Summary
I den här artikeln beskriver vi ett detaljerat protokoll för effektiv modellering av Duchennes muskeldystrofi muskel med MYOD1-konverteradeurin-härledda celler för att utvärdera återställandet av dystrophin mRNA och proteinnivåer efter exon hoppa över.
Abstract
Duchennes muskeldystrofi (DMD), en progressiv och dödlig muskelsjukdom, orsakas av mutationer i DMD genen som resulterar i avsaknad av dystrophin protein. Hittills har vi avslutat en prövarinitierad första-i-människa studie vid National Center of Neurology and Psychiatry baserat på systemisk injektion av morpholino oligonukleotider som är benägna att exon-53 hoppa. För effektiv behandling av DMD, in vitro-testning med myoblasts härrör från DMD patienter att screena läkemedel och bedöma patientens behörighet innan de genomför kliniska prövningar tros vara viktigt. Alldeles nyligen rapporterade vi en ny MYOD1-konverteradeurin-härledda cell (UDC) behandlas med histon metyltransferashämmare (3-deazaneplanocin En hydroklorid), som en cellulär modell av DMD. Den nya autologa UDC kan visa fenocopy av sjukdomsspecifika fenotyper av DMD, vilket leder till tillämpning av precision medicin i en mängd olika muskel-relaterade sjukdomar. I den här artikeln beskriver vi ett detaljerat protokoll för effektiv modellering av DMD muskelceller med MYOD1-konverteradeUDCs tillsammans med omvänd transkriptas polymeras kedjereaktion (RT-PCR), västra blotting och immunocytochemistry att utvärdera återställandet av dystrophin mRNA och proteinnivåer efter exon hoppa över.
Introduction
Duchennes muskeldystrofi (DMD), en progressiv, dödlig muskelsjukdom, orsakas av ram-shift mutationer i DMD genen som resulterar i avsaknad av dystrophin protein1. Antisense oligonukleotid-baserade exon hoppa terapi tros vara lovande för DMD. Denna behandling är baserad på omvandlingen av den severer DMD fenotyp till mildare Becker muskeldystrofi-liknande fenotyp genom att ändra pre-mRNA splitsning för att återställa DMD behandlingen ram2. Vi har nyligen avslutat en första-på-människa studie baserad på upprepad intravenös administrering av fosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO) viltolarsen, som kan framkalla exon 53 hoppa i DMD, och visat en utmärkt säkerhetsprofil, lovande effekt, och godtagbara farmakokinetiska parametrar (registrerad som UMIN: 000010964 och ClinicalTrials.gov: NCT02081625)3.
För att utveckla kostnadseffektiva och effektiva behandlingar för sjukdomen är dock in vitro-tester med primära muskelceller som erhållits från DMD-patienter nödvändiga för läkemedelsscreening och kontroll av patientens behörighet innan kliniska prövningar genomförs, samt biomarkörer som återspeglar effekten av exon hoppa över terapier under mänskliga prövningar4. Alldeles nyligen rapporterade vi en ny teknik för att utveckla patientspecifika MYOD1-konverteradeurin-härledda celler (UDCs)5,6 som en primär myoblast modell av DMD7. Således, för att generera myoblasterna krävs endast insamling av urin från patienter och inget invasivt förfarande behövs. I den här artikeln beskriver vi ett detaljerat protokoll för effektiv modellering av DMD muskel med MYOD1-konverteradeUDCs behandlas med 3-deazaneplanocin En hydroklorid att utvärdera återställda dystrophin mRNA och protein efter exon hoppa.
Protocol
Etikkommittén vid Nationellt centrum för neurologi och psykiatri godkände denna studie (godkännande-ID: A2017-018, A2018-029). Alla individer gav informerat samtycke innan de lämnade urin. Alla experiment utfördes enligt relevanta riktlinjer och föreskrifter.
1. Isolering och primär kultur av udcs
UDC:er isolerades enligt ett tidigare publicerat protokoll8,9,10 med vissa ändringar.
- Samla urinprov under spontan micturition i steriliserade plastflaskor.
OBS: Sterilisering av den yttre urinrörsöppningen behövs inte. Midstream urin är önskvärt att minska risken för viruskontaminering. Om lagertiden före nästa procedur är >1 h, bör urinprov överföras till 4 °C för att bevara cellens livskraft. En temperatur på <4 °C bör dock undvikas eftersom olösliga fällningar kan förekomma. - Centrifugera hela urinprovet vid 400 x g i 10 min vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och lämna 1 ml i röret.
- Resuspend pellets individuellt i de återstående 1 ml urin och sedan samla in dem i en enda 50 ml rör.
- Tillsätt 10 ml tvättbuffert bestående av 99 ml PBS utan kalcium och magnesium, 1 % penicillin/streptomycin (P/S), 0,5 μg/mL amphotericin B och centrifugera proverna vid 200 x g i 10 min vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och lämna 0,2 ml i röret.
- Resuspend cellpellets i 4,5 ml primärt medium bestående av en 1:1 blandning av hög glukos Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) utan natriumpyruvat och Hams F-12 näringsblandning kompletterad med rekombinant human epidermal tillväxtfaktor (EGF), insulin, hydrokortison, adrenalin, T3, transferrin, 10% tetracyklinfritt fetalt bovinserum (FBS), 1% P/S och 0,5 μg/mL amphotericin B.
- Utsäde cellerna i tre brunnar gelatinbelagda sex brunnsplattor (total volym av varje brunn, 1,5 ml). Odling fuktad vid 37 °C och 5% CO2 för 24 timmar.
- Tillsätt 1,5 ml av det primära mediet dagligen under de kommande 3 dagarna.
- Byt dag 4 ut mediet mot 1,5 ml tillväxtmedium kompletterat med rekombinant human EGF, insulin, hydrokortison, adrenalin, T3, transferrin, 15% tetracyklinfri FBS, 0,5% L-alanin-L-glutamin, 0,5% oväsenta aminosyror och 2,5 ng/mL fibroblast tillväxtfaktor-basic (bFGF), rekombinant humant trombocyt-härledd tillväxtfaktor (PDGF), EGF, och 1% P / S.
- Ändra tillväxtmediet varannan dag.
UDC-kolonier uppträder inom en vecka. - När UDC-kulturen blir 80−90% konfluent, ta bort mediet och tvätta cellerna med PBS, dela alla celler med 0,25% trypsin-EDTA och utsäde vid 3.000-5.000 celler / cm2 på en ny gelatinbelagd 60 mm maträtt (passage 1).
OBS: UPC kan förvaras i flytande kväve. UDCs delas vanligtvis på 60−70% sammanflödet i 60 mm kulturskål i tre lager rör.
2. Retroviral konstruktion
- Förstärka kodningsregionen MYOD1 (NM_002478,4) plasmid genom polymeraskedjereaktion (PCR).
OBS: Blandningen för MYOD1-förstärkning och villkor för termisk cycler visas i tabell 1 respektive tabell 2. - Känn av ett enda band med ca 1 000 bp-storlek med 0,7 % agaros gelelektrofores med 1 μl av den förstärkta PCR-produkten för att bekräfta att MYOD1-sekvensen förstärks framgångsrikt.
- Rengör PCR-produkten med hjälp av rengöringssatsen och bestäm dess koncentration med en spektrofotometer.
- Inkubera blandningen enligt tabell 3 vid 37 °C över natten för att smälta retroviral vektor med ett Tet-on-system och puromycinresistent gen vid begränsningsenzyminriktade regioner i området för kloning av flera.
- Detektera ett enda band med 0,7 % agaros gelelektrofores med 1 μl av den smälta produkten för att bekräfta att den retrovirala vektorn har smälts framgångsrikt.
- Rengör den smälta produkten med hjälp av saneringssatsen och bestäm dess koncentration genom spektrofotometer.
- För att klona det förstärkta MYOD1-fragmentet (som produceras av steg 2.1−2.3) till den smälta retrovirala vektorn (producerad av steg 2.4−2.6), utför du en kloningsreaktion i fusion. Ställ in reaktionen enligt tabell 4,inkubera reaktionen i 15 min vid 50 °C och placera sedan på is.
- Utför omvandling med E. coli-behöriga celler enligt tillverkarens anvisningar (Tabell över material).
- Välj de transformerade kompetenta cellerna genom att odla på en LB-odlingsplatta bestående av 10 g/L bacto tryptone, 5 g/L bacto jästextrakt, 5 g/L NaCl, 15 g/L bacto agar och 50 mg/L ampicillin.
- Plocka upp den valda kolonin och kulturen i LB-odlingsmediet utan bacto agar vid 200 varv/min vid 37 °C över natten.
- Rena MYOD1-insattaretrovirala vektorer med hjälp av en plasmidreningssats (Tabell över material)och kvantifiera med hjälp av en spektrofotometer.
- Bekräfta att MYOD1 är korrekt insatt i den retrovirala vektorn genom direkt sekvensering av PCR-produkten som förstärks av de framåt- och omvända grundfärgerna som är riktade på båda sidor över den infogade MYOD1-sekvensen.
OBS: MYOD1-sekvensen kan detekteras inklämt mellan retrovirala vektorsekvenser när kloning i fusion lyckas. - För retroviral produktion, utsäde förpackningscellerna vid 50.000 celler / cm2 på 10 cm kollagen-belagda plattor och kultur i DMEM med 10% FBS fuktad vid 37 °C och 5% CO2 för 24 h.
- När förpackningscellerna förökar sig till 80 % konfluensitet, blanda 30 μg MYOD1-insatta retrovirala vektorer, 30 μg förpackningsvektorer och transfinfektionsreagens som innehåller cellpenetrerande peptid (Tabell över material) genom att virvla och ruva dem i 10 minuter.
- Tillsätt den ruvade blandningen till förpackningscellernas medium och odlingen fuktad vid 37 °C och 5 % CO2.
OBS: Kollagen beläggning är nödvändig. Transfection kan vara bättre vid 24 h eller mer efter sådd eftersom förpackningsceller lätt lossna från kulturplattan. - Efter 4 timmar eller över natten, ändra mediet till färskt tillväxtmedium.
- Samla viral supernatant och ersätta med färskt medium på 24 och 48 h efter cotransfection och kombinera supernatant.
- För att koncentrera virussupernatanten, blanda det med koncentratorreage och inkubera vid 37 °C över natten, sedan centrifugera vid 1 500 x g i 45 min vid 4 °C.
- Filtrera retrovirussupernatanten genom ett PVDF-filter med 0,45 μm porer.
- Kontrollera titern på den retrovirala vektorn med hjälp av en kvantitativ PCR-sats och termisk cycler system enligt tillverkarens anvisningar.
- Dela upp den virala supernatanten i små alikvoter och lager för dem vid -80 °C.
3. Infektion med MYOD1-retroviral vektor i UDCs
- Så frön udcs på 3.000-5.000 celler / cm2 på en gelatin-belagda 60 mm maträtt.
- Efter 24 h sådd, infektera det tinade retroviruset (steg 2.21) vid en flerstång av infektionen på 200 genom att tillsätta hexadimethrinebromid vid en koncentration av 8 μg/ml.
- Efter en 24 h inkubation fuktad vid 37 °C och 5% CO2,byt ut odlingsmediet med färskt tillväxtmedium som innehåller 1 μg/ml puromycin för att välja MYOD1-lyducerade celler. MYOD1 Byt medium varannan dag.
OBS: Vid val av MYOD1-positivaceller används vanligtvis 1 μg/ml puromycin för val. Lämplig dos bör bestämmas. Använd en platta som innehåller oöversatta celler och välj den dos som dödar alla celler på 3−5 dagar. MYOD1-positivaceller bör väljas inom 7−10 dagar efter tillsats av puromycin. MYOD1-transducedUDCs kan lagras i flytande kväve.
4. Myogenic differentiering av MYOD1-transduced UDCs behandlas med 3-deazaneplanocin En hydroklorid (DZNep)
OBS: Nyligen har det rapporterats att DZNep, en histon metyltransferashämmare, avsevärt skulle kunna främja uttrycket av MYOGENIN, en av de sena muskel reglerande faktorer, och även leda till myotube differentiering7.
- Platta MYOD1-transduced UDCs i kollagen-belagda brunnar med en densitet på 3,5 x 104 celler / cm2. Odling fuktad vid 37 °C och 5% CO2.
- Efter 24 h, ändra tillväxtmediet till differentiering medium består av hög glukos DMEM med L-alanin-L-glutamin, 5% häst serum, DESS tillägg, 1 μg/mL doxycyklin och 5 μM DZNep.
OBS: DZNep-lösningen på 10 mM kan förvaras vid -80 °C i 3 månader. Använd en avfrostningsfrys och undvik upprepade frys-töcykler. Både MYOD1 aktiveras av doxycyklin och DZNep undertrycka spridning och främja myogenic differentiering av UDCs. Därför rekommenderas att doxycyklin och DZNep tillsätts efter induktion av myogenic differentiering. DZNep främjar myogenic differentiering av MYOD1-UDCspå ett dosberoende sätt. Å andra sidan visar det cytotoxicitet vid en hög koncentration. Bestäm därför lämplig koncentration av DZNep, från 1−10 μM beroende på dess effekter på myogenic differentiering och cellulär biotillgänglighet. - Efter 3 dagar, ändra differentiering mediet till färsk differentiering medium utan DZNep. Byt sedan medium var tredje dag.
OBS: UDCs säkring till varandra och bilda myotubes inom 1−2 veckor efter differentiering.
5. Exon hoppa i MYOD1-konverteradeUDCs
OBS: Här beskrivs tre protokoll för att utvärdera exon hoppa i patient-härledda celler: 1) omvänd transkriptas polymeras kedjereaktion (RT-PCR) av dystrophin mRNA; 2) semiquantification av restaurerade dystrophin protein signal av västra blot; och 3) semiquantification av restaurerade dystrofierande fluorescens signal genom immunocytochemistry. Alla metoder kan upptäcka exon hoppa på ett dosberoende sätt.
- Utvärdering av exon hoppa effektivitet av RT-PCR
- Att transfect antisense oligonukleotid (ASO) till MYOD1-konverteradeUFC som erhållits från DMD-patienter dag 7 efter differentiering, blanda ASO, transfection reagens (Tabell över material), och differentiering medium till en slutlig koncentration av 1−10 μM. Kultur fuktad vid 37 °C och 5% CO2.
- Efter 72 h inkubation med ASO, ändra mediet till färsk differentiering medium utan ASO.
- Från 3−7 dagar efter ASO-transfktion, ta bort differentieringsmedium och tvätta 1x med PBS. Tillsätt celllysbuffert, lysa UDCs och skörda det totala RNA med hjälp av en RNA extraktionssats.
- Mät RNA-koncentrationen med en spektrofotometer.
- Kombinera de reagenser som krävs för enstegs RT-PCR-reaktion i PCR-rör enligt tabell 5.
- Placera PCR-rören med blandningen i en thermocycler. Kör termohjulet enligt tabell 6.
- Utför mikrochipelektrofores och beräkna exonhoppningseffektiviteten med molkoncentrationen enligt nedan.
Exon hoppa effektivitet (%) = hoppade band / (hoppat över band + icke-skippade band) x 100
OBS: Förvara PCR-produkten i kylskåp vid 4 °C för kortvarig förvaring eller -20 °C för långtidsförvaring.
- Upptäckt av dystrofi efter exon hoppa av västra blotting
- Transfect ASO och kultur MYOD1-UDCs enligt steg 5.1.1 och 5.1.2.
- Byt medium var tredje dag.
- Efter 2 veckors differentiering, extrahera det totala proteinet från de odlade cellerna med hjälp av radioimmunoprecipitation analys (RIPA) buffert som innehåller proteashämmare.
- Sonicate lysates på is och centrifug vid 14.000 x g för 15 min vid 4 °C .
- Samla supernatant och bestämma proteinkoncentrationer med hjälp av en BCA proteinanalys kit.
- Tillsätt 15 μg totalt protein i ett 0,5 ml-rör och späd genom att lägga till RIPA-bufferten som innehåller proteashämmare till en total volym på 10 μL. Kör 15 μg totalt protein per körfält.
- Tillsätt provbuffert, minskande medel och avjoniserat vatten enligt tabell 7. Denature cellen lysates vid 70 °C i 10 min.
- Förbered den trisacetatgående bufferten som innehåller 8,95 g/L tricine, 6,06 g/L tris bas, 1,0 g/L natriumdykesulfat (SDS).
- Fyll provet (20 μL) på trisacetat 3−8% gel och utför elektrofores vid 150 V i 75 min.
- Förbered läskebufferten utan metanol.
- Blötlägg PVDF-membranet i 20 s i metanol och sedan i läskbufferten tills det används (minst 10 min). Skär PVDF-membranet till en storlek på 6 x 8 cm med minigeler och 8 x 12 cm med midi geler.
- Skär läskpapper till samma storlek som PVDF membran och blöt dem i blotting buffert tills användning.
- Efter elektrofores, skär gelen till samma storlek som PVDF-membranet och blötlägg gelen i destillerat vatten.
- Placera läskpapper, PVDF-membran och gel på halvdryöverföringsapparaten (figur 1). Överför vid 4 mA/cm2 i 30 min.
- Skölj membranet 2x med destillerat vatten.
- Förbered antidystrofi (1:500) och anti-α-tubulin (1:1200) antikropp som de primära antikropparna.
- Förbered HRP-konjugerad antimusantikropp (1:100) som en sekundär antikropp.
- Inkubera membranen med de primära antikropparna, tvätta med tvättbuffert och inkubera sedan med den sekundära antikroppen med hjälp av en automatiserad västerländsk bearbetningsanordning (Tabell över material) vid rumstemperatur.
OBS: Anti-α-tubulinantikropp används vanligtvis som lastningskontroll. De blandade primära antikroppslösningarna, inklusive 1:500 antidystrofier och 1:1 200 anti-α-tubulinantikroppar fungerar bra när antikroppsreaktionen utförs samtidigt. - Skölj membranet i destillerat vatten.
- Detektera proteinerna med hjälp av detektinerbara detektionsreagens och en ccd-kamerabaserad bildapparat (Charge-coupled device).
- Analysera data med lämplig programvara.
- Detektion av dystrofi efter exon hoppa av immunocytochemistry
- Direkt programmera udcs i myotubes i kollagen-belagda 96 väl platta enligt steg 4.1−4.3.
- Transfect ASO och kultur MYOD1-UDCs enligt steg 5.1.2 och 5.1.3.
- Efter 2 veckors differentiering, tvätta cellerna med PBS och fixera dem i 4% paraformaldehyd i 10 min vid 4 °C.
- Permeabilize MYOD1-UDCs i 0,1% nonionic tvättmedel för 10 min vid rumstemperatur och blockera dem med 10% get serum i 15 min vid 37 °C.
- Inkubera cellerna med en primär antikropp över natten vid 4 °C.
- Tvätta cellerna med PBS och inkubera dem med sekundär antikropp i 30 min vid rumstemperatur.
OBS: Här används musantidystrophin (1:30) som primär antikropp, antimus IgG används som sekundär antikropp och Hoechst (1:10 000) används för kärnfläcksfärgning. - Avbilda plattorna med hjälp av ett fluorescerande mikroskop och använd en analysator för att halvkvantifiera fluorescenssignalen automatiskt i varje brunn under samma skick.
Representative Results
Vi skulle kunna samla in UDCs enkelt och icke-invasivt. UDC bildade kolonier inom en vecka efter start primära cell kultur observerade vi en markant proliferative förmåga. Kulturen av UDCs var enkel, och bakteriell eller svamp kontaminering var sällsynt när förfarandet utfördes korrekt.
Figur 2 visar representativa faskontrastbilder av UDC-kolonin en vecka efter primärkulturen(figur 2A)och MYOD1-UCCen vecka efter differentiering (figur 2B). Figur 3 visar framgångsrik upptäckt av exon hoppa i UDCs erhållits från DMD patienter av RT-PCR. Figur 3A visar RT-PCR analys av dystrophin efter antisense oligonukleotid behandling i DZNep-behandlade MYOD1-UDCshärrör från en 6-årig hane med en exon 45-54 borttagning i DMD genen. Den öppna läsramen återställdes genom att exon 44 hoppade över. Dag 14 efter differentiering bekräftade vi induktionen av exon hoppa på ett dosberoende sätt (figur 3B). De övre banden betecknar inhemska produkter och de nedre banden betecknar exon 44-överhoppade produkter som återställde den öppna läsramen.
Figur 4 visar framgångsrik upptäckt av dystrofi efter exon hoppa i UDCs erhålls från DMD patienter av västra blotting på ett dosberoende sätt. Vi upptäckte också det restaurerade dystrofiinuttrycket med hjälp av immunocytokemi (figur 5). Vi mätte intensiteten av dystrofin med ett fluorescerande mikroskop 1 vecka efter antisense oligonukleotid (ASO) transfection på en 96 väl platta (Figur 5A). Markant högre fluorescerande signaler observerades i MYOD1-UDCsbehandlas med ASO än i MYOD1-UDCsbehandlas med kontroll ASO (figur 5B).
Dessa resultat tyder på att vår nya analys kan utvärdera exon hoppa effektivt i MYOD1-UDCserhålls från DMD patienter på mRNA och proteinnivå.
Figur 1: Schematisk representation av överföringsstacken för semidry Western blot. Två papper indränkta i blotting buffert fastställdes vid den negativa terminalen, och två papper indränkt i bufferten var staplade ovanpå detta. Gelen, som har blötlagts i bufferten, lades försiktigt över PVDF membranet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa bilder av de regionala rådgivande nämnderna. (A)Fas-kontrast bild av UDCs en vecka efter primär kultur. Skalfält = 200 μm. Infälld: En förstorad bild av området i den vita rektangeln. (B)Fas-kontrast bild av MYOD1-UDCsen vecka efter differentiering. Skalstång = 50 μm. Denna siffra har ändrats från Takizawa et al.7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Framgångsrik utvärdering av exon hoppa i urin-härledda celler (UDCs) som erhållits från DMD patienter av RT-PCR. (A)RT-PCR analys av dystrophin efter antisense oligonukleotid behandling i 3-deazaneplanocin En hydroklorid (DZNep)-behandlade MYOD1-UDCshärrör från Duchennes muskeldystrofi (DMD) patient med en exon 45-54 borttagning. DZNep-behandlade MYOD1-UDCsbehandlades också med kontroll antisense vid 1-10 μM koncentration som kontroller. De övre banden var oskipade produkter (Ex 45-54 radering) som förblev utanför läsramen. De lägre banden var de exon 44-överhoppade produkterna (Ex 44-54-borttagning och Ex 44 hoppade över) som återställde den öppna läsramen. (B) Hoppa effektivitet beräknades som (exon 44-skippade avskrift molarity)/(native + exon 44-skipped transkriptonulleritet [märkt med pilar]) x 100% med hjälp av ett mikrochip elektrofores system. Enkelriktad ANOVA följt av Bonferronis post hoc-test användes för att jämföra hoppa över effektivitetsvinster (n = 3 för varje grupp, ****P < 0,0001). Uppgifterna uttrycks som medelvärdet ± SEM. Denna siffra har ändrats från Takizawa et al.7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Framgångsrik utvärdering av exon hoppa i urin-härledda celler (UDCs) från DMD patienter av västra blot. (A)Representativ Western blot för dystrophin i DZNep-behandlade MYOD1-UDCsfrån DMD patient med en exon 45-54 borttagning efter exon 44 hoppa. För dystroin detektering, anti-dystrophin (mot C-terminal) användes. ( B) De relativa intensiteterna hos de band som normaliserades till α-tubulin uttryck jämfördes i patient-härledda celler med och utan antisense oligonukleotid behandling genom att utföra enkelriktad ANOVA följt av Bonferronis post hoc-test (n = 3 för varje grupp, ** P < 0,01, *** P < 0,001, HI = friska enskilda). Denna siffra har ändrats från Takizawa et al.7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Heatmaps av immunocytochemistry för dystrophin efter antisense oligonukleotid behandling i DZNep-behandlade MYOD1-UDCserhållits från DMD patient med exon 45-54 borttagning. (A) Radering av exon 45-54 återställde den öppna avläsningsramen baserat på exonhoppning av exon 44. ( B) Signalintensiteten kvantifierades med hjälp av ett fluorescerande mikroskop efter 1 veckas antisense oligonukleotid transfection på en 96 brunnsplatta. Enkelriktad ANOVA följt av Bonferronis post hoc-test användes för jämförelsen (n = 3-4 för varje grupp, ****P < 0,0001). Denna siffra har ändrats från Takizawa et al.7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Volym | Slutlig koncentration |
| 2x PCR premix | 12,5 μl | 1x (1x) |
| Framåt primer | 17:00 | 0,2 μm |
| Omvänd primer | 17:00 | 0,2 μm |
| Mall | 80 ng (80 ng) | |
| Steriliserat destillerat vatten | upp till 25 μL | |
| Total volym per reaktion | 25 μl |
Tabell 1: Blandning för MYOD1-förstärkning av RT-PCR.
| 98 °C | 10 s | |
| 55 °C | 10 s | } 35 cykler |
| 72 °C | 10 s |
Tabell 2: Villkor för termisk cycler för MYOD1 förstärkning.
| Reagens | Volym |
| 10x K-buffert | 2 μl |
| Retroviral vektor (500 ng/μL) | 2 μl |
| Begränsning enzym 1 (2−15 U) | 1 μl |
| Begränsning enzym 2 (2−15 U) | 1 μl |
| Steriliserat destillerat vatten | 14 μl |
| Total volym | 20 μl |
Tabell 3: Blandning för ett rör att smälta retroviral vektor.
| Reagens | Volym |
| Renat MYOD1-fragment | 100 ng (ng) |
| Smält retroviral vektor | 100 ng (ng) |
| 5x Enzym premix | 4 μl |
| Steriliserat destillerat vatten | upp till 20 μL |
| Total volym | 20 μl |
Tabell 4: Blandning för kloning av fusioner.
| Lösning | Volym/reaktion (μL) | Slutlig koncentration |
| RNase-fritt vatten | Variabel | - |
| Rt-PCR-buffert i ett steg | 4 | 1x (1x) |
| dNTP-blandning (innehållande 10 mM för varje dNTP) | 0.8 | 400 mM för varje dNTP |
| Framåt primer (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Omvänd primer (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Enzymblandning i ett steg RT-PCR | 0.8 | - |
| Rnase-hämmare (tillval) | Variabel | 5−10 enheter/reaktion |
| Mall RNA | 50−400 ng | |
| Total volym | 20 |
Tabell 5: Nödvändiga föreningar för en reaktion av rt-PCR i ett steg.
| 1 cykel | Omvänd transkription | 30 min | 50 °C |
| 1 cykel | Inledande PCR-aktiveringssteg | 15 min | 95 °C |
| 1 cykel | Denaturering | 1 min | 94 °C |
| Glödgning | 1 min | 60 °C | |
| Förlängning | 1 min | 72 °C | |
| 1 cykel | Slutlig förlängning | 7 min | 72 °C |
| Hålla | ∞ | 4 °C |
Tabell 6: Termisk cykelförhållanden för ett steg RT-PCR.
| Reagens | Volym |
| Protein (15 μg) | 10 μl |
| Exempelbuffert (4x) | 5 μl |
| Minskande medel (10x) | 2 μl |
| Avjoniserat vatten | 3 μl |
| Total volym | 20 μl |
Tabell 7: Beredning av prover för natriumdykesulfatepolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE).
Discussion
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll av exon hoppa i MYOD1-konverteradeUDCs erhållits från DMD patienter. Med hjälp av analyssystemet, screenade vi optimala antisense sekvenser effektivt. Vi antar att MYOD1-konverteradeUDCs kan vara användbart för undersökning av patofysiologiska av sjukdomen.
Utvärdering av exon hoppa med hjälp av patient-härledda celler på mRNA-nivå är oumbärlig för screening nya läkemedel och bedöma patientens behörighet innan de genomför kliniska prövningar. Beräkning av exon hoppa effektivitet kan endast utvärderas på en mRNA-nivå.
Utvärdering av exon hoppa på proteinnivå är också viktigt eftersom dystrofier restaurering är viktigt som ett surrogat biomarkör att förutsäga fördelarna med exon hoppa. Hittills är screening av antisense oligonukleotid sekvenser utförs ofta med primära muskel cellinjer eller förevigade myoblast cellinjer inklusive mänskliga rhabdomyosarcoma (RD) celler, men vi kan inte mäta återvinning av dystrofinnivåer med hjälp av muskel cellinjer eller RD cellinjer eftersom de uttrycker detta protein endogent. Vi kan tydligt upptäcka återställandet av dystrofi i DMD patient-härledda MYOD1-UDCspå ett dosberoende sätt. I vår nya analys anser vi att utvärderingen av restaurerat protein genom västerländsk blotting är överlägsen i kvantifierbarhet. Å andra sidan, utvärdering av immunocytochemistry med 96 väl plattor är idealisk för screening många kandidat föreningar samtidigt.
I den här artikeln beskriver vi ett detaljerat protokoll för en effektiv modellering DMD muskel med MYOD1-konverteradeUDCs tillsammans med RT-PCR, västra blotting och immunocytochemistry att utvärdera återställda dystrophin på mRNA och proteinnivåer efter exon hoppa. UDCs kan samlas in noninvasively och lätt. Därför antar vi att den helt nya in vitro-analysen kan tillämpas på ett brett spektrum av grundläggande och translationella studier oavsett vilken typ av muskelsjukdomar.
Disclosures
National Center of Neurology and Psychiatry utvecklar nu NS-065/NCNP-01, en exon 53 hoppa över läkemedel för DMD, med Nippon Shinyaku Co, Ltd
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Scientific Research (C) [anslag nr 18K07544 till Y.A.], Bidrag till forskning om nervösa och psykiska störningar [bidrag nr. 28-6 till Y.A.], och Japan Agency for Medical Research and Development [anslag nr 18ek0109239h0002, 18lm0203066h0001 och 18lm0203069h0001 till Y.A.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
| Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
| Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
| Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
| BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
| CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
| E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
| EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
| fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
| GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
| High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
| HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
| Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
| Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
| iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
| iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
| Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
| In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
| MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
| MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
| NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
| Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
| One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
| pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
| Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
| REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
| REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
| Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
| Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
| Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
| Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
| Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |
References
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 (2011).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
- Antoury, L., et al. Analysis of extracellular mRNA in human urine reveals splice variant biomarkers of muscular dystrophies. Nature Communications. 9, 3906 (2018).
- Rahmoune, H., et al. Glucose transporters in human renal proximal tubular cells isolated from the urine of patients with non-insulin-dependent diabetes. Diabetes. 54, 3427-3434 (2005).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. The Journal of Urology. 180, 2226-2233 (2008).
- Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9, 3807 (2019).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7, 2080-2089 (2012).
- Chen, W., et al. Skeletal myogenic differentiation of human urine-derived cells as a potential source for skeletal muscle regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11, 334-341 (2017).
- Kim, E. Y., Page, P., Dellefave-Castillo, L. M., McNally, E. M., Wyatt, E. J. Direct reprogramming of urine-derived cells with inducible MyoD for modeling human muscle disease. Skeletal Muscle. 6, 32 (2016).
