compararon entonces con los datos in vivo existentes (basados en al menos un estudio fiable según la directriz de ensayo de la OCDE (TG) 403 o TG 43621,22), lo que llevó a una concordancia global del 85%, con una especificidad del 83% y una sensibilidad del 88%23.

Además de la medición de la viabilidad celular, se pueden evaluar otros puntos finales como la liberación de citoquinas, el examen del lisado celular o la integridad de la membrana a través del ensayo LDH, pero no fueron necesarios para el estudio de validación. Así, el sistema de exposición (por ejemplo, CULTEX RFS) se demostró como un sistema de cribado predictivo para la evaluación cualitativa de la toxicidad aguda por inhalación de las partículas transmitidas por el aire probadas, lo que representa un método alternativo prometedor a las pruebas en animales. El siguiente protocolo se recomienda para experimentos de exposición a partículas en el aire utilizando este sistema de exposición.

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Protocol

NOTA: El protocolo de un experimento de exposición abarca un período de tres días.

Día 1

1. Preparaciones generales y cultivo de células

NOTA: La línea celular epitelial del adenocarcinoma pulmonar humano A549 se utilizó para experimentos de exposición. Las células deben manipularse en condiciones estériles. Se pueden utilizar otras líneas celulares aptas para el cultivo en la ALI.

  1. Preparar el medio de crecimiento (Medio Esencial Mínimo (DMEM) de Dulbecco, complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 5 g/mL de gentamicina) y el medio de exposición (DMEM, complementado con 5 g/ml de gentamicina y una concentración final de HEPES de 100 mM).
  2. Cultivo de células A549 en medio de crecimiento a 37oC en una atmósfera humidificada que contiene 5%CO2.
  3. Cultivar células en matraz de cultivo celular de 75 cm2 (T-75) en 14 ml de medio de crecimiento hasta una confluencia de 80-90% antes de dividir (cada 2-3 días) y un paso de 35.
  4. Calcule el volumen de suspensión y el número necesario de plaquitas de cultivo celular (tres inserciones de cultivo celular como controles de incubadora e inserciones de cultivo celular para la exposición de aire limpio y partículas) y placas de cultivo celular.
  5. Antes de la tripinización y la sembración de células, agregue 2,5 ml de medio de crecimiento templado a cada pocal de una placa de 6 pocillos. Coloque las inserciones de cultivo celular sin celdas cuidadosamente dentro de los pozos y agregue un medio de crecimiento de 1 ml a cada plaquita de cultivo celular. Incubar las placas de 6 pocillos durante al menos 30 minutos en la incubadora (37 oC, 5% CO2).

2. La trippsinización de células

  1. Solución salina tensionada con fosfato templado (PBS) y medio de crecimiento a 37oC y la trippsina/EDTA (0,05%/ 0.02%) solución a temperatura ambiente.
  2. Aspirar el medio de cultivo celular del matraz de cultivo celular y lavar las células cuidadosamente con 8 ml de PBS precalentado.
  3. Retire el PBS, agregue 2 mL de la trippsina/EDTA (0,05%/ 0.02%) solución a las células e incubar durante un máximo de 6 min. en la incubadora a 37oC. Controle el proceso de desprendimiento bajo el microscopio.
  4. Neutraliza la actividad de la trippsina añadiendo un medio de crecimiento precalentado de 8 ml, separa las células tocando suavemente hacia los lados en el matraz y resuspende las células pipeteando repetidamente hacia arriba y hacia abajo.
  5. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 ml. Determinar el número de celda para el procedimiento adicional (por ejemplo, la sembración de células, el paso de las células).

3. Determinación del número de celda

NOTA: La concentración celular se determinó utilizando un contador de células o cámaras de conteo.

  1. Diluir 100 l de la suspensión del cultivo celular en una taza llena de 10 ml de solución isotónica. Incline la copa lentamente sin temblar.
  2. Determine el número de celdas viables/ml y la viabilidad de las células en función de los parámetros de medición específicos de la celda de las células A549.

4. Sembrado de células en membranas microporosas en inserciones de cultivo celular

NOTA: El sistema de exposición está equipado con adaptadores especiales para permitir el uso de plaquitas comerciales de diferentes proveedores y de diferentes tamaños. Para estos experimentos de exposición, se utilizaron placas de 6 pocillos y las inserciones de cultivo celular correspondientes. Todos los pasos de trabajo deben realizarse en condiciones estériles.

  1. Proporcionar medio de crecimiento precalentado bajo condiciones de cultivo celular estéril (flujo laminar).
  2. Preparar un volumen suficientemente alto de la suspensión celular con una concentración celular de 3,0 x 105 células/ml.
  3. Después de templar las placas durante 30 min, aspirar el medio dentro de las inserciones de cultivo celular y semilla 1 mL de células A549 con una densidad de 3.0 x 105 celdas/ml en cada inserción de cultivo celular. Distribuya la suspensión celular balanceando suavemente.
  4. Incubar las inserciones de cultivo celular con la suspensión celular durante 24 h (37 oC y 5% CO2).

5. Prensado de sustancias de ensayo

NOTA: Las sustancias de ensayo se prensaron en tortas en polvo utilizando una prensa hidráulica totalmente controlable. El paquete de prensa puede aplicar una fuerza máxima de 18 kN, que se muestra como la presión de aceite actual (en la barra) del paquete de prensa. Las condiciones de prensa (presión de prensado, tiempo de prensado) de sustancias de ensayo desconocidas deben establecerse y caracterizarse en pruebas preliminares. Dependiendo de las propiedades de prensa de una sustancia, se pueden utilizar diferentes parámetros de prensado y tipos de émbolo de prensado.

ADVERTENCIA: Use equipo de protección cuando presione sustancias tóxicas o peligrosas.

  1. Ajuste el tiempo de prensado a través del control de tiempo en la parte frontal de la prensa.
  2. Abra el suministro de aire comprimido en la válvula de aire comprimido. Ajuste la presión de aire comprimido a aproximadamente 2 bar (indicado por un manómetro en la parte frontal) utilizando el regulador de presión en la parte delantera de la prensa o en la válvula de aire comprimido del suministro de aire comprimido. Tire del cajón, pulse el botón Pulse y lea la presión de presión en el interruptor de presión digital.
    1. Lea solo la presión en el regulador de presión si la presión es demasiado alta o demasiado baja.
  3. Montar el recipiente de la sustancia y asegurarse de que el cilindro de vidrio está correctamente centrado(Figura suplementaria 1). Llene el recipiente de la sustancia con una pequeña cantidad de la sustancia de ensayo. Inserte el émbolo en el recipiente de sustancias y gírelo ligeramente hacia atrás y hacia atrás para distribuir uniformemente el polvo en el recipiente.
  4. Coloque el recipiente de sustancias con el émbolo en el cajón y pulse el botón Prensa. El pistón hidráulico de la prensa se mueve sobre el émbolo y ejerce una presión sobre la sustancia de ensayo durante el tiempo de prensado establecido. Abra el cajón y retire el émbolo.
  5. Repita los pasos 5.3 y 5.4 hasta que el recipiente de sustancias esté al menos medio lleno.
  6. Después de completar el trabajo de prensado, retire el recipiente de sustancias del cajón y gírelo al revés para eliminar las partículas sueltas y depositadas.
  7. Si el envase de la sustancia no es necesario al mismo día, cierre el recipiente de la sustancia con parafilm para evitar que la sustancia de ensayo se seque o absorba la humedad.

Día 2

6. Montaje del sistema de exposición y conexión del equipo periférico

NOTA: Se proporciona una vista más detallada en la Figura 3, La Figura Suplementaria 2 y la Figura Suplementaria 3. Montar ambos módulos y el generador de aerosoles de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

  1. Coloque el sistema de exposición sobre una superficie sólida y uniforme, con el suministro de agua mirando hacia adelante. Conecte los controladores de flujo de masa con el generador de aerosoles y una botella de tres cuellos conectada al módulo para una exposición al aire limpio.
  2. Conecte el controlador de flujo y la bomba de vacío. Conecte los tubos de los controladores de flujo con el conector del tubo en los accesorios del módulo de guía de aerosoles. Conecte los tubos del otro lado de los controladores de flujo con la bomba de vacío. Asegúrese de que el flujo va desde el módulo a través de los controladores de flujo a la bomba de vacío.
  3. Conecte el baño de agua con el suministro de agua de calefacción. El suministro de agua va desde el baño de agua hasta la entrada de agua en el módulo de guía del aerosol. Conecte la salida de agua del módulo de guía de aerosoles con la entrada de agua del módulo de muestreo. Cierre el círculo con una conexión desde la salida de agua del módulo de muestreo hasta el baño de agua.
  4. Coloque el generador de aerosoles, incluido el elutriador cerca del módulo de exposición, y conecte el exceso de líneas del elutriador y el módulo de exposición y aire limpio con microfiltros grandes, y la succión de las cámaras de exposición con pequeños microfiltros (por ejemplo, filtros desechables). El elutriador sirve como reservorio para la atmósfera de partículas generada y retiene partículas de más de aprox. 7 m, mientras que las partículas más pequeñas se transportan al módulo de exposición.
  5. Conecte el ordenador utilizado para controlar la generación de aerosoles al puerto USB de la tapa del generador de aerosoles a través de un cable USB y la fuente de alimentación al puerto de alimentación. Conecte el enchufe de alimentación de CA de la fuente de alimentación a una toma de corriente (220-240 V).
  6. Conecte las tuberías para el suministro medio y la extracción con dos bombas. En lugar de utilizar una bomba para el suministro medio, el medio también se puede llenar manualmente.

7. Preparación para la exposición al aire limpio y a las partículas

  1. Encienda la bomba de vacío, los controladores de flujo y el baño de agua (37 oC) durante un período de calentamiento de al menos 30 min.
  2. Abra el suministro de aire comprimido. Ajuste los controladores de flujo de masa a 8 L/min para la línea de suministro al generador de aerosoles y a 3 L/min para la línea de suministro a la botella de tres cuellos. Cierre las pestañas de los controladores de flujo de masa.
    NOTA: Estos valores pueden variar en función de las características de la sustancia de ensayo.
  3. Ajuste los controladores de flujo a través del ordenador para regular el flujo del módulo (1,5 L/min) y la aspiración de la cámara (30 ml/min).

8. Prueba de fugas del sistema de flujo radial

NOTA: La comprobación de fugas debe realizarse al vacío y para ambos módulos (exposición y módulo de aire limpio) para garantizar que el módulo se ha vuelto a montar correctamente.

  1. Retire el adaptador de entrada y el reflector de condensado del módulo de guía de aerosoles. Cierre los tres orificios de alimentación en aerosol en el módulo de guía de aerosoles con enchufes y las conexiones de suministro de medios en el módulo de muestreo con solapas ficticias.
  2. Conecte las líneas de vacío sin el filtro con el conector de tubo del módulo de guía de aerosoles. Cierre el módulo utilizando la rueda de mano y mida el valor de los controladores de flujo. Los valores deben disminuir algunos minutos después de cerrar por debajo de 5 mL/min.
  3. Después de la comprobación de impermeabilidad, retire todos los enchufes y aletas ficticias, inserte el adaptador de entrada y el reflector de condensado en el módulo de guía del aerosol y conecte las tuberías para el suministro y la extracción de medios.

9. Generación de aerosoles

  1. Inicie el equipo y el software(Figura complementaria 4). Inicie el software del generador de aerosoles haciendo doble clic en el botón de inicio del generador de aerosoles en el escritorio del ordenador. Aparece una ventana de mensaje y le pregunta si la configuración debe restablecerse o no. Haga clic en Sí si el software se inicia por primera vez ese día. Establezca los valores de Posición de diapositiva y Posición del rascador en los valores predeterminados. Haga clic en No para mantener los valores de Posición de diapositiva y Posición del rascador o la diapositiva no está en la posición inicial.
  2. Atornille un rascador de sustancias en la tubería, que se encuentra en la abertura central de la tapa del generador de aerosol.
    NOTA: Dependiendo de las características de la prensa, se pueden utilizar distintos tipos de rascador de sustancias.
  3. Utilice el botón Modo de homing si el rascador de sustancias no está en la posición más baja.
  4. Coloque el recipiente de la sustancia con el material de ensayo prensado boca abajo sobre el rascador de sustancias. Asegúrese de que el vaso del recipiente de sustancias esté orientado hacia el frente. Asegúrese de que los dos orificios del recipiente de sustancias encajen en los dos pines de la tapa del generador de aerosoles. Coloque la placa de bloqueo en la ranura sobre el recipiente de sustancias y apriete el tornillo negro.
  5. Cambie los valores de Alimentación (0,24 a 20 mm/h) y Rotación (1 a 800 revoluciones/h) a los ajustes deseados. La concentración de partículas se puede modificar aumentando o disminuyendo el valor de alimentación o el caudal de gas portador.
  6. Utilice las flechas hacia abajo para empujar hacia abajo la corredera con el recipiente de sustancias hasta que el rascador de sustancia esté cerca de la sustancia prensada.
  7. Abra el suministro de aire comprimido al generador de aerosoles con un toque del controlador de flujo de masa e inicie la generación de aerosoles haciendo clic en el botón Inicio. Ajuste la velocidad de alimentación a 15-20 mm/h para evitar largos tiempos de espera.
  8. Controle la generación correcta de partículas observando la nube de polvo fino con una pequeña linterna (situada desde abajo detrás del tubo de vidrio del Elutriator). Cambie el valor de Feed back a los ajustes deseados cuando el primer vapor de aerosol alcance continuamente el Elutriator y haga clic en el botón Stop.

10. Experimentos de exposición

  1. Encienda el suministro medio con medio de exposición precalentado y llene los módulos de muestreo hasta que las tuberías descendentes estén cubiertas mientras el módulo está abierto. Utilice la bomba mediana o llene el medio manualmente (25 ml por cámara de exposición individual).
  2. Inserte inserciones de cultivo de celda sin ciegas (inserciones sin celdas) en el módulo de exposición. Bombee el medio de exposición hacia abajo hasta que las tuberías descendentes estén cubiertas con medio y el lado inferior de las plaquitas esté en contacto con el medio.
  3. Encienda el generador de aerosoles, cierre el módulo de exposición y conecte el módulo de exposición a la salida del módulo de exposición del generador de aerosoles. Dé al generador de aerosoles un tiempo de entrega de al menos 20-30 minutos antes de que se inicien las exposiciones para permitir una generación estable de partículas.
  4. Prepare las placas de post-incubación para los controles de la incubadora y las inserciones de cultivo celular expuestas durante el tiempo de entrega. Añadir 1,5 ml de medio de crecimiento por poca y incubar las placas en la incubadora (37oC, 5% CO2).
  5. Después del tiempo de entrega, selle la salida del módulo de exposición del Elutriator con un tapón de goma y retire las plaquitas ciegas. Rellene el medio de exposición (utilizando la bomba o manualmente) hasta que las tuberías descendentes estén cubiertas con medio. Ahora, abra también el suministro de aire comprimido al módulo de aire limpio con el grifo del controlador de flujo de masa (3 L/min)
  6. Retire las inserciones de cultivo celular de las placas de 6 pocillos con la ayuda de una pinza. Vierta el medio de crecimiento cuidadosamente desde las plaquitas de cultivo celular derribando las plaquitas y aspirar y desechar el líquido residual utilizando una pipeta. Coloque las plaquitas en las cámaras de exposición de ambos módulos, la exposición y el módulo de aire limpio.
  7. Cierre los módulos e inicie los experimentos de exposición conectando el módulo de exposición a la salida del módulo de exposición del generador de aerosoles y el módulo de aire limpio al suministro de gas portador simultáneamente.
    NOTA:La concentración de partículas se puede modificar aumentando/disminuyendo el valor de alimentación, el caudal de gas portador o el tiempo de exposición.
  8. Desconecte los módulos de exposición y aire limpio después de completar el experimento y selle la salida del módulo de exposición.
  9. Detenga el suministro de aire comprimido y el generador de aerosoles haciendo clic en el botón Detener.
  10. Abra el módulo de exposición y aire limpio y transfiera las inserciones de cultivo celular a las placas de post-incubación preparadas utilizando una pinza. Incubar las placas de 6 pocillos durante 24 h (37oC, 5%CO2)en la ALI.
    NOTA: Repita los pasos 10.5 -10.10 si se planifican más experimentos de exposición.
  11. Levante las plaquitas de cultivo celular, que se utilizan como controles de incubadora a la ALI en las mismas condiciones que las plaquitas de cultivo celular expuestas e incubandurante durante 24 h (37 oC, 5% CO2)en la ALI.
  12. Utilice el botón Modo de homing para retirar el contenedor de sustancias. Cierre el software del generador de aerosoles haciendo clic en la X en la esquina superior derecha y apague el ordenador.
  13. Después de completar todos los experimentos de exposición, limpie el generador de aerosoles y ambos módulos de exposición. Cierre el recipiente de sustancias con parafilm si la sustancia de ensayo se utilizará en los próximos días.

Día 3

11. Viabilidad celular

NOTA: La viabilidad celular se determinó 24 horas después de la deposición de partículas midiendo la actividad mitocondrial utilizando el ensayo WST-1. El ensayo se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. La viabilidad celular también se puede determinar mediante otras pruebas de viabilidad celular (por ejemplo, XTT).

  1. Temperatura el medio de crecimiento a 37oC y descongela la solución WST-1 protegida de la luz. Preparar un número adecuado de placas nuevas de 6 pocillos con medio de crecimiento de 2,5 ml por pozo e incubar las placas en la incubadora.
  2. Preparar la dilución WST-1 diluyendo una cantidad suficiente de WST-1 1:7 en medio de crecimiento
  3. Inserte las plaquitas de cultivo celular 24 h después de la exposición en las nuevas placas preparadas de 6 pocillos. Agregue 1 ml de la solución WST-1 preparada de forma fresca a cada plaquita de cultivo celular. Mece las placas cuidadosamente para distribuir la solución de forma homogénea en las células. Incubar las placas de 6 pocillos con las plaquitas de cultivo celular durante 1 h (37 oC, 5% CO2).
  4. Transfiera 100 l del sobrenadante en triplicados de cada 6 pocillos a una placa de 96 pocillos. Mida la absorbancia a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 650 nm utilizando un lector de microplacas.

12. Estadísticas

  1. Normalizar la viabilidad celular de los controles de incubadora individualalalal al 100%.
  2. Expresar la viabilidad de las células expuestas en relación con los controles de incubadora individuales. La citotoxicidad de las sustancias de ensayo se comparó con los respectivos controles de la incubadora y se utilizó como indicador de toxicidad.

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Representative Results

El CULTEX RFS es un sistema modular de exposición in vitro especialmente diseñado que permite la exposición directa y homogénea de las células en la ALI. En un estudio previo a la validación anterior, se demostró con éxito la aplicabilidad general de este sistema de exposición y su transferibilidad, estabilidad y reproducibilidad. En un proyecto de investigación reciente financiado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania, el sistema de exposición fue validado y establecido con éxito como un modelo de predicción (PM) para los peligros agudos de inhalación de los compuestos probados. A medida que la calidad de los controles de aire limpio resultó ser un parámetro crítico durante el estudio de prevalidación, al comienzo del estudio de validación se implementaron varias optimizaciones de protocolos y métodos (por ejemplo, cambio de inserciones de cultivo celular, estabilización del pH del medio de exposición aumentando la concentración de HEPES a 100 mM) al comienzo del estudio de validación, lo que dio lugar a resultados altamente estables y reproducibles y una mejora sustancial de los datos de viabilidad del aire limpio en los tres laboratorios(Figura 4). Las células A549 fueron expuestas en la ALI a tres dosis de exposición diferentes (25, 50 y 100 g/cm2) de 20 sustancias de ensayo preseleccionadas y codificadas en los tres laboratorios independientes, y la citotoxicidad (utilizada como indicador de toxicidad) se comparó con los controles de incubación respectivos. Trece sustancias codificadas fueron probadas así en triplicados, siete sustancias codificadas como experimentos individuales. Se consideró que las sustancias de ensayo ejercían un riesgo agudo de inhalación cuando la viabilidad celular disminuyó por debajo del 50% (PM 50%) o 75% (PM 75%).

Como se muestra de manera ejemplar en la Figura 5,la exposición de células A549 a diferentes sustancias de ensayo no presentó toxicidad, media o fuerte. Como todos los experimentos se llevaron a cabo de forma independiente en tres laboratorios, se analizaron datos sobre la reproducibilidad dentro y entre los laboratorios y la previsibilidad del sistema de exposición. Dependiendo de la PM aplicada (PM 50% o PM 75%), el laboratorio y la reproducibilidad entre laboratorios oscilaron entre 90-100%, demostrando la robustez y transferibilidad de este método. Dado que todas las sustancias probadas tenían datos de referencia in vivo pertinentes (basados en al menos un estudio fiable según la OCDE TG 403 o TG 436 utilizando un protocolo tradicional LC50 y un protocolo de concentración x tiempo (C x t), comparación del protocolo in los datos vivo e in vitro revelaron una concordancia global del 85% (17/20) con una especificidad del 83% (10/12) y una sensibilidad del 85% (7/8)(Tabla 1). Sólo dos sustancias fueron clasificadas como falsamente positivas y una falsamente negativa.

En resumen, nuestros resultados del estudio de validación presentan un método de cribado transferible, reproducible y predictivo para la evaluación cualitativa de la citotoxicidad pulmonar aguda de las partículas transmitidas por el aire seleccionadas.

Figure 1
Figura 1: Exposición de células en el ALI o en condiciones sumergidas. Las células A549 pueden exponerse con una sustancia de ensayo (flechas azules y puntos) en la ALI (izquierda) a través de una entrada del sistema de exposición o con la sustancia de ensayo diluida en el medio de exposición (puntos azules) creando condiciones submésas (derecha). Las líneas de puntos rojas representan los niveles de llenado del medio de exposición (rojo brillante) en la configuración experimental respectiva. Esta cifra ha sido modificada de Tsoutsoulopoulos et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: El módulo de exposición. Descripción esquemática del módulo básico del sistema de flujo radial que consiste en el adaptador de entrada, el módulo de guía de aerosol, el módulo de muestreo y zócalo y un módulo de bloqueo con una rueda de mano. Esta cifra ha sido modificada de Aufderheide et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Visión general del sistema de exposición. Los componentes son los dos módulos de exposición para la exposición de aire limpio y partículas, el generador de aerosoles, incluido el elutriador y la unidad de control correspondiente, y las bombas medianas. Esta cifra ha sido modificada de Aufderheide et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Limpie los datos de viabilidad del aire después de la optimización del método de prueba. La exposición de las células al aire limpio no llevó a una disminución de la viabilidad celular con el tiempo, lo que llevó a una mejora sustancial de los datos de viabilidad del aire limpio en comparación con el estudio de prevalidación. Todos los controles de aire limpio se agruparon para cada laboratorio (Laboratorio 1-3) y el tiempo de exposición (n a 46 por laboratorio y punto en el tiempo). Los datos se muestran como diagramas de caja con una línea mediana y el rango indicado por los bigotes. Esta cifra ha sido modificada de Tsoutsoulopoulos et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Exposición de células A549 a diferentes sustancias de ensayo. (A) La exposición de las células A549 al carburo de tungsteno (IV) no mostró disminución de la viabilidad celular para las tres dosis de exposición diferentes y parecía no ser tóxica (n a 3 por dosis de laboratorio y exposición). (B) La exposición de las células al anhydriuro tetrabromoftálico dio lugar a que todos los laboratorios sumaran una toxicidad moderada, lo que presentaba una buena curva de respuesta a la dosis (n a 1 por dosis de laboratorio y exposición). (C) El dimetilditiocarbamato de zinc mostró una fuerte toxicidad, lo que llevó a una disminución de la viabilidad celular ya después de una dosis depositada de 25 g/cm2 (n a 3 por dosis de laboratorio y exposición). Las barras de error representan desviaciones estándar. Esta cifra ha sido modificada de Tsoutsoulopoulos et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados de referencia in vivo Resultados in vitro
Sustancia OCDE TG Regulación CLP Toxicidad PM50% PM75% Según in vivo/ in vitro
Carburo de tungsteno (IV) 403 n. c 0 0 0 Sí
Nano de carburo de tungsteno (IV) - n. c. 0 0 0 Sí
N,N'-etilenobis(N-acetilcetamida) EPA OPPTS 870.1300 n. c. 0 0 0 Sí
Dióxido de silicio 403 n. c. 0 0 0 Sí
Diammonium hydrogenortho-fosfato 403 n. c. 0 0 0 Sí
Fluorofosfato disódico 403 n. c. 0 0 0 Sí
Óxido de neodimio 436 n. c. 0 0 0 Sí
Monopersulfato de hidrógeno potásica 403 n. c. 0 0 0 Sí
Ciclohepta-pentylose 403 n. c. 0 0 0(2x) / 1(1x) (Sí)
Óxido de vanadio (III) 403 n. c. 0 0 0(2x) / 1(1x) (Sí)
Pirofosfato de tetrapotásico 403 n. c. 0 1 1 No
Anhydride tetra-bromoftálico 403 (similar) n. c. 0 1 1 No
Cloruro de cetipridinio 403 Tox agudo. 2 1 1 1 Sí
Sal sódica N-Lauroilsarcosina 403 Tox agudo. 2 1 1 1 Sí
Dimetilditito-carbamato de zinc 403 Tox agudo. 2 1 1 1 Sí
Hidróxido de cobre (II) 403 Tox agudo. 2 1 1 1 Sí
Selenita de zinc 436 Tox agudo. 3 1 1 1 Sí
Metavanato de sodio 403 Tox agudo. 4 1 1 1 Sí
Divanadium pentaóxido 403 Tox agudo. 4 1 1 1 Sí
Telúrico de cadmio 403 Tox agudo. 4 (n. c.) 1 0 0 No
n. c. No clasificado; 0 - no tóxico; 1 - tóxico; CLP - Clasificación, etiquetado y envasado

Tabla 1: Acuerdo entre los resultados in vivo e in vitro. De las 20 sustancias, 10 sustancias se clasificaron como correctamente negativas y siete correctamente como positivas, lo que llevó a una concordancia del 85 % (17/20). Esta tabla ha sido modificada de Tsoutsoulopoulos et al.23. (Prueba No 403: Toxicidad aguda por inhalación, prueba No 436: Toxicidad aguda por inhalación - Método de clase tóxica aguda; Tox agudo. 2o fatal, Tox agudo. 3o tóxico, tóxico tóxico. 4o nocivo).

Supplementary Figure 1
Figura suplementaria 1: Montaje del contenedor de sustancias. Imagen tomada de CULTEX DG (Dust Generator) Manual de usuario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 2
Figura suplementaria 2: Módulo guía de Aerosol del sistema de exposición. A) Vista superior y B) vista inferior del módulo de guía de aerosoles. Imagen tomada del Manual de usuario de CULTEX RFS (Sistema de flujo radial). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 3
Figura suplementaria 3: El generador de aerosoles. A) Visión esquemática del generador de aerosoles, que consiste en la tapa del generador de aerosoles y el Elutriator. Vista detallada de B) la tapa del generador de aerosoles y C) el Elutriator. Imagen tomada de CULTEX DG (Dust Generator) Manual de usuario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplementary Figure 4
Figura suplementaria 4: El software de control del generador de aerosoles. Imagen tomada de CULTEX DG (Dust Generator) Manual de usuario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En los últimos años se han desarrollado muchos modelos de pruebas de toxicidad por inhalación no animal con el fin de obtener información sobre el riesgo agudo de inhalación de partículas inhalables y para reducir y sustituir los experimentos con animales de acuerdo con el principio 3R25.

En términos de modelos de cultivo celular, la exposición de células se puede hacer en condiciones sumergidas o en la ALI. La exposición de células en condiciones sumergidas puede afectar a las propiedades fisicoquímicas y, por lo tanto, a las propiedades tóxicas de una sustancia de ensayo12. Sin embargo, los modelos de inhalación de ALI in vitro imitan la situación de exposición humana con mayor similitud biológica y fisiológica que la exposición sumergida y, por lo tanto, son más adecuados para analizar la toxicidad aguda por inhalación de partículas en el aire. La importancia del CULTEX RFS con respecto a otros módulos de exposición existentes no es sólo la exposición de células en condiciones de ALI, sino también la distribución y deposición muy homogénea de partículas. A diferencia de los modelos de exposición secuencial con guía lineal de aerosoles, el diseño modular de este método de exposición permite una línea de suministro radial que conduce a una deposición muy homogénea de partículas en las células17.

El punto más importante para experimentos de exposición exitosos es la calidad estable y congruente de los controles de aire limpio. Se debe prestar especial atención a que la viabilidad de los controles de aire limpio no se vea afectada con el tiempo y lo más cerca posible al 100% en comparación con los controles de incubadora correspondientes. Los factores que desempeñan un papel importante con respecto a la viabilidad del aire limpio son la elección de inserciones de cultivo celular adecuadas, el valor de pH del medio de exposición y la composición del aire limpio. En términos de inserciones de cultivo celular, se debe garantizar una buena calidad y una alta densidad de poros. Esto garantiza un mejor suministro medio y una mayor humedad relativa dentro de las inserciones de cultivo celular, protegiendo las células de la desecación26. Mediante el uso de plaquitas de cultivo celular con aberturas laterales de la pared, se deben utilizar manguitos de plaquita especiales para evitar la fuga de partículas de prueba a través de las aberturas de la pared lateral que podrían conducir a una posible contaminación del medio de exposición. Un desplazamiento del valor de pH superior a 8 ya puede tener un efecto tóxico en las células y, por lo tanto, conducir a un deterioro de la viabilidad celular27. Esto ocurre especialmente en tiempos prolongados de deposición de partículas (por ejemplo, 60 min) si el aire limpio contiene menos del 5% deCO2 o la concentración de HEPES del medio de exposición es demasiado baja, lo que debe evitarse.

Una cuestión crítica del protocolo es el prensado de las sustancias de ensayo. Las sustancias de ensayo deben estar suficientemente comprimidas en una torta de polvo dentro del recipiente de sustancias para permitir una exposición estable a las partículas. Por lo tanto, las sustancias deben caracterizarse en experimentos preliminares con respecto a sus propiedades de prensa y con el fin de obtener información sobre qué émbolo de prensa, tipo de hoja de raspado o velocidades de alimentación tienen que ser utilizados.

La presión máxima de prensado de la prensa hidráulica, sin embargo, es de 10 kN, que representa al mismo tiempo el límite de carga para el cilindro de vidrio y, por lo tanto, una limitación del proceso de prensado. El recipiente de sustancias no puede soportar fuerzas de prensado más altas que 10 kN. Una mayor fuerza de prensado podría ofrecer el prensado de sustancias cristalinas y, por lo tanto, ampliar la aplicabilidad de esta prensa, pero requeriría contenedores de sustancias más robustos.

Además, este sistema de exposición, diseñado principalmente para la investigación de exposiciones a partículas en el aire, puede adaptarse a la exposición de aerosoles líquidos y gases altamente tóxicos y agresivos dependiendo del método de generación de aerosoles y del material de los módulos de exposición. El intercambio del generador de aerosoles por un nebulizador de membrana y el uso de un módulo de exposición de acero inoxidable permitió la exposición de las células a aerosoles líquidos altamente tóxicos24.

Otro problema crítico es el efecto de sobrecarga. La viabilidad celular puede verse afectada no sólo por las propiedades toxicológicas de una sustancia de ensayo, sino también por la cantidad de una sustancia depositada en las células. Este sistema de exposición muestra de hecho una similitud sustancial con las condiciones fisiológicas en la región alveolar humana, pero no contiene ningún mecanismo de aclaramiento para eliminar partículas. Por lo tanto, es muy importante que la viabilidad celular no se vea afectada debido a un número demasiado grande de partículas.

El protocolo aquí describe la exposición homogénea de las células pulmonares humanas cultivadas en la ALI a las partículas en el aire. La reproducibilidad, su robustez y transferibilidad hacen que el sistema de exposición actual sea aplicable como método de cribado in vitro para la evaluación cualitativa de partículas inhalables en relación con su toxicidad aguda por inhalación. Debido a que no se han validado suficientemente métodos in vitro alternativos hasta el momento, la toxicidad pulmonar aguda todavía se está evaluando mediante la exposición de animales (por ejemplo, cámaras de todo el cuerpo, nariz o métodos de boca solamente). Todas las directrices de ensayo comúnmente aceptadas de la OCDE para la toxicidad aguda por inhalación (por ejemplo, TG 403, TG 433 y TG 436) se basan en modelos animales en los presentes21,22,28,29. Por lo tanto, una orientación futura será solicitar en la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) la aceptación como guía de ensayo in vitro para la toxicidad aguda por inhalación.

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Disclosures

Los autores AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT y DS no tienen nada que revelar. La empresa Cultex Technology GmbH (anteriormente Cultex Laboratories GmbH) produce instrumentos (por ejemplo, CULTEX RFS, CULTEX DG) utilizados en este artículo. NM fue empleado de Cultex Laboratories GmbH durante este estudio. OK es un empleado de Cultex Technology GmbH (anteriormente Cultex Laboratories GmbH). La patente PCT/EP2009/007054 para el dispositivo está en poder del fundador de Cultex Technology GmbH Prof. Dr. Ulrich Mohr (anteriormente Cultex Laboratories GmbH).

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (Bundesministerium f'r Bildung und Forschung, BMBF, Alemania (Grant 031A581, subproyecto A-D)) y por la Fundación Alemana de Investigación (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Grupo de Formación en Investigación GRK 2338).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
A549 ATCC CCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEM Biochrom, Berlin, Germany FG 0415 used as growth medium
DMEM Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany 22320 used as exposure medium
FBS superior Biochrom, Berlin, Germany S 0615
Gentamycin (10mg/mL) Biochrom, Berlin, Germany A 2710
HEPES 1M Th. Geyer, Renningen, Germany L 0180
PBS Biochrom, Berlin, Germany L 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) Biochrom, Berlin, Germany L 2143
Cell culture material
CASY Cups Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany REF 05651794
Cell culture plates Corning, Wiesbaden, Germany 3516 6­-well plates
Corning Transwell cell culture inserts Corning, Wiesbaden, Germany 3450 24mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYton Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany REF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021) Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany 2290152
WST-1 Abcam, Cambridge, United Kingdom ab155902
Instruments + equipment
CASY Cell Counter Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostat LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany Ecoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic Press Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeve Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large) Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany LP-050 Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small) Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany 9933-05-DQ Balston disposable filter
Medium pump Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser digital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 Pro Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pump KNF, Freiburg, Germany N86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min TrigasFI GmbH Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water Bath LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany Ecoline Staredition RE 104

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References

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Medicina Número 156 Toxicidad pulmonar aguda in vitro sistema de exposición interfaz aire-líquido validación citotoxicidad partículas en el aire
Evaluación de la toxicidad aguda por inhalación de partículas transmitidas por el aire mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido
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Tsoutsoulopoulos, A., Gohlsch, K., Möhle, N., Breit, A., Hoffmann, S., Krischenowski, O., Mückter, H., Gudermann, T., Thiermann, H., Aufderheide, M., Steinritz, D. Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface. J. Vis. Exp. (156), e60572, doi:10.3791/60572 (2020).

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