Summary
I denne artikkelen beskriver vi en detaljert protokoll for effektiv modellering av Duchenne muskeldystrofi muskel ved hjelp av MYOD1-konverterturin-avledede celler for å evaluere restaureringen av dystrophin mRNA og proteinnivåer etter exon skipping.
Abstract
Duchenne muskeldystrofi (DMD), en progressiv og dødelig muskelsykdom, er forårsaket av mutasjoner i DMD genet som resulterer i fravær av dystrophin protein. Hittil har vi fullført en undersøkelse-initiert første-i-menneskelig studie ved National Center of Neurology and Psychiatry basert på systemisk injeksjon av morpholino oligonucleotides som er utsatt for exon-53 hoppe. For effektiv behandling av DMD, in vitro testing med myoblaster avledet fra DMD pasienter å screene legemidler og vurdere pasient kvalifisering før gjennomføre kliniske studier antas å være avgjørende. Nylig rapporterte vi en ny MYOD1-konverterturinavledet celle (UDC) behandlet med histonemetyltransferasehemmeren (3-deazaneplanocin A hydrochloride), som en cellulær modell av DMD. Den nye autologen UDC kan vise fenokopi av de sykdomsspesifikke fenotypene til DMD, noe som fører til anvendelse av presisjonsmedisin i en rekke muskelrelaterte sykdommer. I denne artikkelen beskriver vi en detaljert protokoll for effektiv modellering av DMD muskelceller ved hjelp av MYOD1-konverterteUDCer sammen med omvendt transkripsjonase polymerase kjedereaksjon (RT-PCR), vestlig blotting og immuncytokjemi for å evaluere restaureringen av dystrophin mRNA og proteinnivåer etter exon skipping.
Introduction
Duchenne muskeldystrofi (DMD), en progressiv, dødelig muskelsykdom, er forårsaket av rammeskiftmutasjoner i DMD-genet som resulterer i fravær av dystrophinprotein1. Antisense oligonucleotide-basert exon hoppe terapi antas å være lovende for DMD. Denne terapien er basert på konvertering av den alvorlige DMD fenotypen til mildere Becker muskeldystrofi-lignende fenotype ved å endre pre-mRNA spleising for å gjenopprette DMD leseramme2. Vi har nylig fullført en første-i-menneskelig studie basert på gjentatt intravenøs administrering av fosforamidat morfogiolino oligomer (PMO) viltolarsen, som kan indusere exon 53 hoppe i DMD, og demonstrert en utmerket sikkerhetsprofil, lovende effekt, og akseptable farmakokinetiske parametere (registrert som UMIN: 000010964 og ClinicalTrials.gov: NCT020816253).
Men for å utvikle kostnadseffektive og effektive behandlinger for sykdommen, in vitro tester ved hjelp av primære muskelceller hentet fra DMD pasienter er avgjørende for narkotika screening og pasient kvalifisering verifisering før gjennomføre kliniske studier, samt biomarkører som gjenspeiler effekten av exon hoppe terapi under menneskelige studier4. Svært nylig rapporterte vi en ny teknologi for å utvikle pasientspesifikke MYOD1-konverterteurinavledede celler (UDCer)5,,6 som en primær myoblastmodell av DMD7. Dermed, for å generere myoblaster, er det bare nødvendig med innsamling av urin fra pasienter og ingen invasiv prosedyre er nødvendig. I denne artikkelen beskriver vi en detaljert protokoll for effektiv modellering av DMD-muskel ved hjelp av MYOD1-konverterteUDCer behandlet med 3-deazaneplanocin En hydroklorid for å evaluere den restaurerte dystrophin mRNA og protein etter exon skipping.
Protocol
Etikkutvalget for Nasjonalt senter for nevrologi og psykiatri godkjente denne studien (godkjennings-ID: A2017-018, A2018-029). Alle personer ga informert samtykke før de ga urin. Alle eksperimenter ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter.
1. Isolasjon og primærkultur av UDCer
MERK: UDCer ble isolert i henhold til en tidligere publisert protokoll8,9,10 med noen modifikasjoner.
- Samle urinprøver under spontan micturition i steriliserte plastflasker.
MERK: Sterilisering av den ytre urinrøret er ikke nødvendig. Midtstrøms urin er ønskelig å redusere risikoen for virusforurensning. Hvis lagertiden før neste prosedyre er > 1 h, bør urinprøver overføres til 4 °C for å bevare cellelevedyktigheten. En temperatur på <4 °C bør imidlertid unngås fordi uoppløselige utfellinger kan oppstå. - Sentrifuger hele urinprøven ved 400 x g i 10 min ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten, og la 1 ml i røret.
- Resuspendpellets individuelt i de resterende 1 ml urin og samle deretter de i en enkelt 50 ml rør.
- Tilsett 10 ml vaskebuffer bestående av 99 ml PBS uten kalsium og magnesium, 1% penicillin/streptomycin (P/S), 0,5 μg/ml amfotericin B og sentrifuge prøvene ved 200 x g i 10 min ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten, og la 0,2 ml i røret.
- Resuspender cellepellets i 4,5 ml primærmedium bestående av en 1:1 blanding av høy glukose Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM)uten natriumpyruvat og Hams F-12 næringsblanding supplert med rekombinant human epidermal vekstfaktor (EGF), insulin, hydrokortison, adrenalin, T3, transferrin, 10% tetracyklinfritt fosterbovinserum (FBS), 1 % P/S og 0,5 μg/ml amfotericin B.
- Frø cellene i tre brønner av gelatinbelagte seks brønnplater (totalt volum av hver brønn, 1,5 ml). Kultur fuktet ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
- Tilsett 1,5 ml primærmedium daglig de neste 3 dagene.
- På dag 4, erstatte mediet med 1,5 ml vekst medium supplert med rekombinant humane EGF, insulin, hydrokortison, adrenalin, T3, transferrin, 15% tetracyklinfri FBS, 0,5% L-alanin-L-glutamin, 0,5% ikke-essensielle aminosyrer, og 2,5 ng/ml fibroblastvekstfaktor-grunnleggende (bFGF), rekombinant human blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF), EGF og 1% P/S.
- Endre vekstmediet annenhver dag.
MERK: UDC-kolonier vises innen en uke. - Når UDC-kulturen blir 80−90% konfluent, fjern mellomstore og vask celler med PBS, del alle cellene ved hjelp av 0,25% trypsin-EDTA og frø på 3000-5000 celler /cm2 på en ny gelatinbelagt 60 mm tallerken (passasje 1).
MERK: UDCene kan lagres i flytende nitrogen. UDCs er vanligvis delt på 60−70% samløpet i 60 mm kulturrett i tre lagerrør.
2. Retroviral konstruksjon
- Forsterke kodeområdet til MYOD1 (NM_002478.4) plasmid ved polymerasekjedereaksjon (PCR).
MERK: Blandingen for MYOD1 forsterkning og forhold for termisk cycler er vist i tabell 1 og tabell 2,henholdsvis. - Oppdag et enkelt bånd på ca. 1000 bp-størrelse med 0,7 % agarosegelelektroforese ved hjelp av 1 μL av det forsterkede PCR-produktet for å bekrefte at MYOD1-sekvensen forsterkes med hell.
- Rengjør PCR-produktet ved hjelp av opprydningssettet og bestem konsentrasjonen med et spektrotometer.
- Inkuber blandingen som vist i tabell 3 ved 37 °C over natten for å fordøye retroviral vektor med et Tet-on-system og puromycinresistent gen ved begrensning enzymmålrettede regioner i flere kloningssted.
- Oppdag et enkelt bånd med 0,7% agarose gelelektroforese ved hjelp av 1 μL av det fordøyde produktet for å bekrefte at retroviral vektor ble fordøyd med hell.
- Rengjør det fordøyde produktet ved hjelp av opprydningssett og bestem konsentrasjonen med spektrotometer.
- Hvis du vil klone det forsterkede MYOD1-fragmentet (produsert av trinn 2.1–2.3) i den fordøyde retrovirale vektoren (produsert av trinn 2,4−2.6), utfører du en sammenblandingsreaksjon. Sett opp reaksjonen som vist i tabell 4, inkuber reaksjonen i 15 min ved 50 °C, og legg deretter på is.
- Utfør transformasjon ved hjelp av E. coli kompetente celler i henhold til produsentens instruksjoner (Materialtabellen).
- Velg de transformerte kompetente cellene ved å pkulere på en LB kulturplate bestående av 10 g / L bacto tryptone, 5 g / L bacto gjær ekstrakt, 5 g / L NaCl, 15 g / L bacto agar, og 50 mg / L ampicillin.
- Plukk opp den valgte kolonien og kulturen i LB kultur medium uten bacto agar på 200 rpm ved 37 ° C over natten.
- Rens myod1-innsatteretrovirale vektorer ved hjelp av et plasmid rensesett (Materialtabellen) og kvantifiser ved hjelp av et spektrotometer.
- Kontroller at MYOD1 er riktig satt inn i den retrovirale vektoren ved direkte sekvensering av PCR-produktet forsterket av forover- og reversprimere rettet henholdsvis på begge sider over den innsatte MYOD1-sekvensen.
MERK: MYOD1-sekvensen kan oppdages klemt mellom retrovirale vektorsekvenser når kloning i fusjon er vellykket. - For retroviral produksjon, frø emballasjecellene på 50.000 celler / cm2 på 10 cm kollagenbelagte plater og kultur i DMEM med 10% FBS fuktet ved 37 °C og 5% CO2 for 24 timer.
- Når emballasjecellene sprer seg til 80 % samløpet, bland 30 μg MYOD1-innsatte retrovirale vektorer, 30 μg emballasjevektorer og transfeksjonreagenssom inneholder cellegjennomtrengende peptid (Materialbord) ved å virvle og inkubere dem i 10 min.
- Tilsett den inkuberte blandingen til mediet av emballasjeceller og kultur fuktet ved 37 °C og 5 % CO2.
MERK: Kollagenbelegg er nødvendig. Transfection kan være bedre på 24 timer eller mer etter seeding fordi emballasjeceller lett løsne fra kulturplaten. - Etter 4 timer eller over natten, endre mediet til frisk vekst medium.
- Samle viral supernatant og erstatte med friskt medium på 24 og 48 timer etter cotransfection og kombinere supernatant.
- For å konsentrere den virale supernatanten, bland den med konsentratorreagen simere og inkuber ved 37 °C over natten, deretter sentrifuge ved 1500 x g i 45 min ved 4 °C.
- Filtrer retrovirussupernatanten gjennom et PVDF-filter med 0,45 μm porer.
- Kontroller titeren til den retrovirale vektoren ved hjelp av et kvantitativt PCR-sett og termisk syklussystem i henhold til produsentens instruksjoner.
- Del viral supernatant i små aliquots og lager dem på -80 °C.
3. Infeksjon med MYOD1-retroviral vektor i UDCer
- Frø UDCene på 3000-5000 celler / cm2 på en gelatinbelagt 60 mm tallerken.
- Etter 24 timer såing, sidet tint retrovirus (trinn 2,21) ved et mangfold av infeksjon på 200 ved å legge hexadimethrine bromid i en konsentrasjon på 8 μg/ml.
- Etter en 24 h inkubasjon fuktet ved 37 °C og 5% CO2,erstatt kulturmediet med frisk vekstmedium som inneholder 1 μg/ml puromycin for å velge MYOD1-transducedceller. Endre mediet annenhver dag.
MERK: Når du velger for MYOD1-positive celler, brukes vanligvis 1 μg/ml puromycin til valg. Den riktige dosen bør bestemmes. Bruk en plate som inneholder utransinfiserte celler, og velg dosen som dreper alle cellene i 3-5 dager. MYOD1-positive celler bør velges innen 7-10 dager etter at du har lagt puromycin til. MYOD1-transducedUDCer kan lagres i flytende nitrogen.
4. Myogenisk differensiering av MYOD1-transducerteUDCer behandlet med 3-deazaneplanocin A hydrochloride (DZNep)
MERK: Nylig har det blitt rapportert at DZNep, en histone metyltransferasehemmer, kan betydelig fremme uttrykket av MYOGENIN, en av de sene muskelregulatoriske faktorene, og også føre til myotube differensiering7.
- Plate MYOD1-transduced UDCs i kollagenbelagte brønner med en tetthet på 3,5 x 104 celler / cm2. Kultur fuktet ved 37 °C og 5 % CO2.
- Etter 24 timer, endre vekstmedium til differensiering medium består av høy glukose DMEM med L-alanin-L-glutamin, 5% hest serum, ITS supplement, 1 μg / ml doxycycline, og 5 μM DZNep.
MERK: 10 mM DZNep-oppløsningen kan oppbevares ved -80 °C i 3 måneder. Bruk en avrimingsfryser og unngå gjentatte fryse-tine sykluser. Både MYOD1 aktivert av doxycycline og DZNep undertrykke spredning og fremme den myogene differensiering av UDCer. Derfor anbefales det at doxycyklin og DZNep legges til etter induksjon av myogen differensiering. DZNep fremmer myogendifferensiering av MYOD1-UDCer på en doseavhengig måte. På den annen side viser det cytotoksisitet ved høy konsentrasjon. Derfor bestemme riktig konsentrasjon av DZNep, alt fra 1-10 μM avhengig av dens effekter på myogendifferensiering og cellulær biotilgjengelighet. - Etter 3 dager, endre differensiering simering medium til frisk differensiering medium uten DZNep. Deretter endrer du mediet hver 3.
MERK: UDCer smelter til hverandre og danner myotube-er innen 1–2 uker etter differensiering.
5. Exon hopper i MYOD1-konverterteUDCer
MERK: Her er tre protokoller beskrevet for å evaluere exon hoppe i pasientavledede celler: 1) omvendt transkripsjonase polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) av dystrophin mRNA; 2) semiquantification av restaurert dystrophin protein signal av vestlig blot; og 3) semiquantification av restaurert dystrophin fluorescens signal av immunocytochemistry. Alle metodene kan oppdage exon hoppe på en doseavhengig måte.
- Evaluering av exon hoppe effektivitet av RT-PCR
- For å transfect antisense oligonucleotide (ASO) til MYOD1-konverterteUDCer hentet fra DMD-pasienter på dag 7 etter differensiering, bland ASO, transfection reagens (Materialtabell) og differensieringsmedium til en endelig konsentrasjon på 1-10 μM. Kultur fuktet ved 37 °C og 5 % CO2.
- Etter 72 timer inkubasjon med ASO, endre mediet til frisk differensieringsmedium uten ASO.
- Fra 3–7 dager etter ASO-transfection, fjern differensieringsmedium og vask 1x med PBS. Legg til cellelysisbuffer, lyse UDCene og høst den totale RNA ved hjelp av et RNA-ekstraksjonssett.
- Mål RNA-konsentrasjonen med et spektrotometer.
- Kombiner de nødvendige reagensene for etttrinns RT-PCR-reaksjon i PCR-rør i henhold til tabell 5.
- Plasser PCR-rørene med blandingen i en termocycler. Kjør termocycleren, i henhold til tabell 6.
- Utfør mikrobrikkeelektroforese og beregn exon hoppe effektivitet ved hjelp av molar konsentrasjon som nedenfor.
Exon hopper over effektivitet (%) = hoppet over bandet / (hoppet over bandet + ikke-hoppet bånd) x 100
MERK: Oppbevar PCR-produktet i kjøleskap ved 4 °C for korttidslagring eller -20 °C for langtidslagring.
- Påvisning av dystrophin etter exon hoppe av vestlig blotting
- Transfect ASO og kultur MYOD1-UDCs i henhold til trinn 5.1.1 og 5.1.2.
- Bytt mediet hver 3.
- Etter 2 uker med differensiering, trekk ut det totale proteinet fra de kultiverte cellene ved hjelp av radioimmunoprecipitationanalyse (RIPA) buffer som inneholder proteasehemmere.
- Sonicate lysates på is og sentrifuge på 14.000 x g i 15 min ved 4 °C.
- Samle supernatant og bestemme proteinkonsentrasjoner ved hjelp av en BCA protein analyse kit.
- Tilsett 15 μg totalt protein i et 0,5 ml rør og fortynn ved å legge til RIPA-bufferen som inneholder proteasehemmere til et totalt volum på 10 μL. Kjør 15 μg totalt protein per kjørefelt.
- Legg til prøvebuffer, reduksjonsmiddel og deionisert vann som vist i tabell 7. Denature cellen lysates ved 70 °C i 10 min.
- Klargjør tris-acetat løpebufferen som inneholder 8,95 g/l tricine, 6,06 g/l tris base, 1,0 g/L natriumdodecylsulfat (SDS).
- Last prøven (20 μL) på tris-acetat 3-8% gel og utfør elektroforese ved 150 V i 75 min.
- Forbered blottingbufferen uten metanol.
- Bløtlegg PVDF membranen i 20 s i metanol og deretter i blotting buffer til bruk (minst 10 min). Skjær PVDF membranen til en størrelse på 6 x 8 cm ved hjelp av mini geler og 8 x 12 cm ved hjelp av midi geler.
- Klipp blotting papirene til samme størrelse som pvdf membran og suge de i blotting buffer til bruk.
- Etter elektroforese, kutt gelen til samme størrelse som PVDF membranen og suge gelen i destillert vann.
- Plasser blottingpapirene, PVDF-membranen og gelen på det semitørre overføringsapparatet (Figur 1). Overfør ved 4 mA/cm2 i 30 min.
- Skyll membranen 2x med destillert vann.
- Forbered anti-dystrophin (1:500) og anti-α-tubulin (1:1,200) antistoff som de primære antistoffene.
- Forbered HRP-konjugert antistoff mot mus (1:100) som et sekundært antistoff.
- Inkuber membranene med de primære antistoffene, vask med vaskebuffer, og inkuber deretter det sekundære antistoffet ved hjelp av en automatisert vestlig behandlingsenhet (Materialbordet) ved romtemperatur.
MERK: Anti-α-tubulin antistoff brukes vanligvis som en lastekontroll. De blandede primære antistoffløsningene, inkludert 1:500 anti-dystrophin og 1:1,200 anti-α-tubulin antistoffer fungerer godt når antistoffreaksjonen utføres samtidig. - Skyll membranen i destillert vann.
- Oppdag proteinene ved hjelp av chemiluminescent deteksjonreagens og en ladekoblet enhet (CCD) kamerabasert imager.
- Analyser dataene ved hjelp av riktig programvare.
- Påvisning av dystrophin etter exon hoppe av immunocytokjemi
- Programmer UDCene direkte i myorørene i kollagenbelagt 96 brønnplate i henhold til trinn 4.1−4.3.
- Transfect ASO og kultur MYOD1-UDCs i henhold til trinn 5.1.2 og 5.1.3.
- Etter 2 uker med differensiering, vask cellene med PBS og fest dem i 4% paraformaldehyd i 10 min ved 4 °C.
- Permeabilize MYOD1-UDCs i 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel i 10 min ved romtemperatur og blokkere de med 10% geitserum i 15 min ved 37 °C.
- Inkuber cellene med et primært antistoff over natten ved 4 °C.
- Vask cellene med PBS og inkuber de med det sekundære antistoffet i 30 min ved romtemperatur.
MERK: Her brukes mus anti-dystrophin (1:30) som primær antistoff, anti-mus IgG brukes som sekundærantistoff, og Hoechst (1:10,000) brukes til kjernefarer farging. - Bilde platene ved hjelp av et fluorescerende mikroskop og bruk en analysator for å halvforene fluorescenssignalet automatisk i hver brønn under samme tilstand.
Representative Results
Vi kunne samle udcs enkelt og ikke-invasivt. UdCs dannet kolonier innen en uke etter å ha startet primærcellekultur, observerte vi en markert proliferativ evne. Kulturen i UDCer var grei, og bakteriell eller soppforurensning var sjelden når prosedyren ble utført riktig.
Figur 2 viser representative fasekontrastbilder av UDC-kolonien en uke etter primærkulturen (figur 2A) og MYOD1-UDCer i uken etter differensiering (figur 2B). Figur 3 viser vellykket påvisning av exon hoppe i UDCer hentet fra DMD pasienter av RT-PCR. Figur 3A viser RT-PCR-analyse av dystrophin etter antisense oligonucleotide behandling i DZNep-behandlet MYOD1-UDCs avledet fra en 6 år gammel mann med en exon 45-54 sletting i DMD genet. Den åpne leserammen ble gjenopprettet av exon 44 hoppe. På dag 14 etter differensiering bekreftet vi induksjonen av exon som hoppet over på en doseavhengig måte (figur 3B). De øvre båndene betegner opprinnelige produkter, og de nedre båndene betegner exon 44-hoppet over produkter som gjenopprettet den åpne leserammen.
Figur 4 viser vellykket påvisning av dystrophin etter exon hoppe i UDCs hentet fra DMD pasienter ved vestlig blotting på en doseavhengig måte. Vi oppdaget også det restaurerte dystrophinuttrykket ved hjelp av immuncytokjemi (figur 5). Vi målte intensiteten av dystrophin med et fluorescerende mikroskop 1 uke etter antisense oligonucleotide (ASO) transfection på en 96 brønnplate (Figur 5A). Markert høyere fluorescerende signaler ble observert i MYOD1-UDCer behandlet med ASO enn i MYOD1-UDCer behandlet med kontroll ASO (Figur 5B).
Disse resultatene tyder på at vår nye analyse kan evaluere exon hoppe effektivt i MYOD1-UDCs hentet fra DMD pasienter på mRNA og protein nivå.
Figur 1: Skjematisk representasjon av overføringsbunken for semidry vestlig blot. To papirer gjennomvåt i blotting bufferen ble lagt ned på den negative terminalen, og to papirer gjennomvåt i bufferen ble stablet på toppen av dette. Gelen, som har blitt gjennomvåt i bufferen, ble lagt forsiktig over PVDF membranen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder av UDCene. (A) Fasekontrastbilde av UDCer en uke etter primærkulturen. Skalalinje = 200 μm. Innfelt: Et forstørret bilde av området i det hvite rektangelet. (B) Fasekontrastbilde av MYOD1-UDCer i uken etter differensiering. Skalabar = 50 μm. Dette tallet er endret fra Takizawa et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vellykket evaluering av exon som hopper over i urinavledede celler (UDCer) hentet fra DMD-pasienter ved RT-PCR. (A) RT-PCR analyse av dystrophin etter antisense oligonucleotide behandling i 3-deazaneplanocin En hydroklorid (DZNep)-behandlet MYOD1-UDCs avledet fra Duchenne muskeldystrofi (DMD) pasient med en exon 45-54 sletting. DZNep-behandlet MYOD1-UDCer ble også behandlet med kontrollantisans ved 1-10 μM konsentrasjon som kontroller. De øvre båndene var uhoppet produkter (Ex 45-54 sletting) som forble ute av leserammen. De nedre båndene var exon 44-hoppet produkter (Ex 44-54 sletting og Ex 44 hoppet) som gjenopprettet den åpne leserammen. (B) Hoppe effektivitet ble beregnet som (exon 44-hoppet transkripsjon molarity)/(native + exon 44-hoppet transkripsjon molarity [merket med piler]) x 100% ved hjelp av en microchip elektroforese system. Enveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis post hoc-test ble brukt til å sammenligne hoppeeffektiviteten (n = 3 for hver gruppe, ****P < 0,0001). Dataene uttrykkes som gjennomsnittet ± SEM. Dette tallet er endret fra Takizawa et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Vellykket evaluering av exon som hopper i urinavledede celler (UDCer) fra DMD-pasienter av vestlige blot. (A) Representativ vestlig blot for dystrophin i DZNep-behandlet MYOD1-UDCer fra DMD pasient med en exon 45-54 sletting etter exon 44 hoppe. For dystrophin deteksjon ble anti-dystrophin (mot C-terminal) brukt. (B) De relative intensitetene til båndene som er normalisert til α-tubulin-uttrykket ble sammenlignet i pasientavledede celler med og uten antisense oligonucleotidebehandling ved å utføre enveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis post hoc-test (n = 3 for hver gruppe, **P < 0,01, ***P < 0,001, HI = sunn person). Dette tallet er endret fra Takizawa et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Varmekart over immuncytokjemi for dystrophin etter antisense oligonucleotidebehandling i DZNep-behandlet MYOD1-UDCer hentet fra DMD-pasient med exon 45-54 sletting. (A) Sletting av exon 45-54 gjenopprettet den åpne leserammen basert på exon hoppe av exon 44. (B) Signalintensiteten ble kvantifisert ved hjelp av et fluorescerende mikroskop etter 1 uke med antisense oligonucleotide transfection på en 96 brønnplate. Enveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis post hoc-test ble brukt til sammenligningen (n = 3-4 for hver gruppe, ****P < 0,0001). Dette tallet er endret fra Takizawa et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagens | Volum | Endelig konsentrasjon |
| 2x PCR premix | 12,5 μL | 1x (andre kan være på |
| Forover primer | 17.00 | 0,2 μM (0,2 μM) |
| Omvendt primer | 17.00 | 0,2 μM (0,2 μM) |
| Mal | 80 ng (andre er på siden) | |
| Sterilisert destillert vann | opptil 25 μL | |
| Totalt volum per reaksjon | 25 μL (25 μL) |
Tabell 1: Blanding for MYOD1 forsterkning av RT-PCR.
| 98 °C (98 °C) | 10 s | |
| 55 °C (55 °C) | 10 s | } 35 sykluser |
| 72 °C (72 °C) | 10 s |
Tabell 2: Betingelser for termisk syklusfor MYOD1 forsterkning.
| Reagens | Volum |
| 10x K buffer | 2 μL (2 μL) |
| Retroviral vektor (500 ng/μL) | 2 μL (2 μL) |
| Begrensning enzym 1 (2−15 U) | 1 μL (1 μL) |
| Begrensning enzym 2 (2−15 U) | 1 μL (1 μL) |
| Sterilisert destillert vann | 14 μL (14 μL) |
| Totalt volum | 20 μL (20 μL) |
Tabell 3: Blanding for et rør for å fordøye retroviral vektor.
| Reagens | Volum |
| Renset MYOD1-fragment | 100 ng (andre kan være på |
| Fordøyd retroviral vektor | 100 ng (andre kan være på |
| 5x Enzym premix | 4 μL (andre er i sl) |
| Sterilisert destillert vann | opptil 20 μL |
| Totalt volum | 20 μL (20 μL) |
Tabell 4: Blanding for kloningsreaksjonen i fusjonen.
| Løsning | Volum/reaksjon (μL) | Endelig konsentrasjon |
| RNase-fritt vann | Variabel | - |
| Ett-trinns RT-PCR-buffer | 4 | 1x (andre kan være på |
| dNTP-blanding (inneholder 10 mM av hver dNTP) | 0.8 | 400 mM av hver dNTP |
| Forover primer (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM (andre kan være på samme siden) |
| Omvendt primer (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM (andre kan være på samme siden) |
| Ett-trinns RT-PCR enzymblanding | 0.8 | - |
| RNase-hemmer (valgfritt) | Variabel | 5-10 enheter/reaksjon |
| Mal RNA | 50−400 ng | |
| Totalt volum | 20 |
Tabell 5: Nødvendige forbindelser for én reaksjon av etttrinns RT-PCR.
| 1 syklus | Omvendt transkripsjon | 30 min. | 50 °C (50 °C) |
| 1 syklus | Første PCR-aktiveringstrinn | 15 min. | 95 °C (95 °C) |
| 1 syklus | Denaturering | 1 min. | 94 °C (94 °C) |
| Annealing | 1 min. | 60 °C (60 °C) | |
| Forlengelsen | 1 min. | 72 °C (72 °C) | |
| 1 syklus | Endelig forlengelse | 7 min. | 72 °C (72 °C) |
| Holde | ➞ | 4 °C (4 °C) |
Tabell 6: Termisk syklussyklustilstand for etttrinns RT-PCR.
| Reagens | Volum |
| Protein (15 μg) | 10 μL (10 μL) |
| Eksempelbuffer (4x) | 5 μL (5 μL) |
| Reduserende middel (10x) | 2 μL (2 μL) |
| Deionisert vann | 3 μL (andre er i sl) |
| Totalt volum | 20 μL (20 μL) |
Tabell 7: Tilberedning av prøver for natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE).
Discussion
Her beskriver vi en detaljert protokoll for exon hoppe i MYOD1-konverterteUDCer hentet fra DMD pasienter. Ved hjelp av analysesystemet screenet vi optimale antisensesekvenser effektivt. Vi antar at MYOD1-konverterteUDCer kan være nyttig for undersøkelsen av sykdomspatologien.
Evaluering av exon hoppe ved hjelp av pasientavledede celler på mRNA-nivå er uunnværlig for screening av nye legemidler og vurdering av pasientberettigelse før de gjennomfører kliniske studier. Beregning av exon hoppe effektivitet kan evalueres bare på et mRNA-nivå.
Evaluering av exon hoppe på proteinnivå er også viktig fordi dystrophin restaurering er viktig som en surrogat biomarkør for å forutsi fordelene ved exon hoppe. Til dags dato utføres screening av antisense oligonucleotide sekvenser ofte ved hjelp av primære muskelcellelinjer eller udødeliggjorte myoblastcellelinjer, inkludert humane rabdomyosarcoma (RD) celler, men vi kan ikke måle utvinningen av dystrophinnivåer ved hjelp av muskelcellelinjer eller RD-cellelinjer fordi de uttrykker dette proteinet endogent. Vi kan tydelig oppdage restaureringen av dystrophin hos DMD pasientavledede MYOD1-UDCer på en doseavhengig måte. I vår nye analyse anser vi at evalueringen av restaurert protein av vestlig blotting er overlegen i kvantifiserbarhet. På den annen side er evaluering av immuncytokjemi ved hjelp av 96 brønnplater ideell for screening av mange kandidatforbindelser samtidig.
I denne artikkelen beskriver vi en detaljert protokoll for en effektiv modellering DMD muskel ved hjelp av MYOD1-konverterteUDCer sammen med RT-PCR, vestlig blotting, og immunocytochemistry for å evaluere den restaurerte dystrophin på mRNA og proteinnivåer etter exon hoppe. UDCer kan samles ikke invasivt og enkelt. Derfor antar vi at den splitter nye in vitro analysen kan brukes på et bredt spekter av grunnleggende og translasjonelle studier uavhengig av type muskellidelser.
Disclosures
National Center of Neurology and Psychiatry utvikler nå NS-065/NCNP-01, en exon 53 hoppe nde stoff for DMD, med Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for fremme av Science Grant-in-Aid for Scientific Research (C) [gi nr. 18K07544 til Y.A.], Grants-in-Aid for Research on Nervous and Mental Disorders [gi nr. 28-6 til Y.A.], og Japan Agency for Medical Research and Development [gi nr. 18ek0109239h0002, 18lm0203066h0001, og 18lm0203069h0001 til Y.A.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
| Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
| Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
| Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
| BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
| CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
| E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
| EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
| fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
| GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
| High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
| HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
| Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
| Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
| iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
| iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
| Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
| In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
| MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
| MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
| NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
| Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
| One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
| pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
| Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
| REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
| REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
| Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
| Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
| Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
| Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
| Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |
References
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 (2011).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
- Antoury, L., et al. Analysis of extracellular mRNA in human urine reveals splice variant biomarkers of muscular dystrophies. Nature Communications. 9, 3906 (2018).
- Rahmoune, H., et al. Glucose transporters in human renal proximal tubular cells isolated from the urine of patients with non-insulin-dependent diabetes. Diabetes. 54, 3427-3434 (2005).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. The Journal of Urology. 180, 2226-2233 (2008).
- Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9, 3807 (2019).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7, 2080-2089 (2012).
- Chen, W., et al. Skeletal myogenic differentiation of human urine-derived cells as a potential source for skeletal muscle regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11, 334-341 (2017).
- Kim, E. Y., Page, P., Dellefave-Castillo, L. M., McNally, E. M., Wyatt, E. J. Direct reprogramming of urine-derived cells with inducible MyoD for modeling human muscle disease. Skeletal Muscle. 6, 32 (2016).
