Summary
Neurodegenerative sygdomme er forbundet med dysregulerede mikrogliafunktioner. Denne artikel skitserer en in vitro assay af fagocytose af neuroblastom celler ved iPSC-makrofager. Kvantitative udlæsninger af mikroskopi er beskrevet for både live-celle time-lapse imaging og fast celle højindhold billeddannelse.
Abstract
Microglia orkestrere neuroimmune reaktioner i flere neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom og Alzheimers sygdom. Microglia rydde op døde og døende neuroner gennem processen med efferocytose, en specialiseret form for fagocytose. Fagocytosefunktionen kan forstyrres af miljømæssige eller genetiske risikofaktorer, der påvirker mikroglia. Dette papir præsenterer en hurtig og enkel in vitro mikroskopi protokol til undersøgelse af mikroglial efferocytose i en induceret pluripotente stamcelle (iPSC) model af mikroglia, ved hjælp af en menneskelig neuroblastom celle linje (SH-SY5Y) mærket med en pH-følsomme farvestof til fagocytisk last. Proceduren resulterer i et højt udbytte af døde neuroblastomceller, som viser overfladefosfatylserin, anerkendt som et "spis-mig" signal af fagocytter. 96-brønd plade assay er velegnet til live-celle time-lapse imaging, eller pladen kan med succes fastsættes forud for yderligere behandling og kvantificeret ved højindhold mikroskopi. Mikroskopi med højt indhold med fast celle gør det muligt at skaleres analysen op til screening af små molekylehæmmere eller til vurdering af den fagocytiske funktion af genetiske variant iPSC-linjer. Mens denne analyse blev udviklet til at studere fagocytose af hele døde neuroblastomceller ved iPSC-makrofager, kan analysen let tilpasses til andre laster, der er relevante for neurodegenerative sygdomme, såsom synaptosomes og myelin og andre fagocytiske celletyper.
Introduction
Microglia er hjernevæv-resident makrofager, og deres funktioner omfatter immunovervågning, koordinere inflammatoriske reaktioner på skade / infektion, synaptisk remodeling, og fagocytose af døde celler, myelin, protein aggregater, og patogener. Phagocytose er den proces, hvorved mikroglia genkender last med overfladereceptorer og reorganiserer deres cytoskeleton for at opsluge objektet til en fagocsome, som derefter smelter sammen med lysosomer til nedbrydning af lasten. Sunde mikroglia phagocytose apoptotiske hjerneceller til at fjerne dem, før de bliver nekrotiske1. Fagocytose af apoptotiske celler er også kendt som efferocytose, og kræver visning af en fosfattidylserin "eat-me" signal af den døende celle2. Talrige mikroglia receptorer direkte binde sig til fosfattidylserin, herunder TIM-4, BAI1, Stabilin-2, og TREM2. Mikrogliale TAM-receptorer (f.eks. MERTK) og integriner binder sig indirekte til fosfattidylserin ved hjælp af tilbehørsproteinerne GAS6 eller MFG-E8. Andre "eat-me"-signaler kan være nødvendige for anerkendelse af døende celler, disse omfatter ændringer i glykosylation eller ladning af overfladeproteiner; ekspression af intracellulære proteiner ICAM3, calreticulin, annexin-I ved celleoverfladen oxideret LDL; eller belægning af apoptotiske celler med mikroglia-produceret komplement C1q1,2.
Neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, frontotemporal demens, og amyotrofisk lateral sklerose har været forbundet med svækkelse af microglia funktion, herunder en ophobning af hjerneaffald produkter såsom døde celler, myelin fragmenter, og protein aggregater, og overdrevne inflammatoriske reaktioner på disse stimuli3. Fagocytose kan være nedsat i neurodegenerative sygdomme og bidrage til patologien på grund af en kombination af aldring, betændelse eller specifikke genetiske risikovarianter4,5. På den anden side er der også beviser fra dyremodeller af neurodegenerative sygdomme, at mikroglia uhensigtsmæssigt kan phagocytose levedygtige neuroner eller synapser6,7,8. Mekanismen vil sandsynligvis blive anstiftet af fosfattidylserin display af beskadigede neurites, som er direkte fornemmes af mikroglial fagocytose receptorer TREM2 eller GPR56, eller indirekte fornemmes ved opløselig supplement C1q belægning fosfatylserin-beriget membran, hvilket fører til CR3-medieret phagocytose9,10,11.
In vitro-analyser af fagocytosefunktion, f.eks. for at vurdere den fænotypiske virkning af en genetisk risikovariant i mikroglia, udføres ofte ved hjælp af ikke-fysiologiske laster som latexperler4. Fluorescerende mærkede bakterier og zymosaner anvendes også, som er fysiologiske, men ikke relevante for neurodegenerative sygdomme. Ikke-fysiologiske fagocytiske laster kan bruges til at opdage defekter i de grundlæggende maskineri af fagocytisk opslugning, men undlader at præcist model det første "anerkendelse" skridt i fagocytose af apoptotiske neuroner. Størrelsen, formen, stivheden og typen af last dikterer også de intracellulære signalveje, der aktiveres, hvilket fører til forskellige resultater af mikrogliaaktiveringstilstand. For eksempel er E.coli-bakterier små og stive, i modsætning til menneskelige celler, og lipopolysaccharider på deres overflade genkendes af Toll-lignende receptor 4 (TLR4), der aktiverer fagocytose og proinflammatoriske signalveje2,12.
I forbindelse med neurodegenerative sygdomsundersøgelser ville en mere relevant fagocytisk last have fosfatylserindisplay på pattedyrs plasmamembraner og ideelt set være menneskelige og neuronale for at inkludere signaler, som mikroglia sandsynligvis vil støde på. Til denne fagocytose protokol, den menneskelige neuroblastom celle linje SH-SY5Y blev valgt som en neuron model, der er let at kultur. Permanent overfladephosphatidylserin display blev kunstigt induceret af paraformaldehyd, som tidligere har vist sig at forårsage fosfattidylserin visning af blodplader13. For mikroglia celle model menneskelige iPSC-makrofager blev anvendt, som efterligner ontogeny og transcriptional profil af menneskelige mikroglia, og er fagocytisk kompetente14,15,16,17. iPSC-makrofager er ikke den mest autentiske mikroglia-model, der findes, f.eks. man kan dog erstatte det med en mere autentisk monokultur iPSC-model af mikroglia, hvis det ønskes, såsom Haenseler et al.15. Humane iPSC-modeller er at foretrække frem for primær gnavermikroglilia til undersøgelse af neurodegeneration på grund af bekymringer om den begrænsede overlapning af mikroglia-transskriptionsmoduler observeret hos human versus mus neurodegenerative sygdomsvæv18. De døde SH-SY5Ys er plettet med en syre-følsomme farvestof, fluorescer svagt ved neutral pH og stærkere inde i fagagolyomer af iPSC-makrofager efter fagocytose. Ved hjælp af et syrefølsomt farvestof forbedres nøjagtigheden af detektering af fagocytiske hændelser med alsidighed til forskellige udlæsninger af levende og faste makrofager19. Denne protokol skitserer både live-celle time-lapse imaging af fagocytose, og en fast højindhold imaging assay for phagocytose, med de samme celle forberedelse trin før udlæsning (Figur 1).
Figur 1: Skemat diagram over metodologi. Omrids af fagocytoseanalysen, hvor fremstilling af SH-SY5Ys og farvning af iPSC-makrofagerne udføres parallelt, og derefter ledes SH-SY5Y'erne på iPSC-makrofagerne. Enten udføres levende celletidsfordårlig billeddannelse med det samme, eller cellerne inkuberes ved 37 °C/5% CO2 i den krævede varighed og fastsættes, før der udføres mikroskopi med højt indhold. PFA: paraformaldehyd, HBM: phenol rød-fri HEPES-buffered medier, pHr: pH-følsomme rød fluorescerende farvestof STP Ester løsning, PRFMM: phenol rød-fri makrofag medier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
Protokollen følger retningslinjerne for brug af menneskelige iPS-cellelinjer, der er afledt ved University of Oxford, Oxford Parkinson's Disease Centre (Ethics Committee: National Health Service, Health Research Authority, NRES Committee South Central, Berkshire, UK (REC 10/H0505/71)). Humane iPSC'er skal håndteres i et klasse II-sikkerhedskabinet for at beskytte arbejdstageren mod mulige utilsigtede agenter. Lokale, nationale og EU's sundheds- og sikkerhedsbestemmelser skal overholdes. Cellekulturmediekompositioner er beskrevet i tabel 1, og alle materialer er angivet i den supplerende materialetabel.
1. Cellekultur forud for eksperiment
- Kultur iPSC'er i iPSC-medier (tabel 1) i 6-brøndsplader forovertrukket med en hESC-kvalificeret kældermembranmatrix, subkonfluent og ved et lavt passagetal.
- Differentiere menneskelige iPSCs til iPSC-makrofag prækursorer: frø fire millioner iPSC i en microwell lav-tilslutning 24-brønd plade med 2 mL embryoid krop medier (Tabel 1) for at fremme embryoid kropsdannelse og udføre 75% medieændringer dagligt i 5-6 dage. Overførsel af embryonale organer til T175 kolber, ca. 150 embryonale organer pr. kolbe, der indeholder 20 mL fabriksmedier (tabel 1). Foder ugentligt ved tilsætning af 10-20 mL fabriksmedier.
BEMÆRK: iPSC-makrofag prækursorer dukker op i supernatanten efter ca. 2-3 uger og produceres kontinuerligt i flere måneder. Til dette eksperiment er det at foretrække at bruge celler fra ca. 6 uger efter, at differentieringsfabrikkerne er oprettet. Tidligere høstede iPSC-makrofager kan bevare en vis proliferativ kapacitet og er mindre klæbende, forhindrer selv såning ved en lav celletæthed. En øvre aldersgrænse for fagocytose kapacitet er ikke blevet fastlagt. - Differentiere iPSC-makrofag prækursorer til iPSC-makrofager: høst prækursorer ved at fjerne den nødvendige mængde supernatant; passere det gennem en 40 μm celle si til at fjerne klumper; centrifuge ved 400 x g i 5 min til pelletceller og genanvendes i makrofagsmedier (Tabel 1). Frø iPSC-makrofager ved 20.000-30.000 celler pr. brønd i en 96-brøndvævskultur (TC)-behandlet mikroplade med sorte brøndvægge og en optisk klar bund i 100 μL makrofagmedier pr. Brønd. Undgå kant brønde og fylde disse med PBS; dette er vigtigt for at reducere effekten af fordampning på analysen. Der skelnes i 6-10 dage ved inkubation ved 37 °C/5 % CO2.
BEMÆRK: Til denne analyse blev iPSC-linjen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) anvendt; En anden iPSC-linje kan dog erstattes. - Vedligehold SH-SY5Ys til sub-sammenløb i T75 kolber med 20 mL SH-SY5Y medier (Tabel 1), passaging hver 3-4 dage.
| Navn | Basismedie | Tilsætningsstof, endelig koncentration |
| iPSC-medier | mTeSR1 | - |
| Embryoid Body medier | mTeSR1 | BMP4, 50 ng/mL |
| VEGF, 50 ng/mL | ||
| SCF, 20 ng/mL | ||
| Fabriksmedier | XVIVO15 | GlutaMAX, 2 mM |
| Penicillin, 100 enheder/mL | ||
| Streptomycin, 100 μg/mL | ||
| 2-Mercaptoethanol, 50 μM | ||
| IL-3, 25 ng/mL | ||
| M-CSF, 100 ng/mL | ||
| Makrofagsmedier | XVIVO15 | GlutaMAX, 2 mM |
| Penicillin, 100 enheder/mL | ||
| Streptomycin, 100 μg/mL | ||
| M-CSF, 100 ng/mL | ||
| SH-SY5Y medier | DMEM/F12 | Føtalt kvæg serum, 10% |
| Penicillin, 100 enheder/mL | ||
| Streptomycin, 100 μg/mL |
Tabel 1: Medieopskrifter.
Bestanddele af cellekulturmedier, der anvendes i protokollen. Yderligere oplysninger om mediekomponenterne findes i materialetabellen.
2. Forberedelse af døde SH-SY5Ys
- I et biologisk sikkerhedsskab i klasse II adskilles SH-SY5Ys ved tilsætning af 4 mL af en celle dissociationsbuffer, der indeholder rekombinante trypsinlignende enzymer og 1,1 mM EDTA (se Materialetabel), som straks skal fjernes, så mindre end 1 mL forbliver som en tynd filmbelægning af cellerne. Inkuberes i 2-3 min ved 37 °C/ 5% CO2.
- Tilsæt 10 mL HBSS til T75-kolben for at skylle, og pipette SH-SY5Ys i et 15 mL konisk centrifugerør. Centrifuge ved 400 x g i 5 min. Aspirere supernatanten og suspendere cellerne igen i 2 mL af phenol rødfri HEPES-buffered medier (se Materialetabel). Sørg for at genbruge pellet omhyggeligt, pipetter med en 100-1.000 μL pipette til at bryde op klumper før fiksering.
- Fix celler ved at tilføje 2 mL af 4% paraformaldehyd (endelig koncentration 2%) til røret. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur med lejlighedsvis blid omrøring af røret.
- Tilsæt 10 mL HBSS til røret. Centrifuge ved 1.200 x g i 7 min og re-suspendere i 2 mL af phenol rød-fri HEPES-buffered medier.
BEMÆRK: Efter trin 2.4 kan det faste SH-SY5Y-præparat kvalitetsstyres ved farvning med annexin V-FITC for at vise tilgængelig fosfattidylserin og propidium-jod for at måle celleigennemtrængelighed med en flowcytometriudlæsning. Sammenlign den faste forberedelse med levende SH-SY5Ys opnået fra trin 2.2. Se afsnit 7 og supplerende figur S1. Opbevaring af de faste SH-SY5Y'er efter trin 2.4 anbefales ikke, da dette ikke er blevet vurderet.
3. Mærkning af døde SH-SY5Ys med pH-følsomme rød fluorescerende farvestof
- Efter trin 2.4 tælle cellerne, og fjerne det samlede antal celler, der kræves i en 2 mL lavt protein-bindende rør. For hver 1 million SH-SY5Ys udgør den samlede volumen i 2 mL-røret til 300-500 μL med phenol rødfri HEPES-buffered medier. Rørrøret opvarmes kortvarigt i et vandbad på 37 °C.
- Rekonstruer det pH-følsomme røde fluorescerende farvestof STP ester (se Materialetabel) og tilsæt 12,5 μg farvestof pr. million SH-SY5Y til det varme 2 mL rør af celler. Bland forsigtigt ved pipettering. Inkuber røret ved stuetemperatur i 30 min, beskyttet mod lys.
BEMÆRK: STP-esterarten af det pH-følsomme farvestof reagerer med primære aminer, og mærkningsbufferen må derfor ikke indeholde frie aminer. På grund af potentielt begrænset opløselighed i vandige buffere tilsættes det DMSO-opløste farvestof kun til varm vandig buffer, blandes straks og undersøger for tegn på bundfald (mørke partikler under et lysmikroskop). - Der tilsættes 1 mL HBSS og centrifuge ved 1200 x g i 7 min ved 4 °C. Kassér supernatanten, og vask med 2 mL HBSS. Gentag centrifugeringen.
- Kassér supernatanten, og ophæng cellerne igen i phenolrødfri makrofagsmedier (se Materialetabel) i en koncentration på 200.000-1,2 millioner celler/mL, så 50 μL er 10.000-60.000 celler (dvs. 0,5x-3x flere SH-SY5Ys end iPSC-makrofager).
BEMÆRK: Phenol rød i medierne øger baggrund fluorescens og derfor en phenol rød-fri medier bør anvendes, hvis levende celle billeddannelse skal udføres. Opbevaring af de farvede SH-SY5Ys i mere end et par timer anbefales ikke, da dette ikke er blevet vurderet. Hold farvede SH-SY5Ys på is og beskyt mod lys.
4. Farvning af iPSC-makrofager
- I et biologisk sikkerhedskabinet skal du forberede en opløsning i makrofagsmedier af et dybt rødt fluorescerende, celle-permeant, kortfattet esterreaktivt farvestof (se Materialetabel). Tilføj Hoechst 33342 (se Materialetabel). Varm arbejdsopløsningen op til 37 °C i et vandbad.
- Aspirere iPSC-makrofag medium forsigtigt ved pipetter cellen supernatant med en multikanal pipette i et sterilt reservoir. Der tilsættes 70 μL/brønd af farveopløsningen, der fremstilles i trin 4.1, til iPSC-makrofager ved hjælp af en multikanalpipette. Inkuberes i 1 time ved 37 °C/5% CO2.
- Forbered eksperimentelle behandlinger i phenol rød-fri makrofag medier. Medtag 10 μM cytochalasin D som en negativ kontrolbehandling. Postinkubation aspirerer iPSC-makrofagsmediet meget forsigtigt med en multikanalpipette, og tilsæt 100 μL/brønd af Hanks bufferede saltvandsopløsning (HBSS) til vask. Fjern straks HBSS ved skånsom pipettering, og tilsæt derefter 100 μL medieforbindelser ± forbindelser. Inkuberes i 10 min-1 time ved 37 °C/ 5% CO2.
BEMÆRK: Cytochalasin D er en potent actinhæmmer og blokerer fagocytose. For forsøgsbehandlinger, der kræver længere inkubation, f.eks. 24-72 h, udføres den eksperimentelle behandling før trin 4.1 ved hjælp af 100 μL/brønd af behandling i fuld makrofagsmedier. Følg trin 4.1-4.3 i henhold til protokollen, så cellefarvning udføres, og efterfølgende anvendes behandlingen igen i phenolrødfri makrofagsmedier for resten af phagocytoseanalysen.
5. Imaging fagocytose
Nedenfor er to forskellige fagocytose udlæsningsmetoder, skal du vælge underafsnit 5.1 eller 5.2.
- Live-celle time-lapse imaging
- Før fagocytose skal du tænde for mikroskopet til samcelletidsfordedende billeddannelse (se Materialetabel), computer, miljøkammer og CO2-gas. Åbn billedoptagelsessoftware. Kontroller, at DAPI-, RFP- og CY5-lyskuberne er installeret i mikroskopet. Klik på Time Lapse | Inkuber | Gør det muligt for miljøkammeret og vælg opvarmning til 37 °C med CO2-gas, og sørg også for, at luftfugtigheden afvælges. Der skal gå 30 min, før mikroskopet opvarmes til 37 °C.
- Under inkubationen af forbindelsen ved trin 4.3 skal iPSC-makrofagpladen ind i mikroskopet.
- Klik på billede | Fang | Fartøjsekspert. Vælg Well Plate og vælg en 96-brønd pladetype.
- Under fanen Billede skal du tænde fasekanalen og justere grov og fin fokusering ved hjælp af de lodrette skydere, så cellerne er i fokus. Juster belysningsniveauet med den vandrette skyder. Klik på DAPI-, RFP- og CY5-kanalerne, og juster belysningsniveauet for hver kanal.
- Klik på Kalibrer fartøjsjustering under fanen System, og følg skærminstruktionerne.
- Klik på Time Lapse | Rutiner | Opret ny rutine. På det første skærmbillede i guiden Tid bortfalderskal du navngive rutinen . Klik på Næste. Vælg 20x-målsætningen på det andet skærmbillede, vælg Monokrom hentning, og vælg kanalerne DAPI, RFP, CY5 og Phase. Vælg ikke følgende indstillinger: Automatisk søgning efter eksempel, auto fin fokus, Z-Stack, Auto belysning. Klik på Næste.
- På den næste skærm oprette et fyrtårn i midten af hver brønd, som vil gøre det muligt for mikroskopet at vende tilbage til de samme koordinater med de samme belysningsindstillinger for hver gang-punkt. Fokus- og belysningsindstillingerne for hvert beacon er uafhængige. Hvis du vil indstille et fyrtårn: Træk den blå cirkel til placeringen på pladekortet, brug den grove og fine fokus lodrette skyder, og når du er tilfreds, skal du klikke på Tilføj beacon. Beacon-indstillinger kan opdateres senere ved hjælp af knappen Opdater markeret.
- Når du er klar til at starte phagocytoseanalysen, skal du fjerne analysepladen og placere den i et biologisk sikkerhedsskab. Brug en multikanal pipette til at tilføje 50 μL SH-SY5Ys per brønd, tilføje til siden af hver brønd på kanten af væsken.
- Læg pladen i mikroskopet og vent ca. 30 min på, at det termiske skift ekvilibreres.
BEMÆRK: I løbet af de første 30 min, at pladen er i mikroskopet, vil den skiftende temperatur af assaypladen få fokus til at skifte. Hvis pladen ikke får lov til at ekvilibrere, skifter de optagne billeder ud af fokus i løbet af tidsforskydningen. - Klik på hvert fyrtårn og opdater fokusindstillingen. Klik på Næste. Vælg filformatet TIFFpå det næste skærmbillede i guiden Tid bortfalder, aktiver indstillingen Gem individuelle kanaler, og aktiver indstillingen Opret video for hvert beacon, og tillad indstillingerne nedenfor Medtag følgende oplysninger som et vandmærke. Klik på Næste.
- Indstil antallet af scener til 1. Klik på Næste. Indstil varigheden og intervallerne for time-lapse, f.eks. 3 timer og billeddannelse hvert 5. minut. Vælg ikke Kun Hent én ramme. Klik på Næste.
- Aktiver miljøkammeret med en temperatur på 37 °C og CO2 (fugtighed er valgfri for korte eksperimenter). Klik på Næste to gange. Vælg en sti til lagring af dataene. Klik på Næste. Klik på Start for at starte time-lapse.
- Billedbehandling med højt indhold i fast celle
- Brug en multikanal pipette til at tilføje 50 μL af de mærkede SH-SY5Ys per brønd, tilføje til siden af hver brønd på kanten af væsken. Inkuberes ved 37 °C/ 5% CO2 i 3-5 timer.
- Efter fagocytose inkubation, forsigtigt aspirere celle supernatants ved pipettering med en multikanal pipette, og kassere. Vask én gang med 100 μL PBS.
- Pladen fastgøres ved tilsætning af 100 μL på 2% paraformaldehyd, inkuberes i 15 min ved stuetemperatur.
- Aspirere brønde og tilsæt 100 μL PBS. Dæk med pladeforsegling og folie; opbevares ved 4 °C, indtil det er nødvendigt.
BEMÆRK: Analysepladen kan opbevares på denne måde i mindst en uge uden væsentlig signalforringelse. længere lagerplads ikke er blevet testet. - Tænd mikroskopet billeddannelse med højt indhold (se Materialetabel), og åbn billedoptagelsessoftwaren. Læg analysepladen i mikroskopet ved at klikke på belastningsikonet øverst på skærmen.
- Vælg fanen Installation. Vælg den relevante pladetype i rullemenuer øverst til venstre: Vælg den relevante pladetype, vælg indstillingen To spids (standard),vælg målsætningen 40x Vand, NA1.1, vælg konfokal tilstand, og vælg placering af 1.
- Skyl 40x vandmålet før brug via menuen Indstillinger.
- Brug ikonet + i feltet Kanalvalg til at tilføje kanalerne DAPI, Alexa 647 og Alexa 568. Indstil disse til at måle på et enkelt plan på 1 μm. Optimer tids- og strømindstillingerne for analysepladens farvningseffektivitet.
BEMÆRK: Som en retningslinje, indstille DAPI på 200 ms eksponering og 100% magt, Alexa 647 på 1500 ms eksponering og 100% magt, og Alexa 568 på 100 ms eksponering og 40% magt. - Sørg for, at kanalerne ikke måles samtidigt ved at klikke på Kanalsekvensen for at adskille kanalerne.
- Under navigation | Definer layout, vælg måletjerne, og vælg 9-12 felter pr. brønd.
- Under opsætningen skal du klikke på et repræsentativt felt på pladekortet og kontrollere hver målekanal igen for at sikre, at farvningen er til stede, og at billederne er fokuseret, ved at justere kanalforskydningen.
- Hvis data skal uploades til en server til fjernanalyse, skal du klikke på feltet Onlinejob og det relevante skærmnavn. Dette vil gøre det muligt automatisk at overføre dataene til en server efter billeddannelse.
- Gem analyseprotokollen ved at klikke på knappen Gem.
- Klik på fanen Kør eksperiment øverst, og navngiv eksperimentpladen, og klik derefter på Start.
6. Dataanalyse
Nedenfor er to forskellige dataanalysemetoder, vælg underafsnit 6.1, hvis underafsnit 5.1 blev fulgt, eller vælg underafsnit 6.2, hvis underafsnit 5.2 blev fulgt.
- Analyse af fagocytose billeder opnået ved live-celle time-lapse mikroskop
- Hent og installer den anbefalede open source-software (se Materialetabel). Åbn softwaren.
- Vælg Billederi feltet Inputmoduler .
- Åbn mappen med data i Windows Stifinder,der indeholder undermapper med navnet Beacon-1, Beacon-2 osv. Marker og træk alle Mapperne Beacon til listen Filer.
- Vælg Metadatai feltet Inputmoduler . Hvis du vil udtrække metadata?, skal du vælge Ja. Vælg Udpakning af fil-/mappenavnei rullemenuen ud for Metode til udpakning af metadata. Vælg Mappenavnfor metadatakilden. Klik på forstørrelsesglasset til højre for regulære udtryk, og skriv ".*[\.*](? P
.*)$ " i regex-tekstboksen (undtagen anførselstegnene). Klik på Send. Hvis du vil udtrække metadata fra, skal du vælge Alle billeder. Klik på Opdater nederst på skærmen. Billederne vil nu blive grupperet efter beacon. - Vælg NavneOgTyperi feltet Inputmoduler . Følgende proces gør det muligt at tildele billeder for hvert timepunkt til den korrekte fluorescenskanal. Tildel et navn til Regler for billedmatchning (rullemenu). Vælg regelkriterierne svarer til Alle (rullemenu) i følgende regler. Fil (rullemenu), Gør (rullemenu), Indeholder (rullemenu), DAPI (tekstboks). Navn, der skal tildeles disse billeder DAPI (tekstboks). Vælg billedtypen Gråtone Image (rullemenu). Angiv intensitetsområde fra Billedmetadata (rullemenu).
- Klik på Tilføj et andet billedenederst på skærmen, og gentag trin 6.1.5. Erstat DAPI med RFP, så RFP-billederne er grupperet.
- Gentag trin 6.1.6 for CY5-kanalbillederne.
- Klik på Opdater nederst på skærmen, billedfilerne vil nu blive opført i tre kolonner mærket DAPI, RFP og CY5.
- Vælg Grupperi feltet Inputmoduler . Vælg Ja for Vil du gruppere billederne? Vælg Beaconi rullemenuen for Metadatakategori.
- Højreklik på det hvide område i feltet Analysemoduler for at oprette en liste over alle moduler.
- Klik på Tilføj | Billedbehandling | EnhanceOrSuppressFeatures. Vælg DAPI på den første rulleliste som inputbillede. Navngiv outputbilledet som "DAPIspeckles". Vælg operationstypen Forbedr og funktionstypen Specklesmed en funktionsstørrelse på 20 pixel. Vælg hastigheds- og nøjagtighedsindstillingen Hurtig/sekskantet.
- Opret et nyt modul. Tilføj | Objektbehandling | IdentificerPrimaryObjects. Vælg DAPIspeckles på den første rulleliste som inputbillede. Navngiv de primære objekter "Nuclei". Input den typiske diameter af objekter som 10 til 35 pixel enheder; denne parameter kan optimeres. Vælg tærskelstrategien Global, tærskelmetoden RidlerCalvard, udjævningsmetoden Automatisk, og giv tærskelkorrektionsfaktoren som 12 med nedre og øvre grænser 0-1. Rediger metoden for at skelne klumpede objekter til Figur, men lad andre parametre være ved standardindstillingerne.
BEMÆRK: IPSC-makrofagkernerne er groft segmenteret i trin 6.1.12 efter et billedbehandlingstrin, der reducerer diameteren og øger kontrasten mellem kernerne. Det er vigtigt, at kun de lyseste kerner er valgt, da SH-SY5Ys vil dukke op som svagere kerner og blive forvekslet som iPSC-makrofager ellers. Hvis du vil justere den andel af kerner, der er valgt, skal du øge eller reducere tærskelkorrektionsfaktoren. I testfasen skal du sammenligne det resulterende kernevalg med et fasebillede af beaconet, hvor det er let at skelne mellem iPSC-makrofag og SH-SY5Y ved hjælp af cellemorfologi. - Opret et nyt modul. Tilføj | Billedbehandling | CorrectIlluminationCalculate. Vælg CY5 på den første rulleliste som inputbillede. Navngiv outputbilledet "IllumCY5". Vælg Baggrund i rullemenuen for Vælg, hvordan belysningenskal vælges. Lad de andre parametre være ved standardindstillingerne.
- Opret et nyt modul. Klik på Tilføj | Billedbehandling | CorrectIlluminationApply. Vælg CY5 på den første rulleliste som inputbillede. Navngiv outputbilledet "CorrCY5". Vælg IllumCY5 i rullemenuen for Vælg belysning. Vælg Del i rullemenuen for Vælg, hvordan belysningenskal vælges.
BEMÆRK: Formålet med trin 6.1.13-6.1.14 er at korrigere variationen i baggrundsbelysningen af CY5-billederne, hvilket ellers ville forstyrre korrekt cellesegmentering. - Opret et nyt modul. Klik på Tilføj | Objektbehandling | IdentifySecondaryObjects. Vælg CorrCY5 på den første rulleliste som inputbillede. Vælg Kerner som inputobjekter. Navngiv de sekundære objekter "Mac". Vælg identifikationsmetoden som Afstand - B. Vælg tærskelstrategi Global, tærskelmetoden RidlerCalvard, udjævningsmetoden Ingen udjævning, og giv tærskelkorrektionsfaktoren som 1 med nedre og øvre grænser 0-1. Lad andre parametre være ved deres standardindstillinger.
BEMÆRK: Dette cellesegmenteringstrin kan kræve optimering ved at justere tærskelkorrektionsfaktoren for at vokse eller formindske cellegrænser. Segmentering effektivitet kan også forbedres ved at øge styrken af iPSC-makrofag farvning, eller belysning af CY5 lys terning under billeddannelse. - Opret et nyt modul. Klik på Tilføj | Billedbehandling | EnhanceOrSuppressFeatures. Vælg RFP på den første rulleliste som inputbillede. Navngiv outputbilledet som "FilteredRFP". Vælg operationstypen Forbedr og funktionstypen Specklesmed en funktionsstørrelse på 15 pixel. Funktionsstørrelsen kan optimeres. Vælg hastigheds- og nøjagtighedsindstillingen Hurtig/sekskantet.
- Opret et nyt modul. Klik på Tilføj | Objektbehandling | IdentificerPrimaryObjects. Vælg FiltreretRFP på den første rulleliste som inputbillede. Navngiv primære objekter "pHr". Indtast den typiske diameter af objekter som 5-20 pixel enheder. Vælg tærskelstrategien Manuel, og skriv en tærskel manuelt, f.eks. Rediger metoden for at skelne klumpede objekter til Figur, men lad de andre parametre være ved standardindstillingerne.
BEMÆRK: SH-SY5Ys er blevet segmenteret i trin 6.1.17 efter et billedbehandlingstrin, der reducerer diameteren og øger kontrasten i punkttaen. Det er afgørende at udføre manuel for tærskeling, da intensiteten af det pH-følsomme farvestof stiger over tid i fagocytterede partikler, og andre for tærskelstrategier kunstigt vil oppuste antallet af pH-følsomme farvepunkt i tidlige tidspunkter. Manuel tærskeling skal justeres for hver efterfølgende eksperimentel gentagelse ved hjælp af testtilstanden. - Opret et nyt modul. Klik på Tilføj | Objektbehandling | RelateObjects. Vælg de underordnede inputobjekter pHr i rullemenuen. Vælg de overordnede inputobjekter Mac i rullemenuen. Vælg Ja for Beregn pr. overordnet middel for alle underordnede målinger? Beregn ikke overordnede afstande (Ingen).
BEMÆRK: Trin 6.1.18 relaterer det pH-følsomme farvesignal til iPSC-makrofagerne, hvilket gør det muligt at måle det gennemsnitlige antal fagocytosede objekter pr. iPSC-makrofag. - Opret et nyt modul. Klik på Tilføj | Filbehandling | ExportToSpreadsheet. Vælg kolonneafgrænseren som tabulator, og tilføj et præfiks for filnavne for at angive beacon-nummeret. Vælg specifikke målinger til eksport som angivet nedenfor (trin 6.1.19.1 - 6.1.19.4); andre parametre ved deres standardindstillinger.
- Billede | Tæl | Vælg pHr og Mac
- Billede | Filnavn
- Billede | Gruppe
- Mac | Børn | Phr
- Klik på Vis outputindstillingeri feltet Output . Opret en ny mappe på skrivebordet til dette eksperiment, og angiv den som standardoutputmappe.
- Gem | rørledningsfil SaveProject som....
- Test og optimer pipelinen på et repræsentativt billede ved at klikke på Start testtilstand i nederste venstre hjørne. Programmet vælger automatisk det første billede til test, og hvert trin i pipelinen kan ses ved at klikke på øjensymbolerne, hvilket gør outputtet synligt og derefter klikke på Kør. Hvis du vil ændre det beacon, der bruges til test, skal du klikke på Test | på øverste menulinje Vælg Billedgruppe. Hvis du vil ændre billedet (tidspunktet) i et beacon, skal du klikke på Test | på den øverste menulinje Vælg Billedsæt. Parametre, der skal optimeres, er angivet i de foregående trin.
- Når du er tilfreds med pipelinen, skal du klikke på Afslut testtilstand og klikke på de åbne øjesymboler for at lukke dem. Gem rørledningen. Klik på Analyser billeder for at starte den fulde billedanalyse.
- De tekstfiler, der genereres, kan åbnes som et regneark med den relevante regnearkssoftware, og filen med navnet "Billede" indeholder en række for hvert billedtidspunktpunkt, hvor kolonnerne repræsenterer parametre.
BEMÆRK: Count_Mac og Count_pHr repræsenterer antallet af iPSC-makrofager og antallet af identificerede pH-følsomme objekter i et billede. Brug ikke Count_pHr data, da optællingen omfatter svagt fluorescerende SH-SY5Ys, der ikke er blevet phagocytosed. Kolonnen Mean_Mac_Children_pHr_Count tager det gennemsnitlige antal fagocyste pHr-objekter pr. Mac (trin 6.1.18 RelateObjects) for et enkelt billede, dvs. - Arranger dataene, så hvert beacon er en separat kolonne i regnearket, billederne arrangeret som rækker af kronologisk rækkefølge, med forskellige parametre, der optager forskellige ark i regnearksprojektmappen.
- Multiplicer de mål, der Mean_Mac_Children_pHr_Count med Count_Mac, for at generere parameteren Antal pletter pr. billede. Beregn middelværdi Count_Mac for hvert beacon. Divider antallet af pletter pr. billede med den gennemsnitlige Count_Mac for det pågældende beacon, hvilket genererer parameteren Antal pletter pr. celle.
BEMÆRK: Trin 6.1.26 korrigerer eventuelle fejlagtige udsving, der kan forekomme i antallet af iPSC-makrofag (Count_Mac), ved at normalisere dataene til det gennemsnitlige antal iPSC-makrofag på tværs af alle tidszoner i et beacon. - Tildel tiden siden fagocytose begyndte (i min) til hver billedrække.
- Generer midler og standardafvigelse for replikerede brønde/beacons. Graf antallet af pletter pr. celle (y-akse) mod tiden (x-akse) for at visualisere hastigheden af fagocytose.
Figur 2: Cellesegmentering i phagocytoseanalysen med højt indhold. Illustration til at demonstrere god versus dårlig segmentering af en iPSC-makrofag i umiddelbar nærhed af en ikke-fagocytosed SH-SY5Y, med en anden SH-SY5Y fuldt phagocytosed. Med begge celletyper vist med grå er iPSC-makrofagscellekanten afgrænset af computeranalysen skitseret (blå). SH-SY5Ys, der tælles som fagocytose begivenheder er skitseret grøn eller skitseret rød, hvis udelukket fra analysen. Billedet i midten viser dårlig segmentering; iPSC-makrofaget har suboptimal afgrænsning, der omfatter den ikke-fagocytosede SH-SY5Y inden for cellekanten, som tælles som en fagocytosehændelse. Billedet til højre viser god segmentering på grund af strengere parametre, der definerer iPSC-makrofagscellekanten, hvilket førte til, at den ikke-fagocytosede SH-SY5Y blev korrekt udelukket fra analysen. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Analyse af fagocytosebilleder opnået med mikroskop med højt indhold
- Log på den anbefalede billedbehandlingssoftware (se Materialetabel).
- Vælg mappen skærmnavn, og billedbehandlingskørslen i venstre menu. Klik på ikonet Billedanalyse (en skærm med et forstørrelsesglas). Vælg en repræsentant godt på pladelayoutet til opsætning af analysepipelinen.
- Den første analyse byggesten er input billede. Lad standardindstillingerne for stakbehandling (Individuelle planer) og flatfieldkorrektion (Ingen). Klik på tegnet + i øverste højre hjørne af blokken for at tilføje den næste dokumentkomponent, og vælg Find kerner.
- Angiv kanalen som DAPI, INVESTERINGSAFKASTpopulationen som Ingeni Find Kerner, metoden til segmentering som C. Metodeboksen indeholder en rullemenu, der gør det muligt at optimere parameteren med indstillinger for den fælles tærskel (dvs. 0,40) og område (dvs. >30 μm2). Navngiv outputpopulationen "Nuclei". Tilføj den næste byggesten ved at klikke på symbolet + og vælg Find Cytoplasma.
- I Find Cytoplasm, indstille kanalen som Alexa 647 og metoden som B. Metodeboksen indeholder en rullemenu, der gør det muligt at optimere parameteren med indstillinger for den fælles tærskel (dvs. 0,45) og den individuelle tærskel (dvs. 0,20). Tilføj den næste dokumentkomponent ved at klikke på symbolet + og vælge Vælg population.
BEMÆRK: Det er vigtigt at optimere cytoplasmasegmenteringen korrekt, så den udelukker tilstødende SH-SY5Ys, der ikke er blevet phagocytosed, men ikke udelukker fagocytosed last (se figur 2). - Behold standardindstillingerne, som vil være populationen Kerner, metoden Common Filters, et kryds for Fjern kantobjekterog outputpopulationen med navnet "Kernevalg" i Vælg population. Tilføj den næste dokumentkomponent ved at klikke på symbolet + og vælge Beregn morfologiegenskaber.
- Angiv populationen til Kernevalg i Egenskaber for Morfologi, området til Celle, metoden til Standard. I rullemenuen skal du sørge for, at område og rundhed er valgt (μm2). Navngiv outputpopulationen "Morfologicelle". Tilføj den næste dokumentkomponent ved at klikke på symbolet + og vælge Vælg population.
- Vælg populationen Kernevalgi Vælg population (2)og metoden Filter efter egenskaber. Vælg Morfologicelleområde [μm2]i rullelisten under Filter F1. Vælg > fra rullelisten til højre, og skriv 160 i feltet til højre for det. Navngiv outputpopulationen "Nuclei Selected 2". Tilføj den næste dokumentkomponent ved at klikke på symbolet + og vælge Find pletter.
BEMÆRK: Dette trin udelukker alle forkert segmenterede celler og døde celler fra yderligere analyse. Det kan være nødvendigt at optimere ved at øge eller reducere cut-off størrelse. - Vælg kanalen Alexa 568, investeringsafkastpopulationen Nuclei Selected 2, ROI-områdecellen , metode Bi Find pletter, og navngiv outputpopulationen "Spots". Metoden kan om nødvendigt optimeres ved hjælp af rullemenuen med indstillinger for detektionsfølsomhed (dvs. 0,20) og opdelingsfølsomhed (dvs. 0,400). Tilføj den næste dokumentkomponent ved at klikke på symbolet + og vælge Beregn morfologiegenskaber.
- Vælg populationspletterne , områdeplaceringerog metoden Standard i Beregn morfologiegenskaber (2). I rullemenuen skal du sørge for, at område og rundhed er valgt (μm2). Navngiv outputegenskaberne "Morfologiplet". Tilføj den næste dokumentkomponent ved at klikke på symbolet + og vælge Vælg population.
- Vælg populationspletterne og metoden Filter efter egenskaber i Vælg population (3). Vælg Staffageområde [px 2 ], >,20på rullelisterne under Filter F1. Vælg Staffageområde [px2], <, 2500på rullelisterne under Filter F2. Vælg Morfologisynrighed, >, 0,6på rullelisterne under Filter F3. Vælg Spot til områdeintensitet, >, 2,5på rullelisterne under Filter F4. Navngiv outputpopulationen "Udvalgte pletter". Tilføj den næste dokumentkomponent ved at klikke på symbolet + og vælge Vælg population.
BEMÆRK: Den automatiserede spot udvælgelse vil have segmenteret mange små fluorescerende pletter, der skyldes autofluorescent organer inden for iPSC-makrofager. Dette trin har til formål at bortfiltrere autofluorescent organer ved at anvende strenge cut-offs til området, rundhed, og intensiteten af pletter, og kan kræve en vis optimering. - Vælg populationen Kernevalgt 2 og metoden Filter efter egenskaber i Vælg population (4) . Vælg Antal pletter, >, 0,5på rullelisterne under Filter F1. Navngiv outputpopulationen "Spot positive celler". Tilføj den næste dokumentkomponent ved at klikke på symbolet + og vælge Definer resultater.
- Vælg den første metode som Liste over outputi Definer resultater. Standardindstillingen er, at antallet af objekter skal beregnes for hver population. Klik på rullemenuen for Population: Nuclei Selected 2 , og kontroller, at antallet af objekter er markeret, og vælg ALLEi rullemenuen Anvend på alle . For populationen Spot Positive Cellskal du kontrollere, at antallet af objekter er markeret. For de andre befolkninger er det ikke nødvendigt at rapportere nogen parametre. Vælg den anden metode som Formeloutput, og skriv formlen (a/b)*100. Vælg som variabel En spotpositiv celle - Antal objekter, og som variabel B skal du vælge Kerne markeret 2- Antal objekter. Navngiv outputtet som "Spot positive celler (%)".
- Gem pipelinen: Klik på ikonet Gem analyse på disken (en diskette med pil ned).
- Klik på ikonet Batchanalyse (et tragt- og tandhjulssymbol øverst på skærmen). Vælg den rå datafil fra de eksperimentelle mapper til venstre, som skal opdatere antallet af valgte målinger til 1. Klik på i rullemenuen for Metodei området Analyseindstillinger , og vælg Eksisterende analyse. Klik på ... ud for Scriptfil, og søg efter den gemte analysefil (suffikseret .aas). Klik derefter på den grønne pil ud for Start analyse. Analysefremskridtet kan overvåges ved at klikke på Jobstatus (i øverste højre hjørne af skærmen).
- Når analysen er fuldført, skal du klikke på fanen Eksporter, vælge eksperimentmappen og vælge en destinationsmappe. Lad standardindstillingerne, som eksporterer data, men ikke TIFF-afbildninger, og start eksporten.
- Åbn den hentede fil som et regneark i en passende regnearkssoftware. Brøndene er arrangeret i rækker og parametrene i kolonner. Marker dataene i kolonner med navnet Spot positive celler (%), Nuclei Markeret 2 - Antal pletter - Gennemsnit pr. brønd og Kernevalgt 2 - Samlet spotområde - Gennemsnit pr. Brønd, og kopier disse til friske regneark for hver parameter. Beregn parameterværdien for replikering af brønde af hver betingelse og graf efter behov.
7. Kvalitetskontrol assay for homogenitet af faste SH-SY5Ys
- Der opsamles en aliquot af levende SH-SY5Y'er fra trin 2.2 og genanvendes i bindingsbufferen annexin fra et sæt til bilag I V-FITC-farvning (se Materialetabel)i en koncentration på ca. 200.000 celler pr. mL.
- Der opsamles en aliquot af faste SH-SY5Y'er fra trin 2.4 og genanvendes i annexinbindingsbuffer i en koncentration på ca. 200.000 celler pr. ML.
- Der fremstilles to reagensglas med 5 μL bilag I V-FITC og 5 μL propidiumiodid (se materialetabellen). Der tilsættes 500 μL levende SH-SY5Ys til det ene rør og 500 μL faste SH-SY5Y'er til det andet.
- Forbered tre kontrolrør: et med 5 μL annexin V-FITC, et med 5 μL propidium jod og et rør tomt. Bland et 1:1-forhold mellem levende og faste SH-SY5Y'er, og tilsættes 500 μL af dette til hvert kontrolrør.
- Bland rør forsigtigt ved pipettering. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min, beskyttet mod lyset.
- Mål straks på et flowcytometer(Ex = 488 nm; Em = 530 nm) ved hjælp af FITC-signaldetektor (normalt FL1) til annexin V-FITC og phycoerythrin emissionssignaldetektor (normalt FL2) til propidium jod.
- Brug enhver flowcytometrianalysesoftware til at vise punktplotter af FITC vs PI-signal og bruge et rektangulært gatingværktøj til at vælge den dobbelt-negative population. Inden for den dobbelt-negative befolkning skal du vise FSC vs SSC og bruge et polygonalt gating-værktøj til at skabe en eksklusionsport omkring befolkningen med meget lav FSC og SSC, som er klassificeret som snavs og derfor udelukket fra yderligere analyse. Vis de resterende hændelser som FITC vs PI-signal, og brug de enkeltfarvede og ikke-farvede kontroller til at indstille en kvadrantport til FITC-/PI-, FITC+/PI-, FITC -/PI+og FITC+/PI+-hændelser.
BEMÆRK: Undgå hårdhændet håndtering, hvirvlende eller lange inkubationer med levende SH-SY5Ys, som kunstigt kan fremkalde fosfattidylserin display. Fortsæt med at flyde cytometri uden forsinkelse. Et ønskeligt resultat er, at andelen af FITC-/PI-hændelser er <5% i de faste SH-SY5Y'er. De repræsentative resultater fremgår af supplerende figur S1.
Representative Results
Live-celle time-lapse billeddannelse blev udført ved hjælp af den tidligere skitserede protokol, med vilde-type iPSC-makrofager seedet på 20.000 celler pr godt. Forskellige mængder sh-SY5Ys blev anvendt (10.000-30.000 pr. samt anslået fra celletallet i trin 3.1), og fagocytosehæmmeren cytochalasin D blev præinkuberet (1 h) med nogle brønde, der fungerede som en kontrol for at hæmme fagocytose for hver mængde SH-SY5Ys. Billedbehandling begyndte 40 min efter tilsætning af SH-SY5Ys og billeder blev taget med 5 min intervaller for de næste 3 h (data omfatter den første 40 min forsinkelse). En repræsentativ time-lapse-video medtages i de supplerende dataog analyseres kvantitative data, der vises i figur 3. Med mængden af 10.000 SH-SY5Ys pr. brønd steg antallet af fagocytosed partikler (pletter) pr. celle lineært med tiden og blev hæmmet af ca. 50% af cytochalasin D. Hæmningen ved cytochalasin D var svagere end forventet, sandsynligvis forårsaget af utilstrækkelige tekniske eller biologiske replikker, da kun en brønd pr. tilstand blev afbildet med tre billedfelter. Med højere mængder af SH-SY5Ys per brønd (20.000 og 30.000), phagocytose udstillet dårlig linearitet, sandsynligvis på grund af dårlig segmentering af iPSC-makrofager og SH-SY5Ys i en mere overfyldt synsfelt.
Fast celle højindhold billeddannelse blev udført ved hjælp af den tidligere skitserede protokol, med vilde-type iPSC-makrofager på 20.000 celler pr godt, flere forskellige mængder af SH-SY5Ys (10.000-80.000 per brønd), og analysen plade blev fastsat og afbildet efter 5 timer. Et repræsentativt billede af fagocytose præsenteres i figur 4A, og de analyserede data vist i figur 4B17. Forøgelse af mængden af SH-SY5Ys resulterede i et højere antal fagocytosed partikler (pletter) pr. celle; En fordobling af SH-SY5Y-mængden fører dog kun til en stigning på 1,5x i antallet af pletter pr. celle. Dette indikerer, at de testede mængder ikke er hastighedsbegrænsende for fagocytose. Efterfølgende blev phagocytoseanalysen med højt indhold valideret ved hjælp af flere hæmmere af fagocytose (Figur 4C)17. Actin polymeriseringshæmmerne cytochalasin D og jasplakinolid hæmmede signifikant fagocytose med henholdsvis 91% og 90%, når de præinkuberes i 1 time før fagocytose. Analysens robuste Z' ved cytochalasin D eller jasplakinolid anvendes som negativ kontrol beregnes som henholdsvis 0,7 og 0,8. Lysosomeforsuringshæmmeren bafilomycin A1 reducerede phagocytose betydeligt med 31%, når den inkuberede 1 time før fagocytose. Den svagere effekt af lysosome forsuring hæmmer versus actin hæmmere tyder på, at påvisning af den internaliserede last kan ikke kræve fuld forsuring af fagocsomet. Rekombinant annexin V blev brugt som en kontrol til specifikt at blokere fosfattidylserin eksponeret på overfladen af SH-SY5Ys, forhindrer fagocytiske receptorer i at få adgang til ligand, en vigtig "eat-me" signal. Tilsætning af rekombinant annexin V reducerede phagocytose betydeligt med 30%, når den tilsættes til brønde umiddelbart før SH-SY5Y-tilsætning. Faste SH-SY5Ys blev bekræftet at eksponere fosfattidylserin ved hjælp af en fluorescerende annexin V sonde, mens levende SH-SY5Ys var negative for annexin V farvning (Figur 4D).
Den mikrogliale fagocytosereceptor TREM2 har tidligere vist sig at være vigtig for fagocytose hos apoptotiske neuroner21. R47H-mutationen af TREM2 er et risikogen for sen debut af Alzheimers sygdom og er hypotese for at reducere ligandbindingen af TREM223. Med henblik på at vurdere fagocytisk funktion af R47H TREM2 og TREM2 KO blev den fastcellede højindholds phagocytoseanalyse udført ved hjælp af isogene iPSC-makrofagslinjer med WT/R47H/KO TREM217. Flere længder af fagocytose varighed fra 1 til 5 timer blev testet, ved hjælp af en forskudt tilsætning af fagocytisk last (40.000 SH-SY5Ys). Det resulterende signal øges lineært til 4 timer og udjævnes en smule ved 5 timer (Figur 5)17. Reduceret fagocytose og kapacitet (% spot positive celler) var tydelig i TREM2 KO sammenlignet med WT, mens R47H TREM2 mutanten ikke udviste ændret fagocytose. Den fagocytiske defekt i TREM2 KO-celler er ikke phenocopied af R47H TREM2 mutation, tilsyneladende fordi TREM2-funktionen er tilstrækkelig til at understøtte normal fagocytose.
Figur 3: Eksempeldata for live-celle time-lapse phagocytosis assay. Optagelse af døde SH-SY5Ys af vilde iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) afbildet med 5 min intervaller i 3 timer. Tider, der vises på grafen, er fra indledning af fagocytose, herunder de første 40 minutter uden måling. Det gennemsnitlige antal pletter pr. celle fra tre replikat brønde er afbildet. Fagocytose på 10.000 SH-SY5Ys hæmmes med 10 μM cytochalasin D med 1 h forbehandling, mens større mængder SH-SY5Ys (20.000 og 30.000) har suboptimal kvantificering af phagocytose. Gennemsnitlig ± standardafvigelse (SD), N = 1 eksperiment. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Optimering og validering af phagocytoseanalyse med fast celleindhold. (A) Repræsentativt mikroskopibillede med højt indhold af SH-SY5Ys fagocytosed af vilde iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). En 3 timers tid-punkt med 40.000 SH-SY5Ys er vist. Fluorescenskanaler flettes, med iPSC-makrofagsplet vist som rød, kerner som blå og SH-SY5Ys som gul. Indslagspanelet er en del af billedet forstørret 3x. (B) Antallet af pletter pr. celle af fagocytosed døde SH-SY5Ys efter 5 timer ved hjælp af forskellige mængder last ud over vilde iPSC-makrofager. Gennemsnitlig ± standardfejl i middelværdien (SEM) for N = 3 høst. (C) Fagocytose (3 h) hæmmes med 10 μM cytochalasin D (Cyt), 1 μM bafilomycin A1 (Baf), 1 μM jasplakinolide (med 1 h forbehandling; Jas) og 13 μg/ml rekombinant annexin V (tilsættes samtidig til de døde SH-SY5Ys; Ann). iPSC-makrofager uden tilsat SH-SY5Ys blev brugt som et negativt kontrolelement (-ve), og det positive (+ve) kontrolelement er ubehandlet iPSC-makrofager med SH-SY5Ys tilføjet. Data blev normaliseret til middelværdi for eksperimentet gentage. Midler ± SEM, for N = 3-6 høst og med to vilde cellelinjer (SFC840-03-03, karakteriseringen af denne linje er beskrevet i (Fernandes et al.21 og BIONi010-C). 1-vejs ANOVA med Dunnetts post hoc-test, sammenligninger med ubehandlede celler. * p < 0,05, *** p < 0,001. (D) Friskfast SH-SY5Ys plet ensartet for fosfattidylserin display (annexin V-FITC) og har begrænset celle permeabilitet (propidium jod). Live SH-SY5Ys pletter ikke for annexin V-FITC eller propidium jod, bortset fra fokal farvning til stede på de få døde celler i kulturen. Figurer gengives med tilladelse fra Alzheimers Forskning &Terapi17. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Fagocytose reduceres i TREM2 KO, men ikke i R47H TREM2 iPSC-makrofager. Højindhold fagocytose assay udført med 40.000 SH-SY5Ys per brønd med forskudte tilføjelser. Midlerne blev kvantificeret for parametrene: antal pletter pr. celle, summen af spotområder (μm2) pr. celle og procentdel af celler, der indeholder fagocytoserede partikler pr. felt. Data blev normaliseret til at betyde for hver genotype pr. eksperiment. Gennemsnitlig ± SEM, for N = 3 høst. Gentagne foranstaltninger 2-vejs ANOVA, Dunnett's post-hoc test, parvis sammenligninger med WT for hver gang: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Figurer gengives med tilladelse fra Alzheimers Forskning &Terapi17. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur S1: Eksempel QC for SH-SY5Ys forberedelse. Dissocierede SH-SY5Ys blev fastsat i 10 min med 0% (levende celler), 1% og 2% af paraformaldehyd (PFA), derefter vasket. Cellerne blev farves med annexin V-FITC og propidium jod (PI) og straks målt ved flowcytometri. Farvetæthed prik plots blev skabt i flow cytometri analyse software, ved hjælp af enkelt-farvede og unstained kontrol til at placere en kvadrant gate. Kvadranter er kommenteret med procentdelen af begivenheder inden for denne kvadrant. Levende celler er hovedsageligt i Q4, og faste celler er hovedsageligt i Q2. Q1 = bilag I V-/PI-, Q2 = bilag I V+/PI+, Q3 = annexin V+/PI-, Q4 = annexin V-/PI- (levende celler). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende video: Live-celle time-lapse phagocytosis. Repræsentativ time-lapse video af SH-SY5Ys fagocytosed af vilde-type iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Billeder blev taget hvert 5. minut i 3 timer. Video beskæres og kører med 3 billeder i sekundet, der viser de sidste 1,5 timer i analysen. De syrefølsomme farvestofplettede SH-SY5Ys vises med rødt, signalintensiteten øges med fagosomeforsuring. Cellekerner, der er plettet med Hoechst 33342, vises med blåt. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Microglia har vigtige funktioner, der påvirker indledningen og progressionen af neurodegenerative sygdomme, herunder fagocytose af apoptotiske neuroner. Nedsat mikroglial phagocytose og uhensigtsmæssig fagocytose af synapser har begge været forbundet med neurodegenerative sygdomme, selv om de underliggende mekanismer og årsagssammenhæng ikke er velforstået4,23. Dette papir skitserer en fagocytose assay til måling af fagocytose af apoptotiske celler ved iPSC-makrofager, med enten en levende celle time-lapse imaging udlæsning eller fast celle højt indhold mikroskopi, eller en kombination af begge på en enkelt analyse. Denne alsidighed betyder, at analysen kan bruges til at studere individuelle fagocytiske begivenheder over tid i et par brønde eller bruges til højindhold screening med flere betingelser eller behandlinger. Da analysen med højt indhold er fastgjort på et enkelt tidspunkt, kan flere analyseplader fremstilles samtidigt. Den højindhold assay har potentiale nytte til karakterisering makrofager / mikroglia med sygdomsrelaterede genetiske varianter eller screening små molekyle hæmmere for ændringer i fagocytose. Analysen kan også let tilpasses til at studere fagocytose af andre mikroglia modeller, eller potentielt astrocytter. Den phagocytose assay kan potentielt multiplexed med levende celle imaging pletter, f.eks mitokondrier, calcium, eller ROS indikatorer, og post-fiksering immunofluorescent farvning for proteiner-of-interesse kan udføres. Sammenlignet med eksisterende fagocytose assays, der udnytter apoptotiske neuronale celler, de vigtigste fordele, at denne protokol giver er, at forberedelsen af den fagocytiske last er relativt enkel og hurtig, og resulterer i et ensartet produkt. Andre analyser fremkalder apoptose af neuroner eller SH-SY5Ys med S-nitroso-L-cystein i 2 h25, okadainsyre i 3 h22, staurosporin i 4-16 h26,27,28,29 eller UV-bestråling i 24 timer30, og kan resultere i celler på forskellige stadier af apoptose. Desuden er live-celle billeddannelse og højt indhold billeddannelse udlæsninger ikke tidligere blevet beskrevet, så vidt forfatterne er klar over. Den største begrænsning ved at bruge paraformaldehyd-fiksering til at forberede den fagocytiske last er, at den ikke fuldt ud generobrer apoptoseprocessen, da fiksering forhindrer cellerne i at opdeles i apoptotiske kroppe, som sandsynligvis vil blive phagocytosed hurtigere på grund af deres mindre størrelse. Det vides ikke, hvilken effekt fiksering har på udskillelsen af nukleotid "find mig" signaler (f.eks ATP, UDP) fra målcellen, der tiltrækker fagocytter. Svarende til apoptotiske celler, de faste SH-SY5Ys udviser nogle membran permeabilitet til propidium jod. Membran permeabilitet er forbundet med frigivelsen af "find mig" signaler; Dette er dog ikke blevet undersøgt i de faste SH-SY5Ys, og hvis nukleotid frigives for hurtigt, vil de blive vasket væk, før SH-SY5Ys føjes til iPSC-makrofagerne.
Det første kritiske skridt i protokollen er farvning af døde SH-SY5Ys med en STP ester af en pH-følsomme rød fluorescerende farvestof. Dette farvestof reagerer hurtigt og kovalent med frie primære aminer på overfladen af de døde SH-SY5Ys. Varigheden af farvning behøver ikke at blive optimeret; Der skal dog udvises forsigtighed med håndtering af farvestoffet, inden mærkningen mærkes. Mærkningsreaktionen må ikke udføres i buffere, der indeholder frie aminer. Desuden er der risiko for nedbør, hvis DMSO-bestanden fortyndes i kold vandig buffer eller ved høj endelig koncentration. Bundfald vises som tætte mørke objekter under mikroskopet. Derudover klæber den pH-følsomme farveopløsning til almindelige plastcentrifugrør og vaskes langsomt af; Derfor anbefales lavbindende rør til mærkningstrinnet. Brug af et pH-følsomt farvestof, i stedet for et permanent fluorescerende farvestof, hjælper med at identificere opslugte partikler versus partikler, der nabo til plasmamembranen. Da der er en vis fluorescens ved neutral pH, skal tætheden af fagocytisk last og iPSC-makrofager holdes lav nok til nøjagtig segmentering, selv om den er høj nok til, at mange fagocytiske hændelser fanges. Mikroskopi med højt indhold var i stand til præcist at identificere fagocytose med en medium massefylde af last i brønden (mere end 2 SH-SY5Ys pr. iPSC-makrofag). Omvendt, på grund af svagere følsomhed af mikroskopet i det dybe røde spektrum, segmentering af iPSC-makrofager i live-celle time-lapse billeddata var mindre sikker, og det var nødvendigt at bruge en meget lav tæthed af last til at reducere sandsynligheden for falske positiver (1 SH-SY5Y for hver to iPSC-makrofager). Validering af korrekt segmentering og lasttæthed bør udføres med sammenligninger mellem ubehandlede og cytochalasin D-behandlede brønde. I en veloptimeret analyse, cytochalasin D bør reducere det gennemsnitlige antal pletter per celle med 90% i forhold til ubehandlede prøver.
Et andet vigtigt trin i protokollen er iPSC-makrofag farvning, som gør det muligt for cellen at blive identificeret og segmenteret i billedanalyse, således at eventuelle eksterne SH-SY5Ys er udelukket fra optællingen. Det anbefalede farvestof er cellepermeant, konverteret til et uopløseligt fluorescerende produkt inden for cytoplasmaet, fixable og ikke-giftigt (se Materialetabel). Farvningstrinnet blev optimeret til brug af iPSC-makrofager med højindhold imaging fagocytose assay, og vi foreslår, at det skal optimeres igen, hvis andre celletyper anvendes. Varigheden af cellefarvning kan øges for at forbedre aflejringen af det uopløselige fluorescerende produkt i cellerne. Hvis farvekoncentrationen optimeres, skal det sikres, at man undgår toksiske niveauer af det organiske opløsningsmiddelkøretøj.
Den tredje afgørende faktor for analysens succes er dataanalysen. De leverede analyserørledninger er beregnet til at være vejledende snarere end præskriptive, da forskelle i farvningsintensitet eller cellemorfologi kan reducere effektiviteten af segmentering af rørledningerne som skrevet. Der vil derfor være behov for visse optimeringer med test af pipelinen på passende positive og negative kontroller, og de parametre, der skal optimeres, er angivet i protokolteksten. Negative kontroller bør omfatte en tilstand, hvor iPSC-makrofager forbehandles med en potent fagocytosehæmmer, såsom cytochalasin D før tilsætning af SH-SY5Ys. En anden mulig negativ kontrol er tilsætning af SH-SY5Ys til tidligere ubehandlede brønde af iPSC-makrofager i slutningen af analysen, 10 minutter før fiksering, som tillader en vis afregning af lasten, men er for kort til en betydelig mængde fagocytose at forekomme. En fagocytosehændelse defineres som et rødt fluorescerende objekt inden for grænserne af en iPSC-makrofag, defineret af softwarealgoritmen ved hjælp af den dybe røde fluorescenskanal. Hvis segmentering af cellerne er dårlig (Figur 2), kan mange ikke-fagocytosed SH-SY5Ys i umiddelbar nærhed af iPSC-makrofager fejlagtigt indgå i analysen, dvs falske positiver. Den vigtigste faktor for at opnå god segmentering er streng afgrænsning af iPSC-makrofagerne. Segmentering for begge analyser er automatiseret, så det er ikke muligt at opnå perfekt segmentering for hver celle; Et par parametre kan dog justeres for at gøre segmentering mere optimal ved hjælp af et par testbilleder som reference. Cytochalasin D-styringen er vigtig for vurderingen af optimal segmentering, fordi et stort antal fagocytiske hændelser, der opdages i denne tilstand, indikerer, at segmentering er suboptimal. Optimering af dataanalysepipelinen bør ideelt set gentages, indtil antallet af fagocytiske hændelser pr. celle er 80%-90% lavere i cytochalasin D-tilstanden versus ingen hæmmer.
De problemer med fagocytoseanalysen, der er mest tilbøjelige til at forekomme, er: (1) svag pH-følsom fluorescens i positive kontroller, (2) sparsom eller ujævn fordeling af makrofager i slutningen af analysen eller (3) et højt antal falske positiver i analysen fra ikke-phagocytosed SH-SY5Ys. Fejlfinding af svag pH-følsom fluorescens bør først kontrollere, at farvning af SH-SY5Ys resulterede i en celle pellet med en stærk magenta farve. Hvis farven er svag, skal du sikre dig, at der anvendes et friskfarvelager, sikre, at mærkningsbufferen er aminefri, tilføje en ekstra vask til SH-SY5Ys før farvning, kontrollere, om det korrekte antal SH-SY5Y'er blev farvet, sikre, at der ikke er nogen farvetryk, og optimere mærkningskoncentrationen af farvestoffet. Hvis SH-SY5Ys er stærkt farvede, kontrollere, om koncentrationen tilsat til assay plade er korrekt, og sikre, at iPSC-makrofager er sunde og ikke for gamle. Den anden type problem, ujævn makrofagfordeling, kan skyldes tab af celler under pipettering, og der bør tages skridt til at reducere de pipetteringskræfter, som cellerne oplever, så man undgår smalborespidser. Hvis problemet forbliver, reducere inkubationstiden for lastning af iPSC-makrofager med cellepermeant farvestof. Det tredje problem med hensyn til fejlagtig optagelse af ikke-fagocyste partikler i analysen viser, at der er behov for mere optimering af analysepipelinen. Fejlfinding bør først og fremmest fokusere på cellesegmentering, og om softwaren indeholder tilstødende objekter. Specifikke parametre, der kan justeres, foreslås i noterne under de relevante trin (trin 6.1.11-6.1.15 for analyse af tidsfald med levende celler og trin 6.2.4-6.2.8 til analysen af højt indhold). Hvis cellesegmenteringen ikke kan forbedres yderligere, har analysen af højt indhold et ekstra trin (trin 6.2.8), der udelukker forkert segmenterede iPSC-makrofager. Desuden kan modulet, der filtrerer accepterede pletter af pH-følsom fluorescens i iPSC-makrofager, optimeres, hvilket øger tærskelintensiteten af accepterede objekter, hvilket skulle bidrage til at udelukke ikke-fagocytosed SH-SY5Ys (trin 6.1.17 til live-celle time-lapse-analysen og trin 6.2.11 til analysen med højt indhold).
Vi udviklede to typer af mikroskopi udlæsning for fagocytose assay, at hver har fordele og begrænsninger. Live-celle time-lapse imaging har den fordel at give ekstra information om fagocytose kinetik og er mere bredt tilgængelige end højt indhold billeddannelse platforme. Den anbefalede open source-software er agnostiker til mikroskopkilden og kan bruges med ethvert fluorescerende mikroskop af god kvalitet med eller uden live-celletidsforgang. Den vigtigste begrænsning af live-celle billeddannelse er begrænset følsomhed og optik, hvilket gør det mere udfordrende at opdage og udføre god segmentering af iPSC-makrofager. Denne begrænsning kan afhjælpes enten ved at øge varigheden af iPSC-makrofagfarvning eller ved at skifte til et mere følsomt mikroskop, hvis det er tilgængeligt. Den højindhold imaging fagocytose assay er den anbefalede udlæsning, hvis et højt indhold billeddannelsessystem er tilgængelig. Højindhold billeddannelsessystemer muliggør højere gennemløb og mere pålidelige data, gør det muligt at bruge denne analyse til screening, hvor en robust Z 'på ≥0,7 ville forventes for "antallet af pletter pr celle" output20. Sammenlignet med live-celle time-lapse metode, det høje indhold mikroskopi udlæsning har højere følsomhed, en højere grad af automatisering og hastighed, flere brønde og billedbehandling felter kan behandles, og høj opløsning confocal billeder er produceret. Cellesegmentering er mere effektiv med gode billeder, og segmentering er desuden hjulpet af højindhold billedanalyse software giver flere celle segmentering metoder egnet til stærkt uregelmæssigt formede celler. Den højindhold imaging analyse software også beregnet flere parametre for fagocytose, sammenlignet med open source-software, såsom procentdelen af fagocytiske celler. Den vigtigste begrænsning af højindhold fagocytose assay er en af omkostninger og tilgængelighed af billedbehandling system og analyse software.
Afslutningsvis er den kvantitative fagocytoseanalyse, der præsenteres i dette papir, et nyttigt værktøj til modellering af mikroglia-phagocytose af døde neuroner in vitro. Mikroglia er modelleret af iPSC-makrofager og de døde neuroner er modelleret af paraformaldehyd-faste SH-SY5Ys. Selvom det ikke er de mest autentiske mikroglia og døde / apoptotiske neuronmodeller offentliggjort, er disse nemme at forberede og skalerbare. Analysen selv er meget alsidig, med to typer af billedbehandling udlæsning detaljeret, og det har potentiale til at blive tilpasset til brug med forskellige microglia / makrofag monokultur modeller, eller en anden celletype til at fungere som fagocytisk last. Den højindhold imaging udlæsning er fordelagtigt for at opnå kvantitative data og kan skaleres op til assay små molekyle modulatorer af fagocytose, eller skærmen genetiske varianter i iPSC-makrofager. Men da højindhold billeddannelsessystemer er dyre og datatunge, er en alternativ billedbehandlingsudlæsning blevet inkluderet i protokollen ved hjælp af et live-celle time-lapse mikroskop, som kan erstatte ethvert konventionelt fluorescensmikroskop af god kvalitet, hvis det er nødvendigt.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Val Millar og Dr. Sohaib Nizami for deres hjælp med mikroskopi med højt indhold og Dr. Daniel Ebner for adgang til mikroskoper med højt indhold. Desuden forfatterne takke Dr. Emma Mead for assay udvikling rådgivning, og Fru Cathy Browne for iPSC støtte. Dette arbejde blev støttet af Alzheimers Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, tilskud reference ARUK-2020DDI-OX), med yderligere støtte til James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) fra Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award fra Parkinsons UK (J-1403); MRC Demens Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnerskab MR/N013255/1 og Momentum MC_PC_16034 Awards.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 352096 | For centrifugation of cells |
| 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes | |||
| 2-mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | Component of Factory media |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | J61899 | For fixation of cells |
| 6-well plate, tissue culture treated | |||
| AggreWell-800 24-well plate | STEMCELL Technologies | 34815 | Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies |
| Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit | Abcam | ab14085 | Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide. |
| Automated cell counter | |||
| Benchtop centrifuge | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | 96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay |
| CellProfiler software | Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0. | ||
| CellTracker Deep Red dye | Thermo Fisher | C34565 | Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media. |
| Class 2 laminar air flow safety cabinet | |||
| CO2 gas bottle | Accessory for EVOS FL Auto | ||
| CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2 | |||
| Columbus Image Data Storage and Analysis System | Perkin Elmer | Columbus | Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments. |
| Cytochalasin D | Cayman | 11330 | Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM. |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320074 | Component of SH-SY5Y media |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for CellTracker and pHrodo dyes |
| EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher | AMF4300 | Live-cell time-lapse imaging microscope |
| EVOS Light Cube CY5 | Thermo Fisher | AMEP4656 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Light Cube DAPI | Thermo Fisher | AMEP4650 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Light Cube RFP | Thermo Fisher | AMEP4652 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Onstage Incubator | Thermo Fisher | AMC1000 | Accessory for EVOS FL Auto |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | Component of SH-SY5Y media |
| Flow cytometer | |||
| Flow cytometry analysis software | |||
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413302 | hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-038 | Component of both Factory and Macrophage media |
| HBSS | Lonza | BE 10-547F | Hank’s balanced salt solution for washing steps |
| Human recombinant BMP4 | Gibco | PHC9534 | Component of Embryoid Body media |
| Human recombinant IL-3 | Gibco | PHC0033 | Component of both Factory and Macrophage media |
| Human recombinant SCF | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Component of Embryoid Body media |
| Human recombinant VEGF | Gibco | PHC9394 | Component of Embryoid Body media |
| Live Cell Imaging Solution | Thermo Fisher | A14291DJ | Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys |
| Low protein binding 2 mL tubes | Eppendorf | 30108.132 | For staining SH-SY5Ys |
| M-CSF | Thermo Fisher | PHC9501 | Component of both Factory and Macrophage media |
| mTeSR1 Medium | STEMCELL Technologies | 85850 | iPSC media |
| Multichannel 20-200 uL pipette | For liquid handling of 96-well plate | ||
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher | R37605 | Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media. |
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | HH14000000 | High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9. |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media |
| pHrodo iFL Red STP-Ester | Thermo Fisher | P36011 | pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution. |
| Serological pipette filler | |||
| T175 flask, tissue culture treated | Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories" | ||
| T75 flask | Vessel for SH-SY5Y culture | ||
| Transparent plate sealers | Greiner Bio-One | 676001 | For assay plate storage and transportation |
| TrypLE Express (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat. |
| Water bath, set to 37°C | |||
| X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red | Lonza | BE04-418F | Component of Factory and Macrophage media |
| X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red | Lonza | 04-744Q | Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors |
References
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
- Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease. Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).
- Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).
- Brown, G. C., Neher, J. J. Microglial phagocytosis of live neurons. Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).
- Scott-Hewitt, N., et al. Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia. The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).
- Li, T., et al. A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding. The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Skjesol, A., et al. The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2. PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).
- Wong, K., Li, X., Ma, Y. Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets. Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).
- van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), (2013).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
- Hall-Roberts, H., et al. TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages. Alzheimer's Research & Therapy. 12, 151 (2020).
- Friedman, B. A., et al. Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).
- Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons. Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).
- Fernandes, H. J. R., et al. ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular α-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons. Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).
- Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2. Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).
- Kober, D. L., Brett, T. J. TREM2-ligand interactions in health and disease. Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Witting, A., Müller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).
- Hsieh, C. L., et al. A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).
- Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease. Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).
- Diaz-Aparicio, I., et al. Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome. Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).
- Shirotani, K., et al. Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Garcia-Reitboeck, P., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis. Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).
