Summary
Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para modelagem eficiente do músculo distrofia muscular de Duchenne usando células derivadas de urina convertidas por MYOD1para avaliar a restauração de mRNA de distrofina e níveis de proteína após o salto do exon.
Abstract
A distrofia muscular de Duchenne (DMD), uma doença muscular progressiva e fatal, é causada por mutações no gene DMD que resultam na ausência de proteína de distrofina. Até o momento, concluímos um estudo iniciado pelo pesquisador no Centro Nacional de Neurologia e Psiquiatria baseado na injeção sistêmica dos oligonucleotídeos de morfina que são propensos a exon-53 pulando. Para o tratamento eficaz da DMD, acredita-se que o teste in vitro com mioblastos derivados de pacientes com DMD para testar medicamentos e avaliar a elegibilidade do paciente antes de realizar ensaios clínicos é considerado essencial. Muito recentemente, reportamos uma nova célula derivada de urina convertida por MYOD1(UDC) tratada com o inibidor de metiltransferase histona (3-deazaneplanocina um cloridrato), como um modelo celular de DMD. A nova UDC autóloga pode apresentar fenocopia dos fenótipos específicos da doença de DMD, levando à aplicação da medicina de precisão em uma variedade de doenças relacionadas aos músculos. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para modelagem eficiente de células musculares DMD usando UDCs convertidos por MYOD1,juntamente com reação em cadeia de polimerase transcriptase reversa (RT-PCR), mancha ocidental e imunocitoquímica para avaliar a restauração de distrophinma mRNA e níveis de proteína após o salto de exon.
Introduction
A distrofia muscular de Duchenne (DMD), uma doença muscular progressiva e fatal, é causada por mutações de mudança de quadro no gene DMD que resultam na ausência de proteína de distrofina1. Acredita-se que a terapia de pular exon à base de oligonucleotídeos antisentido susuma seja promissora para a DMD. Esta terapia baseia-se na conversão do fenótipo DMD mais grave para o fenótipo de distrofia muscular becker mais suave, alterando o splicing pré-mRNA para restaurar o quadro de leitura de DMD 2. Recentemente concluímos um estudo em humanos baseado na administração intravenosa repetida do oligômero morfolino (PMO) phosphorodiamidate (PMO) viltoxi, que pode induzir o exon 53 a pular em DMD, e demonstrou um excelente perfil de segurança, prometendo3eficácia e parâmetros farmacocinéticos aceitáveis (registrados como UMIN: 000010964 e ClinicalTrials.gov: NCT02081625)
No entanto, para desenvolver tratamentos econômicos e eficientes para a doença, os testes in vitro utilizando células musculares primárias obtidas em pacientes com DMD são essenciais para a triagem de medicamentos e a verificação da elegibilidade do paciente antes da realização de ensaios clínicos, bem como biomarcadores que refletem a eficácia das terapias de exon skipping durante ensaios em humanos4. Muito recentemente, reportamos uma nova tecnologia para desenvolver células derivadas de urina (UDCs) 55,6 como um modelo primário de mioblast o imd7. Assim, para gerar os mioblastos, apenas a coleta de urina dos pacientes é necessária e nenhum procedimento invasivo é necessário. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para modelagem eficiente do músculo DMD usando UDCs convertidas por MYOD1tratadas com 3-deazaneplanocina Um cloridrato para avaliar a distrofina restaurada mRNA e proteína após o salto de exon.
Protocol
O Comitê de Ética do Centro Nacional de Neurologia e Psiquiatria aprovou este estudo (ID de aprovação: A2017-018, A2018-029). Todos os indivíduos deram consentimento informado antes de fornecer urina. Todos os experimentos foram realizados sob as diretrizes e regulamentos pertinentes.
1. Isolamento e cultura primária das UDCs
NOTA: As UDCs foram isoladas de acordo com um protocolo publicado anteriormente8,9,10 com algumas modificações.
- Coletar amostras de urina durante a micturição espontânea em garrafas plásticas esterilizadas.
NOTA: Não é necessária a esterilização do orifício uretral externo. A urina midstream é desejável para reduzir o risco de contaminação viral. Se o tempo de estoque antes do próximo procedimento for de >1 h, as amostras de urina devem ser transferidas para 4 °C para preservar a viabilidade celular. No entanto, uma temperatura de <4 °C deve ser evitada porque precipitados insolúveis podem aparecer. - Centrifugar toda a amostra de urina a 400 x g por 10 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante, deixando 1 mL no tubo.
- Ressuspensa as pelotas individualmente no restante de 1 mL de urina e, em seguida, colete-as em um único tubo de 50 mL.
- Adicionar 10 mL de tampão de lavagem composto por 99 mL de PBS sem cálcio e magnésio, 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), 0,5 μg/mL de anfotericina B e centrífugas as amostras a 200 x g por 10 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante, deixando 0,2 mL no tubo.
- Resuspender as pelotas celulares em 4,5 mL de meio primário composto de uma mistura de alta glicose O meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) sem piruvato de sódio e a mistura de nutrientes F-12 de Ham complementada com fator de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF), insulina, hidrocortisona, epinefrina, T3, transferrina, 10% soro bovino bovino sem tetraciclina (FBS), 1% P/S e 0,5 μg/mL de anfotericina B.
- Semeie as células em três poços de seis placas de poço revestidas de gelatina (volume total de cada poço, 1,5 mL). Cultura umidificada a 37 °C e 5% CO2 por 24 horas.
- Adicione 1,5 mL do médio primário diariamente para os próximos 3 dias.
- No dia 4, substitua o meio por 1,5 mL de meio de crescimento complementado com EGF humano recombinante, insulina, hidrocortisona, epinefrina, T3, transferrina, 15% FBS livre de tetraciclina, 0,5% L-alanine-L-glutamina, 0,5% apaminoácidos não essenciais e 2,5 ng/mL fibroblasto fator-básico (bFGF), fator de crescimento recombinante derivado de plaquetas humanas (PDGF), EGF, e 1% P/P/S.
- Mude o meio de crescimento a cada dois dias.
NOTA: As colônias da UDC aparecem dentro de uma semana. - Quando a cultura UDC se tornar 80-90% confluente, remova as células médias e de lavagem com PBS, divida todas as células usando 0,25% de trypsin-EDTA e semente a 3.000-5.000 células/cm2 em um novo prato de 60 mm revestido de gelatina (passagem 1).
NOTA: Os UDCs podem ser armazenados em nitrogênio líquido. Os UDCs são geralmente divididos em 60-70% de confluência em prato de cultura de 60 mm em três tubos de estoque.
2. Construção retroviral
- Amplificar a região de codificação do plasmídeo MYOD1 (NM_002478,4) por reação em cadeia de polimerase (PCR).
NOTA: A mistura para amplificação MYOD1 e as condições para o ciclotérmico são mostradas na Tabela 1 e na Tabela 2,respectivamente. - Detecte uma única faixa de cerca de 1.000 bp de tamanho por eletroforese de gel de agarose de 0,7% usando 1 μL do produto PCR amplificado para confirmar que a seqüência MYOD1 é amplificada com sucesso.
- Limpe o produto PCR usando o kit de limpeza e determine sua concentração com um espectrofotômetro.
- Incubar a mistura como mostrado na Tabela 3 a 37 °C durante a noite para digerir vetor retroviral com um sistema Tet-on e gene resistente à puromicina em regiões de restrição alvo de enzimas no local de clonagem múltipla.
- Detectar uma única banda por eletroforese de gel de agarose de 0,7% usando 1 μL do produto digerido para confirmar que o vetor retroviral foi digerido com sucesso.
- Limpe o produto digerido usando o kit de limpeza e determine sua concentração por espectrofotômetro.
- Para clonar o fragmento MYOD1 amplificado (produzido pelas etapas 2.1-2.3) no vetor retroviral digerido (produzido pelas etapas 2.4-2.6), realize uma reação de clonagem em fusão. Configure a reação como mostrado na Tabela 4, incubar a reação por 15 min a 50 °C e, em seguida, colocar no gelo.
- Realizar a transformação utilizando células competentes e. coli de acordo com as instruções do fabricante (Tabela de Materiais).
- Selecione as células competentes transformadas, culminando em uma placa de cultura LB composta por 10 g/L bacto tryptone, 5 g/L extrato de levedura bacto, 5 g/L NaCl, 15 g/L bacto ágar e 50 mg/L ampicillin.
- Pegue a colônia e a cultura selecionadas no meio de cultura LB sem ágar bacto a 200 rpm a 37 °C durante a noite.
- Purifique os vetores retrovirais inseridos no MYOD1usando um kit de purificação plasmídea(Tabela de Materiais)e quantifique usando um espectrofotômetro.
- Confirme se o MYOD1 está corretamente inserido no vetor retroviral por sequenciamento direto do produto PCR amplificado pelos primers dianteiros e reversos, respectivamente, em ambos os lados através da seqüência MYOD1 inserida.
NOTA: A seqüência MYOD1 pode ser detectada entre seqüências vetoriais retrovirais quando a clonagem em fusão é bem sucedida. - Para a produção retroviral, sementes as células de embalagem a 50.000 células/cm2 em placas e cultura revestidas de colágeno de 10 cm em DMEM com 10% fbs umidificada a 37 °C e 5% CO2 por 24 horas.
- Quando as células de embalagem proliferarem até 80% de confluência, misture 30 μg de vetores retrovirais inseridos myod1,30 μg de vetores de embalagem e reagente de transfecção contendo peptídeo penetrante celular(Tabela de Materiais)por vórtice, e incuba-os por 10 min.
- Adicione a mistura incubada ao meio de células de embalagem e cultura umidificada a 37 °C e 5% CO2.
NOTA: O revestimento de colágeno é necessário. A transfecção pode ser melhor em 24h ou mais após a semeada, pois as células de embalagem se desprendem facilmente da placa de cultura. - Depois de 4h ou da noite para o dia, mude o meio de crescimento médio para novo.
- Recolher o sobrenadante viral e substituir por meio fresco em 24 e 48 h após a cotransfecção e combinar o sobrenadante.
- Para concentrar o supernadante viral, misture-o com o reagente concentrador e incubar a 37 °C durante a noite, em seguida, centrífuga a 1.500 x g por 45 min a 4 °C.
- Filtrar o sobrenadante retrovírus através de um filtro PVDF com poros de 0,45 μm.
- Verifique o título do vetor retroviral utilizando um kit PCR quantitativo e sistema de ciclotérmico de acordo com as instruções do fabricante.
- Divida o sobrenadante viral em pequenas alíquotas e estocar-as a -80 °C.
3. Infecção com MYOD1-vetor retroviral em UDCs
- Semeie as UDCs a 3.000-5.000 células/cm2 em um prato de 60 mm revestido de gelatina.
- Após 24 h de semeada, infecte o retrovírus descongelado (passo 2.21) em uma multiplicidade de infecção de 200 adicionando brometo de hexadimhrine a uma concentração de 8 μg/mL.
- Após uma incubação de 24 h umidificada a 37 °C e 5% de CO2,substitua o meio de cultura por um meio de crescimento fresco contendo 1 μg/mL de puromicina para selecionar as células transduzidas pelo MYOD1. Mude o meio a cada dois dias.
NOTA: Ao selecionar células MYOD1-positivas, 1 μg/mL de puromicina é geralmente usado para seleção. A dose apropriada deve ser determinada. Use uma placa contendo células não transinfectadas e escolha a dose que mata todas as células em 3-5 dias. MYOD1- células positivas devem ser selecionadas dentro de 7-10 dias após a adição de puromicina. Os UDCs transduzidos pelo MYOD1podem ser armazenados em nitrogênio líquido.
4. Diferenciação miogênica de UDCs transduzidas pelo MYOD1tratadas com 3-deazaneplanocina Um cloridrato (DZNep)
NOTA: Recentemente, foi relatado que o DZNep, um inibidor de metiltransferase histona, poderia promover significativamente a expressão de MYOGENIN, um dos fatores regulatórios musculares tardios, e também levar à diferenciação do miotubo7.
- Placas MYOD1-UDCs transduzidas nos poços revestidos de colágeno a uma densidade de 3,5 x 104 células/cm2. Cultura umidificada a 37 °C e 5% DE CO2.
- Após 24 h, altere o meio de crescimento para o meio de diferenciação composto de DMEM de alta glicose com L-alanina-L-glutamina, 5% de soro de cavalo, suplemento ITS, doxiciclina de 1 μg/mL e DZNep de 5 μM.
NOTA: A solução DZNep de 10 mM pode ser armazenada a -80 °C por 3 meses. Use um congelador de descongelar e evite ciclos repetidos de congelamento. Tanto o MYOD1 ativado pela doxiciclina quanto pelo DZNep suprimem a proliferação e promovem a diferenciação miogênica dos UDCs. Portanto, recomenda-se que a doxiciclina e o DZNep sejam adicionados após a indução da diferenciação miogênica. DZNep promove a diferenciação miogênica dos MYOD1-UDCs de forma dependente de dose. Por outro lado, mostra citotoxicidade em alta concentração. Portanto, determine a concentração apropriada de DZNep, variando de 1-10 μM dependendo de seus efeitos na diferenciação miogênica e biodisponibilidade celular. - Após 3 dias, mude o meio de diferenciação para o meio de diferenciação fresco sem DZNep. Em seguida, troque o meio a cada 3 dias.
NOTA: Os UDCs se fundem entre si e formam miotubos dentro de 1-2 semanas após a diferenciação.
5. Exon pulando em UDCs convertidos em MYOD1
NOTA: Aqui, três protocolos são descritos para avaliar o salto exon em células derivadas do paciente: 1) reação em cadeia de transcriptase reversa (RT-PCR) de distrophinm mRNA; 2) semiquantificação do sinal de proteína de distrofina restaurada por mancha ocidental; e 3) semiquantificação do sinal de fluorescência de distrofina restaurada por imunocitoquímica. Todos os métodos podem detectar exon pulando de uma maneira dependente de dose.
- Avaliação da eficiência de salto de exon por RT-PCR
- Para transfect antisense oligonucleotídeo (ASO) em UDCs convertidas em MYOD1obtidas de pacientes com DMD no dia 7 após a diferenciação, misture ASO, reagente de transfecção(Tabela de Materiais)e meio de diferenciação para uma concentração final de 1-10 μM. Cultura umidificada a 37 °C e 5% CO2.
- Após 72 h de incubação com ASO, mude o meio de diferenciação médio para fresco sem ASO.
- De 3 a 7 dias após a transfecção de ASO, remova o meio de diferenciação e lave 1x com PBS. Adicione tampão de lyse celular, lse os UDCs e colher o RNA total usando um kit de extração de RNA.
- Meça a concentração de RNA com um espectrofotômetro.
- Combine os reagentes necessários para uma reação RT-PCR de uma etapa em tubos PCR de acordo com a Tabela 5.
- Coloque os tubos PCR com a mistura em um termociclador. Execute o termociclador, de acordo com a Tabela 6.
- Realize a eletroforese do microchip e calcule a eficiência de pular exon usando a concentração molar como abaixo.
Eficiência de salto exon (%) = banda pulada / (banda pulada + banda não pulada) x 100
NOTA: Armazene o produto PCR em uma geladeira a 4 °C para armazenamento a curto prazo ou -20 °C para armazenamento a longo prazo.
- Detecção de distrofina após exon pular por manchas ocidentais
- Transfect ASO e cultura MYOD1-UDCs de acordo com as etapas 5.1.1 e 5.1.2.
- Troque o meio a cada 3 dias.
- Após 2 semanas de diferenciação, extraia a proteína total das células cultivadas usando tampão de ensaio radioimunoprecipitado (RIPA) contendo inibidores de protease.
- Sonice os lysates no gelo e centrífugas a 14.000 x g por 15 min a 4 °C.
- Coletar o sobrenadante e determinar as concentrações proteicas usando um kit de ensaio de proteína BCA.
- Adicione 15 μg de proteína total em um tubo de 0,5 mL e diluir adicionando o tampão RIPA contendo inibidores de protease a um volume total de 10 μL. Execute 15 μg de proteína total por pista.
- Adicionar tampão de amostra, agente redutor e água desionizada conforme mostrado na Tabela 7. Desnaturar as células a 70 °C por 10 min.
- Prepare o tampão de execução de tris-acetato contendo 8,95 g/L tricine, 6,06 g/L tris base, 1,0 g/L sulfato de dodecil de sódio (SDS).
- Carregue a amostra (20 μL) no tris-acetato de 3-8% de gel e realize a eletroforese a 150 V por 75 min.
- Prepare o tampão de apagar sem metanol.
- Mergulhe a membrana PVDF para 20 s em metanol e, em seguida, no tampão de amortecimento até o uso (pelo menos 10 min). Corte a membrana PVDF para um tamanho de 6 x 8 cm usando mini géis e 8 x 12 cm usando géis midi.
- Corte os papéis de mancha ao mesmo tamanho da membrana PVDF e mergulhe-os no tampão de mancha até o uso.
- Após a eletroforese, corte o gel para o mesmo tamanho da membrana PVDF e mergulhe o gel em água destilada.
- Coloque os papéis de mancha, membrana PVDF e gel no aparelho de transferência semiseca(Figura 1). Transfira a 4 mA/cm2 por 30 min.
- Enxágüe a membrana 2x com água destilada.
- Prepare anti-distrofina (1:500) e anti-α-tubulina (1:1.200) como os anticorpos primários.
- Prepare o anticorpo anti-mouse conjugado com HRP (1:100) como um anticorpo secundário.
- Incubar as membranas com os anticorpos primários, lavar com tampão de lavagem e, em seguida, incubar com o anticorpo secundário usando um dispositivo automatizado de processamento ocidental (Table of Materials) à temperatura ambiente.
NOTA: O anticorpo anti-α-tubulina é geralmente usado como controle de carga. As soluções de anticorpos primários mistos, incluindo 1:500 anti-distrofina e 1:1.200 anticorpos anti-α-tbulina funcionam bem quando a reação de anticorpos é realizada simultaneamente. - Enxágüe a membrana em água destilada.
- Detecte as proteínas usando reagente de detecção quimioluminescente e um imager baseado em câmera baseado em dispositivo de carga (CCD).
- Analise os dados usando o software apropriado.
- Detecção de distrofina após exon pular por imunocitoquímica
- Reprograme diretamente os UDCs nos miotubos em placa de poço revestida de colágeno 96 de acordo com as etapas 4.1-4.3.
- Transfect o ASO e a cultura MYOD1-UDCs de acordo com as etapas 5.1.2 e 5.1.3.
- Após 2 semanas de diferenciação, lave as células com PBS e fixe-as em 4% de paraformaldeído por 10 min a 4 °C.
- Permeabilize MYOD1-UDCs em 0,1% de detergente nonionônico por 10 min à temperatura ambiente e bloqueie aqueles com soro de cabra de 10% por 15 min a 37 °C.
- Incubar as células com um anticorpo primário durante a noite a 4 °C.
- Lave as células com PBS e incuba-as com o anticorpo secundário por 30 min à temperatura ambiente.
NOTA: Aqui, o anti-distrofina do rato (1:30) é usado como o anticorpo primário, o anti-mouse IgG é usado como anticorpo secundário, e Hoechst (1:10.000) é usado para coloração de núcleos. - Imagem as placas usando um microscópio fluorescente e use um analisador para semiquantificar o sinal de fluorescência automaticamente em todos os poços sob a mesma condição.
Representative Results
Poderíamos coletar os UDCs de forma fácil e não invasiva. As UDCs formaram colônias dentro de uma semana após o início da cultura celular primária, observamos uma capacidade proliferativa acentuada. A cultura das UDCs era simples, e a contaminação bacteriana ou fúngica era rara quando o procedimento era realizado corretamente.
A Figura 2 mostra imagens representativas de contraste de fase da colônia UDC uma semana após a cultura primária (Figura 2A) e MYOD1-UDCs uma semana após a diferenciação(Figura 2B). A Figura 3 mostra a detecção bem sucedida de exon sumis em UDCs obtidos de pacientes com DMD por RT-PCR. A Figura 3Mostra a análise RT-PCR da distrofina após tratamento antisense oligonucleotídeo em MYOD1-UDCs tratados com DZNep derivados de um homem de 6 anos com uma exclusão exon 45-54 no gene DMD. O quadro de leitura aberto foi restaurado por exon 44 pulando. No dia 14, após a diferenciação, foi confirmada a indução de exon pulando de forma dependente de dose(Figura 3B). As faixas superiores denotam produtos nativos, e as bandas inferiores denotam produtos exon 44-skipped que restauraram o quadro de leitura aberto.
A Figura 4 mostra a detecção bem sucedida de distrofina após o salto de exon nas UDCs obtidas de pacientes com DMD por manchas ocidentais de forma dependente de dose. Também detectamos a expressão de distrofina restaurada usando imunocitoquímica (Figura 5). Medimos as intensidades da distrofina com um microscópio fluorescente 1 semana após a transfecção antisense oligonucleotídeo (ASO) em uma placa de poço 96(Figura 5A). Sinais fluorescentes notavelmente mais elevados foram observados em MYOD1-UDCs tratados com ASO do que em MYOD1-UDCs tratados com controle ASO(Figura 5B).
Esses resultados sugerem que nosso novo ensaio pode avaliar o salto de exon eficientemente em MYOD1-UDCs obtidos de pacientes com DMD no nível de mRNA e proteína.
Figura 1: Representação esquemática da pilha de transferência para mancha ocidental semiseca. Dois papéis encharcados no tampão de manchas foram colocados no terminal negativo, e dois papéis encharcados no buffer foram empilhados em cima disso. O gel, que foi encharcado no tampão, foi colocado suavemente sobre a membrana PVDF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas das UDCs. (A) Imagem de contraste de fase das UDCs uma semana após a cultura primária. Barra de escala = 200 μm. Inset: Uma imagem ampliada da área no retângulo branco. (B) Imagem de contraste de fase de MYOD1-UDCs uma semana após a diferenciação. Barra de escala = 50 μm. Esta figura foi modificada a partir de Takizawa et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação bem sucedida do salto de exon em células derivadas da urina (UDCs) obtidas de pacientes com DMD por RT-PCR. (A) Análise RT-PCR da distrofina após tratamento antisense oligonucleotídeo em 3-deazaneplanocina Um cloridrato tratado com DZNep (DZNep) tratado MYOD1-UDCs derivados da distrofia muscular de Duchenne (DMD) paciente com uma exclusão exon 45-54. Os MYOD1-UDCs tratados com DZNep também foram tratados com o antisentido de controle em concentração de 1-10 μM como controles. As faixas superiores foram produtos não pulados (exclusão Ex 45-54) que permaneceram fora do quadro de leitura. As faixas inferiores foram os produtos exon 44-skipped (exclusão Ex 44-54 e Ex 44 pulou) que restauraram o quadro de leitura aberto. (B) A eficiência de pular foi calculada como (molaridade de transcrição exon 44-skipped)/(molaridade de transcrição nativa + exon 44-skipped [marcada com setas]) x 100% usando um sistema de eletroforese de microchip. A ANOVA unidirecional seguida pelo teste pós-hoc de Bonferroni foi usada para comparar as eficiências de pular (n = 3 para cada grupo, ****P < 0,0001). Os dados são expressos como a média ± SEM. Esta figura foi modificada a partir de Takizawa et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação bem sucedida do salto de exon em células derivadas da urina (UDCs) de pacientes com DMD por mancha ocidental. (A) Mancha ocidental representativa para distrofina em MYOD1-UDCs tratados com DZNep de paciente DMD com uma exclusão exon 45-54 após o exon 44 pular. Para detecção de distrofina, utilizou-se anti-distrofina (contra o terminal C). (B) As intensidades relativas das bandas normalizadas à expressão α-tubulina foram comparadas em células derivadas do paciente com e sem tratamento oligonucleotídeo antisentido, realizando ANOVA unidirecional seguido pelo teste pós-hoc de Bonferroni (n = 3 para cada grupo, **P < 0,01, ***P < 0,001, HI = indivíduo saudável). Esta figura foi modificada a partir de Takizawa et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Mapas de calor da imunocitoquímica para distrofina após tratamento antisense oligonucleotídeo em MYOD1-UDCs tratados com DZNep obtidos de paciente dmd com exclusão exon 45-54. (A)A exclusão do exon 45-54 restaurou o quadro de leitura aberto com base no exon pulando de exon 44. (B) A intensidade do sinal foi quantificada por meio de um microscópio fluorescente após 1 semana de transfecção antisense oligonucleotídeo em uma placa de poço 96. Para a comparação (n = 3-4 para cada grupo, ****P < 0,0001). Esta figura foi modificada a partir de Takizawa et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Volume | Concentração final |
| 2x pré-mix pcr | 12,5 μL | 1x |
| Primer dianteiro | 5 pmol | 0,2 μM |
| Primer reverso | 5 pmol | 0,2 μM |
| Modelo | 80 ng | |
| Água destilada esterilizada | até 25 μL | |
| Volume total por reação | 25 μL |
Tabela 1: Mistura para amplificação MYOD1 por RT-PCR.
| 98 °C | 10 s | |
| 55 °C | 10 s | } 35 ciclos |
| 72 °C | 10 s |
Tabela 2: Condições para o ciclotérmico para amplificação MYOD1.
| Reagente | Volume |
| Tampão de 10x K | 2 μL |
| Vetor retroviral (500 ng/μL) | 2 μL |
| Enzima de restrição 1 (2-15 U) | 1 μL |
| Enzima de restrição 2 (2-15 U) | 1 μL |
| Água destilada esterilizada | 14 μL |
| Volume total | 20 μL |
Tabela 3: Mistura para um tubo para digerir vetor retroviral.
| Reagente | Volume |
| Fragmento MYOD1 purificado | 100 ng |
| Vetor retroviral digerido | 100 ng |
| 5x Enzima pré-mix | 4 μL |
| Água destilada esterilizada | até 20 μL |
| Volume total | 20 μL |
Tabela 4: Mistura para a reação de clonagem em fusão.
| Solução | Volume/Reação (μL) | Concentração final |
| Água sem rnase | Variável | - |
| Tampão RT-PCR de uma etapa | 4 | 1x |
| mix dNTP (contendo 10 mM de cada dNTP) | 0.8 | 400 mM de cada dNTP |
| Primer dianteiro (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Primer reverso (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Uma etapa mistura de enzimas RT-PCR | 0.8 | - |
| Inibidor de RNase (opcional) | Variável | 5−10 unidades/reação |
| Modelo RNA | 50-400 ng | |
| Volume total | 20 |
Tabela 5: Compostos necessários para uma reação do RT-PCR de um passo.
| 1 ciclo | Transcrição reversa | 30 min. | 50 °C |
| 1 ciclo | Etapa inicial de ativação do PCR | 15 min. | 95 °C |
| 1 ciclo | Desnaturação | 1 min. | 94 °C |
| Recozimento | 1 min. | 60 °C | |
| Extensão | 1 min. | 72 °C | |
| 1 ciclo | Prorrogação final | 7 min. | 72 °C |
| Segurar | ∞ | 4 °C |
Tabela 6: Condição do ciclotérmico para rt-PCR de uma etapa.
| Reagente | Volume |
| Proteína (15 μg) | 10 μL |
| Tampão de amostra (4x) | 5 μL |
| Agente de redução (10x) | 2 μL |
| Água desionizada | 3 μL |
| Volume total | 20 μL |
Tabela 7: Preparação de amostras para eletroforese de gel de poliacrilamida de dodecil de sódio (SDS-PAGE).
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado de exon saltando em UDCs convertidas em MYOD1obtidas de pacientes com DMD. Usando o sistema de ensaio, selecionamos sequências antisense ótimas de forma eficiente. Assumimos que as UDCs convertidas pelo MYOD1podem ser úteis para a investigação da fisiopatologia da doença.
A avaliação do exon pulando usando células derivadas do paciente no nível mRNA é indispensável para a triagem de novos medicamentos e a avaliação da elegibilidade do paciente antes de realizar ensaios clínicos. O cálculo da eficiência de salto de exon só pode ser avaliado em um nível de mRNA.
A avaliação do exon pulando ao nível da proteína também é importante porque a restauração da distrofina é importante como um biomarcador substituto para prever os benefícios do salto de exon. Até o momento, a triagem de seqüências antisense oligonucleotídeos é frequentemente realizada usando linhas de células musculares primárias ou linhas de células ioblastas imortalizadas, incluindo células de rabdomiossarcoma humano (RD), mas não podemos medir a recuperação de níveis de distrofina usando linhas de células musculares ou linhas de células RD porque expressam essa proteína endógena. Podemos detectar claramente a restauração da distrofina em MYOD1-UDCs derivados do paciente dMD de forma dependente de dose. Em nosso novo ensaio, consideramos que a avaliação da proteína restaurada pela mancha ocidental é superior em quantificar. Por outro lado, a avaliação pela imunocitoquímica utilizando 96 placas de poço é ideal para triagem de muitos compostos candidatos simultaneamente.
Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para uma modelagem eficiente do músculo DMD usando UDCs convertidos por MYOD1,juntamente com RT-PCR, mancha ocidental e imunocitoquímica para avaliar a distrofina restaurada nos níveis de mRNA e proteína após o salto do exon. Os UDCs podem ser coletados de forma não invasiva e fácil. Portanto, assumimos que o novo ensaio in vitro pode ser aplicado a uma ampla gama de estudos básicos e translacionais, independentemente do tipo de distúrbios musculares.
Disclosures
O Centro Nacional de Neurologia e Psiquiatria está desenvolvendo agora o NS-065/NCNP-01, um exon 53 pulando droga para DMD, com Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Sociedade japonesa para a Promoção da Ciência Grant-in-Aid for Scientific Research (C) [bolsa nº 18K07544 para Y.A.], Subsídios para pesquisa sobre transtornos nervosos e mentais [bolsa nº 28-6 para Y.A.], e a Agência japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico [bolsa nº 18ek0109239h0002, 18lm0203066h0001, e 18lm0203069h001 para Y.A.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
| Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
| Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
| Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
| BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
| CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
| E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
| EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
| fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
| GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
| High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
| HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
| Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
| Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
| iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
| iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
| Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
| In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
| MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
| MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
| NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
| Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
| One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
| pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
| Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
| REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
| REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
| Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
| Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
| Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
| Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
| Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |
References
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