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Neuroscience

आईपीएससी-मैक्रोफेज द्वारा डेड न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के फागोसिटोसिस के लिए इन विट्रो क्वांटिटेटिव इमेजिंग परख

Published: February 14, 2021 doi: 10.3791/62217
Automatic Translation
1,2,3, 2, 1, 2, 1
1James Martin Stem Cell Facility, Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, 2Alzheimer’s Research UK Oxford Drug Discovery Institute, Nuffield Department of Medicine Research Building, University of Oxford, 3UK Dementia Research Institute, Cardiff University

Summary

न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियां डिस्जेनिवली माइक्रोग्लिया कार्यों से जुड़ी होती हैं। यह लेख आईपीएससी-मैक्रोफेज द्वारा न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के फागोसिटोसिस की इन विट्रो परख को रेखांकित करता है। क्वांटिटेटिव माइक्रोस्कोपी रीडआउट्स को लाइव-सेल टाइम-लैप्स इमेजिंग और फिक्स्ड-सेल हाई-कंटेंट इमेजिंग दोनों के लिए वर्णित किया गया है ।

Abstract

माइक्रोग्लिया ने पार्किंसंस रोग और अल्जाइमर रोग सहित कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में न्यूरोइम्यून प्रतिक्रियाओं को आर्केस्ट्रा किया। माइक्रोग्लिया एफेरोसाइटोसिस की प्रक्रिया के माध्यम से मृत और मरने वाले न्यूरॉन्स को साफ करता है, जो फागोसिटोसिस का एक विशेष रूप है। फागोसिटोसिस फ़ंक्शन को पर्यावरण या आनुवंशिक जोखिम कारकों द्वारा बाधित किया जा सकता है जो माइक्रोग्लिया को प्रभावित करते हैं। यह पेपर एक मानव न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइन (एसएच-SY5Y) का उपयोग करके माइक्रोग्लिया के एक प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) मॉडल में माइक्रोग्लियल एफेरोसाइटोसिस का अध्ययन करने के लिए एक तेजी से और सरल इन विट्रो माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो फागोसिटिक कार्गो के लिए पीएच-संवेदनशील डाई के साथ लेबल किया जाता है। प्रक्रिया के परिणामस्वरूप मृत न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं की उच्च उपज होती है, जो सतह फॉस्फेटिडिलसेरीन प्रदर्शित करती है, जिसे फागोसाइट्स द्वारा "ईट-मी" संकेत के रूप में मान्यता प्राप्त है। 96-अच्छी तरह से प्लेट परख लाइव-सेल समय-चूक इमेजिंग के लिए उपयुक्त है, या प्लेट को उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी द्वारा आगे के प्रसंस्करण और मात्रात्मक से पहले सफलतापूर्वक तय किया जा सकता है। फिक्स्ड-सेल उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी छोटे अणु अवरोधकों की स्क्रीनिंग या आनुवंशिक संस्करण आईपीएससी लाइनों के फैगोसाइटिक कार्य का आकलन करने के लिए परख को बढ़ाया जा करने में सक्षम बनाता है। हालांकि इस परख को आईपीएससी-मैक्रोफेज द्वारा पूरे मृत न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं के फागोसिटोसिस का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, परख को आसानी से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों, जैसे सिनेप्टोसोम और मायलिन, और अन्य फागोसिटिक सेल प्रकारों के लिए प्रासंगिक अन्य कार्गो के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

माइक्रोग्लिया मस्तिष्क ऊतक-निवासी मैक्रोफेज हैं, और उनके कार्यों में प्रतिरक्षा निगरानी, चोट/संक्रमण, सिनेप्टिक रीमॉडलिंग, और मृत कोशिकाओं, मायलिन, प्रोटीन समुच्चय और रोगजनकों के फागोसाइटोसिस के लिए भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का समन्वय शामिल है। फागोसाइटोसिस वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा माइक्रोग्लिया सतह रिसेप्टर्स के साथ कार्गो को पहचानते हैं और वस्तु को एक फागोसोम में निगलने के लिए अपने साइटोस्केलेटन को पुनर्गठित करते हैं, जो तब कार्गो के क्षरण के लिए लाइसोसोम के साथ फ़्यूज़ करता है। स्वस्थ माइक्रोग्लिया फैगोसाइटोज़ एपोटोटिक मस्तिष्क कोशिकाओं को परिगलित1 बननेसे पहले उन्हें हटाने के लिए । एपोसाइटिक कोशिकाओं के फागोसिटोसिस को एफेरोसाइटोसिस के रूप में भी जाना जाता है, और मरने वाले सेल2द्वारा फॉस्फेटिडिलसेरीन "ईट-मी" सिग्नल के प्रदर्शन की आवश्यकता होती है। कई माइक्रोग्लिया रिसेप्टर्स सीधे टिम-4, बाई1, स्टैब्लिलिन-2 और ट्रेम2 सहित फॉस्फेटिडिलसेरीन को बांधते हैं। माइक्रोग्लियल टैम रिसेप्टर्स (जैसे, MERTK) और इंटीग्रीन अप्रत्यक्ष रूप से क्रमशः सहायक प्रोटीन GAS6 या MFG-E8 का उपयोग करके फॉस्फेटिडिलसेरीन को बांधते हैं। अन्य "खाओ-मुझे" संकेत मरने वाली कोशिकाओं की मान्यता के लिए आवश्यक हो सकते हैं, इनमें ग्लाइकोसिलेशन या सतह प्रोटीन के प्रभार में परिवर्तन शामिल हैं; कोशिका की सतह पर इंट्रासेलुलर प्रोटीन ICAM3, कैल्टेटिकुलिन, एनेक्सिन-I की अभिव्यक्ति; ऑक्सीकृत एलडीएल; या माइक्रोग्लिया द्वारा एपोटोटिक सेल की कोटिंग-उत्पादित पूरक C1q1,2.

पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग, फ्रंटोटेम्पोरल डिमेंशिया, और एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस सहित न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियां माइक्रोग्लिया फ़ंक्शन के लिए हानि के साथ जुड़ी हुई हैं, जिसमें मृत कोशिकाओं, माइलिन के टुकड़े और प्रोटीन समुच्चय जैसे मस्तिष्क अपशिष्ट उत्पादों का संचय शामिल है, और इन उत्तेजनाओं के लिए अतिरंजित भड़काऊ प्रतिक्रियाएं शामिल हैं3। फागोसिटोसिस न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में बिगड़ा हो सकता है और उम्र बढ़ने, सूजन, या विशिष्ट आनुवंशिक जोखिम वेरिएंट4,5के संयोजन के कारण विकृति में योगदान देता है। दूसरी ओर, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के पशु मॉडलों से भी सबूत हैं कि माइक्रोग्लिया अनुपयुक्त रूप से व्यवहार्य न्यूरॉन्स या सिनेप्स6,7,8हो सकता है। इस तंत्र को क्षतिग्रस्त न्यूराइट्स के फॉस्फेटिलसेरीन डिस्प्ले द्वारा उकसाया जा सकता है, जो सीधे माइक्रोग्लिगल फैगोसाइटोसिस रिसेप्टर्स TREM2 या GPR56 द्वारा महसूस किया जाता है, या अप्रत्यक्ष रूप से घुलनशील पूरक C1q द्वारा महसूस किया जाता है जो फॉस्फेटिडिलसेरीन-समृद्ध झिल्ली को लेते हैं, जिससे सीआर 3-मीडियाटेड फैगोसाइटोसिस9,10,11।

फागोसिटोसिस फ़ंक्शन के विट्रो परख में, उदाहरण के लिए, माइक्रोग्लिया में आनुवंशिक जोखिम संस्करण के फेनोटाइपिक प्रभाव का आकलन करने के लिए, अक्सर लेटेक्स मोतियों 4 जैसे गैर-शारीरिक कार्गो का उपयोग करके कियाजाताहै। फ्लोरोसेंटली लेबल बैक्टीरिया और जाइमोसन का भी उपयोग किया जाता है, जो शारीरिक होते हैं लेकिन न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के लिए प्रासंगिक नहीं होते हैं। गैर-शारीरिक फैगोसाइटिक कार्गो का उपयोग फागोसिटिक चपेट की बुनियादी मशीनरी में दोषों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है लेकिन एपोसाइटिक न्यूरॉन्स के फैगोसाइटोसिस में पहले "मान्यता" कदम को सही ढंग से मॉडल करने में विफल रहता है। आकार, आकार, कठोरता और कार्गो का प्रकार भी सक्रिय होने वाले इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग रास्तों को निर्देशित करता है, जिससे माइक्रोग्लिया सक्रियण राज्य के विभिन्न परिणाम होते हैं। उदाहरण के लिए, ई कोलाई बैक्टीरिया छोटे और कठोर होते हैं, मानव कोशिकाओं के विपरीत, और उनकी सतह पर लिपोपॉलिसाकराइड्स टोल-जैसे रिसेप्टर 4 (टीएलआर 4) द्वारा पहचाने जाते हैं जो फैगोसाइटोसिस और प्रो-भड़काऊ सिग्नलिंगपाथवे 2,12को सक्रिय करता है।

न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग अध्ययनों के संदर्भ में, एक अधिक प्रासंगिक फैगोसाइटिक कार्गो में स्तनधारी प्लाज्मा झिल्ली पर फॉस्फेटिडिलसेरिन डिस्प्ले होगा, और आदर्श रूप से मानव और न्यूरोनल होगा, जिसमें उन संकेतों को शामिल किया जाएगा जो माइक्रोग्लिया का सामना करने की संभावना है। इस फागोसिटोसिस प्रोटोकॉल के लिए, मानव न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइन एसएच-SY5Y को एक न्यूरॉन मॉडल के रूप में चुना गया था जो संस्कृति के लिए आसान है। स्थायी सतह फॉस्फेटिडिलसेरीन डिस्प्ले कृत्रिम रूप से पैराफॉर्मलडिहाइड द्वारा प्रेरित किया गया था, जिसे पहले प्लेटलेट्स13के फॉस्फेटिडिलसेरीन डिस्प्ले का कारण दिखाया गया है। माइक्रोग्लिया सेल मॉडल के लिए मानव आईपीएससी-मैक्रोफेज का उपयोग किया गया था, जो मानव माइक्रोग्लिया के ओनोंजेनी और ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल की नकल करते हैं, और फैगोसाइटिक रूप से सक्षम14,15,16,17हैं। आईपीएससी-मैक्रोफेज सबसे प्रामाणिक माइक्रोग्लिया मॉडल उपलब्ध नहीं हैं, उदाहरण के लिए, वे माइक्रोग्लिया आकृति विज्ञान की नकल नहीं करते हैं; हालांकि, एक यह माइक्रोग्लिया के एक अधिक प्रामाणिक मोनोकल्चर आईपीएससी मॉडल के लिए स्थानापन्न कर सकते है अगर वांछित, जैसे Haenseler एट अल15. मानव आईपीएससी मॉडल न्यूरोडिजनरेशन का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक कृंतक माइक्रोग्लिया के लिए बेहतर हैं, मानव बनाम माउस न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग ऊतकों में मनाए गए माइक्रोग्लिया ट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूल के सीमित ओवरलैप के बारे में चिंताओं के कारण18। मृत एसएच-SY5Ys एक एसिड के प्रति संवेदनशील डाई से सना हुआ है जो तटस्थ पीएच पर कमजोर और फागोसाइटोसिस के बाद आईपीएससी-मैक्रोफेज के फैगोलिसोसोम के अंदर अधिक दृढ़ता से फ्लोरेस्सी करता है। एसिड-सेंसिटिव डाई का उपयोग करने से फागोसिटिक घटनाओं का पता लगाने की सटीकता में सुधार होता है, जिसमें जीवित और फिक्स्ड मैक्रोफेज19के विभिन्न रीडआउट्स के लिए बहुमुखी प्रतिभा होती है। यह प्रोटोकॉल फिगोसाइटोसिस के लाइव-सेल समय-चूक इमेजिंग दोनों को रेखांकित करता है, और फागोसिटोसिस के लिए एक निश्चित उच्च सामग्री इमेजिंग परख, रीडआउट(चित्रा 1)से पहले एक ही सेल तैयारी चरणों के साथ।

Figure 1
चित्रा 1:कार्यप्रणाली का योजनाबद्ध आरेख। फैगोसाइटोसिस परख की रूपरेखा, जहां एसएच-SY5Ys की तैयारी और आईपीएससी-मैक्रोफेज का धुंधला समानांतर रूप से किया जाता है, और फिर एसएच-SY5Ys को आईपीएससी-मैक्रोफेज पर पिपेट किया जाता है। या तो लाइव-सेल टाइम-लैप्स इमेजिंग तुरंत की जाती है, या कोशिकाओं को आवश्यक अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटेड कियाजाता है और उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी करने से पहले तय किया जाता है । पीएफए: पैराफॉर्मलडिहाइड, एचबीएम: फिनोल रेड-फ्री एचईपी-बफर्ड मीडिया, पीएचआर: पीएच-संवेदनशील रेड फ्लोरोसेंट डाई एसटीपी एस्टर सॉल्यूशन, पीआरएफएम: फिनॉल रेड-फ्री मैक्रोफेज मीडिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Protocol

प्रोटोकॉल ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय, ऑक्सफोर्ड पार्किंसंस रोग केंद्र (आचार समिति: राष्ट्रीय स्वास्थ्य सेवा, स्वास्थ्य अनुसंधान प्राधिकरण, एनआरईएस समिति दक्षिण मध्य, बर्कशायर, ब्रिटेन (आरईसी 10/H0505/71) में व्युत्पन्न मानव आईपीएस सेल लाइनों के उपयोग के लिए दिशा निर्देशों का पालन करता है । मानव आईपीएससी को द्वितीय श्रेणी की सुरक्षा कैबिनेट के भीतर संभाला जाना है ताकि कामगार को संभावित साहसी एजेंटों से बचाया जा सके । स्थानीय, राष्ट्रीय, और यूरोपीय संघ के स्वास्थ्य और सुरक्षा नियमों का पालन किया जाना चाहिए । सेल कल्चर मीडिया रचनाएं तालिका 1में विस्तृत हैं, और सभी सामग्रियों को सामग्री कीअनुपूरक तालिका में सूचीबद्ध किया गया है।

1. प्रयोग से पहले सेल संस्कृति

  1. आईपीएससी मीडिया में संस्कृति आईपीएससी(तालिका 1)6-वेल प्लेटों में एक एचएससी-योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, उप-कन्फ्लूंट और कम पैसेज नंबर पर पूर्व-लेपित है।
  2. मानव आईपीएससी को आईपीएससी-मैक्रोफेज अग्रदूत में अंतर करें: भ्रूण शरीर के निर्माण को प्रोत्साहित करने और 5-6 दिनों के लिए दैनिक 75% मीडिया परिवर्तन करने के लिए भ्रूण शरीर मीडिया(तालिका 1)के 2 मिलील के साथ एक माइक्रोवेल कम पालन 24-अच्छी प्लेट में बीज चार मिलियन आईपीएससी। भ्रूणीय निकायों को T175 फ्लास्क में स्थानांतरित करें, लगभग 150 भ्रूण निकाय प्रति फ्लास्क, जिसमें फैक्ट्री मीडिया(टेबल 1)के 20 एमएल होते हैं। कारखाने मीडिया के 10-20 एमएल के अलावा साप्ताहिक फ़ीड।
    नोट: आईपीएससी-मैक्रोफेज अग्रदूत लगभग 2-3 सप्ताह के बाद सुपरनिटेंट में उभरते हैं और कई महीनों तक लगातार उत्पादित होते हैं। इस प्रयोग के लिए, भेदभाव कारखानों की स्थापना के लगभग 6 सप्ताह बाद से कोशिकाओं का उपयोग करना बेहतर है। इससे पहले काटा गया आईपीएससी-मैक्रोफेज कुछ प्रोलिफेरेटिव क्षमता को बनाए रख सकते हैं और कम अनुयायी होते हैं, यहां तक कि कम सेल घनत्व पर सीडिंग को रोकते हैं। फागोसिटोसिस क्षमता के लिए एक ऊपरी आयु सीमा निर्धारित नहीं की गई है ।
  3. आईपीएससी-मैक्रोफेज अग्रदूतों को आईपीएससी-मैक्रोफेज में अंतर करें: सुपरनैक्ट की आवश्यक मात्रा को हटाकर फसल अग्रदूत; यह एक 40 μm सेल छलनी के माध्यम से पारित करने के लिए झुरमुट हटाने के लिए; 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज पैलेट सेल और मैक्रोफेज मीडिया(टेबल 1)में रीसस्लपेंड करें। बीज आईपीएससी-मैक्रोफेज 20,000-30,000 कोशिकाओं पर प्रति अच्छी तरह से एक 96-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति (टीसी) में- काले अच्छी तरह से दीवारों और एक ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट नीचे के साथ माइक्रोप्लेट का इलाज किया, 100 माइक्रोल में मैक्रोफेज मीडिया प्रति अच्छी तरह से। किनारे के कुओं से बचें और इन्हें पीबीएस से भरें; यह परख पर वाष्पीकरण के प्रभाव को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2पर इनक्यूबेशन करके 6-10 दिनों के लिए अंतर करें ।
    नोट: इस परख के लिए, आईपीएससी लाइन BIONi010-C (ECACC आईडी: 66540023) का उपयोग किया गया था; हालांकि, एक और आईपीएससी लाइन को प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  4. एसएच-SY5Ys को बनाए रखें T75 फ्लास्क में एसएच-SY5Ys के 20 एमएल के साथ एसएच-SY5Ys(टेबल 1),हर 3-4 दिनों में पासिंग।
नाम बेस मीडिया योजक, अंतिम एकाग्रता
आईपीएससी मीडिया mTeSR1 -
भ्रूण शरीर मीडिया mTeSR1 बीएमपी 4, 50 एनजी/एमएल
VEGF, ५० एनजी/एमएल
एससीएफ, 20 एनजी/एमएल
फैक्टरी मीडिया XVIVO15 ग्लूटामैक्स, 2 mM
पेनिसिलिन, 100 इकाइयां/
स्ट्रेप्टोमाइसिन, 100 μg/mL
2-मर्केप्टोथेनॉल, 50 माइक्रोन
आईएल-3, 25 एनजी/एमएल
एम-सीएसएफ, 100 एनजी/एमएल
मैक्रोफेज मीडिया XVIVO15 ग्लूटामैक्स, 2 mM
पेनिसिलिन, 100 इकाइयां/
स्ट्रेप्टोमाइसिन, 100 μg/mL
एम-सीएसएफ, 100 एनजी/एमएल
एसएच-SY5Y मीडिया DMEM/F12 भ्रूण गोजातीय सीरम, 10%
पेनिसिलिन, 100 इकाइयां/
स्ट्रेप्टोमाइसिन, 100 μg/mL

तालिका 1: मीडिया व्यंजनों।

सेल कल्चर मीडिया के घटक प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किए जाते हैं। मीडिया घटकों का अधिक विवरण सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है।

2. मृत एसएच-SY5Ys की तैयारी

  1. एक वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, एसएच-SY5Ys को अलग करें, एक सेल वियोजन बफर के 4 एमसीएल के अलावा जिसमें पुनर्संयोजन ट्राइपसिन जैसे एंजाइम और 1.1 m M EDTA (सामग्री की तालिकादेखें) शामिल हैं, जिसे तुरंत हटा दिया जाना चाहिए ताकि 1 मिलियन से कम कोशिकाओं को एक पतली फिल्म कोटिंग के रूप में रखा जा सके। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट केलिए इनक्यूबेट/
  2. कुल्ला करने के लिए T75 फ्लास्क में एचबीबीएस के 10 एमएल जोड़ें, और एसएच-SY5Ys को 15 एमएल शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में पिपेट करें। 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को एस्पिएरेट करें और फेनोल रेड-फ्री एचईपी-बफर मीडिया (सामग्रीकी तालिका देखें) के 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। फिक्सेशन से पहले झुरमुट को तोड़ने के लिए 100-1000 माइक्रोट के साथ पाइपिंग, गोली को ध्यान से पुनर्सेमलित करना सुनिश्चित करें।
  3. ट्यूब में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (अंतिम एकाग्रता 2%) के 2 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें। ट्यूब के सामयिक कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. ट्यूब में एचबीएसएस का 10 एमएल जोड़ें। 7 मिनट के लिए 1,200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और फिनॉल रेड-फ्री हेपे-बफर मीडिया के 2 एमएल में फिर से निलंबित करें।
    नोट: चरण 2.4 के बाद, फिक्स्ड-एसएच-SY5Y तैयारी को एक प्रवाह साइटोमेट्री रीडआउट के साथ सेल पारगम्यता को मापने के लिए सुलभ फॉस्फेटिडिलसेरीन और प्रोपिडियम आयोडाइड दिखाने के लिए एनेक्सिन वी-फिटसी के साथ धुंधला करके गुणवत्ता-नियंत्रित किया जा सकता है। चरण 2.2 से प्राप्त एसएच-SY5Ys जीने के लिए निश्चित तैयारी की तुलना करें। धारा 7 और अनुपूरक चित्रा S1देखें । चरण 2.4 के बाद फिक्स्ड एसएच-SY5Ys के भंडारण की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि इसका मूल्यांकन नहीं किया गया है।

3. पीएच-संवेदनशील लाल फ्लोरोसेंट डाई के साथ मृत एसएच-SY5Ys की लेबलिंग

  1. चरण 2.4 के बाद, कोशिकाओं की गणना करें, और 2 एमएल कम प्रोटीन-बाध्यकारी ट्यूब में आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या को हटा दें। प्रत्येक 1 मिलियन एसएच-SY5Ys के लिए, 2 एमएल ट्यूब में कुल मात्रा को 300-500 माइक्रोन के साथ फिनॉल रेड-फ्री हेपे-बफर मीडिया के साथ बनाएं। ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में संक्षेप में गर्म करें।
  2. पीएच-संवेदनशील लाल फ्लोरोसेंट डाई एसटीपी एस्टर (सामग्री की तालिकादेखें) का पुनर्गठन करें और कोशिकाओं की गर्म 2 एमएल ट्यूब में प्रति मिलियन एसएच-SY5Y 12.5 माइक्रोन डाई जोड़ें। पाइपिंग करके धीरे-धीरे मिलाएं। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब इनक्यूबेट, प्रकाश से संरक्षित।
    नोट: पीएच-संवेदनशील डाई की एसटीपी एस्टर प्रजातियां प्राथमिक अमीनों के साथ प्रतिक्रिया करती हैं और इसलिए लेबलिंग बफर में मुफ्त अमीन नहीं होना चाहिए। जलीय बफ़र्स में संभावित सीमित घुलनशीलता के कारण, केवल गर्म जलीय बफर के लिए DMSO-भंग डाई जोड़ें, तुरंत मिश्रण करें, और वर्षा के संकेतों के लिए जांच करें (हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे काले कण)।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए 1200 x g पर एचबीबीएस और सेंट्रलाइज की 1 एमएल जोड़ें। सुपरनेट को त्यागें और 2 एमएल एचबीएसएस से धोएं। अपकेंद्रित्रता दोहराएं।
  4. सुपरनैंट को त्यागें और फेनोल रेड-फ्री मैक्रोफेज मीडिया (सामग्री की तालिकादेखें) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, 200,000-1.2 मिलियन कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए ताकि 50 माइक्रोन 10,000-60,000 कोशिकाएं (यानी, आईपीएससी-मैक्रोफेज की तुलना में 0.5x-3x अधिक एसएच-SY5Ys)।
    नोट: मीडिया में फेनोल लाल पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस बढ़ाता है और इसलिए यदि लाइव-सेल इमेजिंग की जानी है तो एक फिनोल लाल-मुक्त मीडिया का उपयोग किया जाना चाहिए। कुछ घंटों से अधिक समय तक दाग वाले एसएच-SY5Ys के भंडारण की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि इसका मूल्यांकन नहीं किया गया है। बर्फ पर दाग एसएच-SY5Ys रखें और प्रकाश से रक्षा करें।

4. आईपीएससी-मैक्रोफेज का धुंधला

  1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, एक गहरे लाल फ्लोरोसेंट, सेल-परमेंट, सुसिमिडिल एस्टर-प्रतिक्रियाशील डाई (सामग्री की तालिकादेखें) के मैक्रोफेज मीडिया में एक समाधान तैयार करें। Hoechst 33342 जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें)। पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक काम करने वाले समाधान को गर्म करें।
  2. एक बाँझ जलाशय में मल्टीचैनल पिपेट के साथ सेल सुपरनेट को पाइप करके आईपीएससी-मैक्रोफेज माध्यम को धीरे से नीचे करें। मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, आईपीएससी-मैक्रोफेज में कदम 4.1 में तैयार डाई समाधान का 70 μL/well जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस /5% सीओ2पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
  3. फिनॉल रेड-फ्री मैक्रोफेज मीडिया में प्रायोगिक उपचार तैयार करें। नकारात्मक नियंत्रण उपचार के रूप में 10 माइक्रोन साइटोचालासिन डी शामिल करें। इनक्यूबेशन बाद आईपीएससी-मैक्रोफेज माध्यम को बहुत धीरे-धीरे मल्टीचैनल पिपेट के साथ आकांक्षी करें, और धोने के लिए हैंक के बफर खारा समाधान (एचबीएसएस) के 100 μL/well जोड़ें। कोमल पिप्टिंग द्वारा तुरंत एचबीबीएस को हटा दें, फिर मीडिया ± यौगिकों के 100 माइक्रोन जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट-1 घंटे के लिए इनक्यूबेट/ 5% सीओ2।
    नोट: साइटोचलासिन डी एक शक्तिशाली ऐक्टिन अवरोधक है और फागोसिटोसिस को अवरुद्ध करता है। किसी भी प्रयोगात्मक उपचार है कि अब इनक्यूबेशन की आवश्यकता के लिए, उदाहरण के लिए, 24-72 घंटे, १०० μL का उपयोग कर कदम ४.१ से पहले प्रयोगात्मक उपचार प्रदर्शन/ प्रोटोकॉल के अनुसार चरण 4.1-4.3 का पालन करें ताकि सेल धुंधला किया जा सके और बाद में उपचार को फगोसाइटोसिस परख के शेष के लिए फिनोल रेड-फ्री मैक्रोफेज मीडिया में फिर से लागू किया जाता है।

5. इमेजिंग फागोसिटोसिस

नीचे दो अलग-अलग फैगोसाइटोसिस रीडआउट विधियां हैं, उप-अनुभाग 5.1 या 5.2 चुनें।

  1. लाइव-सेल समय-चूक इमेजिंग
    1. फैगोसाइटोसिस से पहले, लाइव-सेल टाइम-लैप्स इमेजिंग माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिकादेखें), कंप्यूटर, पर्यावरण कक्ष और सीओ2 गैस चालू करें। ओपन इमेज कैप्चर सॉफ्टवेयर। चेक करें कि माइक्रोस्कोप में डीएपीआई, आरएफपी और CY5 हल्के क्यूब्स लगाए गए हैं। टाइम लैप्स | पर क्लिक करें इनक्यूबेट | पर्यावरण चैंबर सक्षम करें और सीओ2 गैस के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक वार्मिंग का चयन करें, यह भी सुनिश्चित करें कि आर्द्रता का चयन किया जाए। माइक्रोस्कोप को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए 30 मिनट की अनुमति दें।
    2. यौगिक इनक्यूबेशन के दौरान चरण 4.3 पर, आईपीएससी-मैक्रोफेज प्लेट को माइक्रोस्कोप में लोड करें।
    3. इमेज | पर क्लिक करें | पर कब्जा वेसल एक्सपर्ट। अच्छी तरह से प्लेट का चयन करें और एक 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रकार का चयन करें।
    4. इमेज टैब में, फेज चैनल को चालू करें और ऊर्ध्वाधर स्लाइडर्स का उपयोग करके मोटे और ठीक फोकसिंग को समायोजित करें, ताकि कोशिकाएं फोकस में हों। क्षैतिज स्लाइडर के साथ प्रकाश के स्तर को समायोजित करें। DAPI, RFP और CY5 चैनलों पर क्लिक करें और प्रत्येक चैनल के लिए प्रकाश स्तर को समायोजित करें।
    5. सिस्टम टैब में, कैलिब्रेट वेसल अलाइनमेंट पर क्लिक करें और स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।
    6. टाइम लैप्स | पर क्लिक करें दिनचर्या | नई दिनचर्या बनाएं। टाइम लैप्स विजार्डकी पहली स्क्रीन पर, दिनचर्या का नाम दें। आगेक्लिक करें । दूसरी स्क्रीन पर, 20x उद्देश्य का चयन करें, मोनोक्रोम कैप्चर का चयन करें, और DAPI, RFP, CY5 और चरण चैनलों का चयन करें। निम्नलिखित विकल्पों का चयन न करें: ऑटो फाइंड सैंपल, ऑटो फाइन फोकस, जेड-स्टैक, ऑटो लाइटिंग। आगेक्लिक करें ।
    7. अगली स्क्रीन पर प्रत्येक कुएं के केंद्र में एक बीकन सेट करें, जो माइक्रोस्कोप को हर बार-पॉइंट के लिए एक ही प्रकाश सेटिंग्स के साथ एक ही समन्वय पर लौटने की अनुमति देगा। प्रत्येक बीकन के लिए फोकसिंग और लाइटिंग सेटिंग्स स्वतंत्र हैं। एक बीकन सेट करने के लिए: प्लेट मानचित्र पर स्थान पर नीले सर्कल खींचें, मोटे और ठीक फोकस वर्टिकल स्लाइडर का उपयोग करें, और जब संतुष्ट क्लिक जोड़ें बीकनपर। बीकन सेटिंग्स को बाद में अपडेट चयनित बटन का उपयोग करके अपडेट किया जा सकता है।
    8. जब फागोसिटोसिस परख शुरू करने के लिए तैयार है, तो परख प्लेट को हटा दें और इसे जैविक सुरक्षा कैबिनेट में रखें। तरल के किनारे पर प्रत्येक कुएं के किनारे को जोड़ते हुए, एसएच-SY5Ys के 50 माइक्रोन को जोड़ने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
    9. माइक्रोस्कोप में प्लेट लोड करें और थर्मल शिफ्ट के लिए लगभग 30 मिनट का इंतजार करें।
      नोट: पहले 30 मिनट के दौरान कि थाली माइक्रोस्कोप में है, परख प्लेट के बदलते तापमान ध्यान बदलाव के लिए कारण होगा । यदि प्लेट को संतुलन बनाने की अनुमति नहीं है, तो कैप्चर की गई छवियां समय-चूक के दौरान ध्यान से बाहर हो जाएंगी।
    10. प्रत्येक बीकन पर क्लिक करें और फोकस सेटिंग अपडेट करें। आगेक्लिक करें । टाइम लैप्स विजार्डकी अगली स्क्रीन पर फाइल फॉर्मेट टिफका चयन करें , अलग - अलग चैनलों को सहेजनेका विकल्प सक्षम करें और प्रत्येक बीकन के लिए वीडियो बनाने काविकल्प सक्षम करें और नीचे के विकल्पों में निम्नलिखित जानकारी को वाटरमार्क के रूप में शामिल करने कीअनुमति दें । आगेक्लिक करें ।
    11. दृश्यों की संख्या 1 सेट करें। आगेक्लिक करें । समय-चूक की अवधि और अंतराल निर्धारित करें, उदाहरण के लिए, 3 एच और इमेजिंग हर 5 मिनट। केवल कैप्चर वन फ्रेमका चयन न करें। आगेक्लिक करें ।
    12. 37 डिग्री सेल्सियस और सीओ2 के तापमान के साथ पर्यावरण कक्ष को सक्षम करें (आर्द्रता छोटे प्रयोगों के लिए वैकल्पिक है)। अगले दो बार पर क्लिक करें । डेटा को सहेजने के लिए एक रास्ता चुनें। आगेक्लिक करें । समय-चूक शुरू करने के लिए शुरू पर क्लिक करें ।
  2. फिक्स्ड-सेल हाई-कंटेंट इमेजिंग
    1. लेबल एसएच-SY5Ys के 50 माइक्रोन को जोड़ने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें, जो तरल के किनारे पर प्रत्येक कुएं के किनारे को जोड़ता है। 3-5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस/ 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट।
    2. फैगोसाइटोसिस इनक्यूबेशन के बाद, धीरे-धीरे एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ पिपटिंग करके सेल सुपरनेटेंट को एस्पिरेट करें, और त्यागें। 100 μL PBS के साथ एक बार धो लें।
    3. 2% पैराफॉर्मलडिहाइड के 100 माइक्रोन के अलावा प्लेट को ठीक करें, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. कुओं को एस्पिरेट करें और पीबीएस के 100 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट सीलर और पन्नी के साथ कवर; आवश्यकता पड़ने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: परख प्लेट महत्वपूर्ण संकेत गिरावट के बिना कम से कम एक सप्ताह के लिए इस तरह संग्रहीत किया जा सकता है; अब भंडारण का परीक्षण नहीं किया गया है।
    5. उच्च सामग्री इमेजिंग माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिकादेखें) चालू करें और छवि कैप्चर सॉफ्टवेयर खोलें। स्क्रीन के शीर्ष पर लोड आइकन पर क्लिक करके माइक्रोस्कोप में परख प्लेट लोड करें।
    6. सेटअप टैब का चयन करें। शीर्ष बाएं बॉक्स के ड्रॉप-डाउन मेनू में: उपयुक्त प्लेट प्रकार का चयन करें, ऑटोफोकस विकल्प टू पीक (डिफ़ॉल्ट)का चयन करें, उद्देश्य 40x पानी, NA1.1का चयन करें, कॉन्फोकल मोड का चयन करें, और 1की बिनिंग का चयन करें।
    7. सेटिंग्स मेनू के माध्यम से उपयोग से पहले 40x पानी उद्देश्य फ्लश करें।
    8. चैनल चयन बॉक्स में, चैनल DAPI, एलेक्सा 647, और एलेक्सा 568 जोड़ने के लिए + आइकन का उपयोग करें। इन्हें 1 माइक्रोन के एक विमान में मापने के लिए सेट करें। परख प्लेट की धुंधला दक्षता के लिए समय और पावर सेटिंग्स का अनुकूलन करें।
      नोट: एक दिशानिर्देश के रूप में, 200 एमएस एक्सपोजर और 100% पावर पर DAPI सेट करें, एलेक्सा 647 पर 1500 एमएस एक्सपोजर और 100% पावर पर, और एलेक्सा 568 पर 100 एमएस एक्सपोजर और 40% पावर पर।
    9. यह सुनिश्चित करें कि चैनलों को अलग करने के लिए चैनल अनुक्रम पर क्लिक करके चैनलों को एक साथ मापा नहीं जाता है।
    10. नेविगेशन | के तहत लेआउट को परिभाषित करें,माप के कुओं का चयन करें और प्रति अच्छी तरह से 9-12 क्षेत्रों का चयन करें।
    11. सेट-अप के दौरान, प्लेट मैप पर एक प्रतिनिधि फ़ील्ड पर क्लिक करें, और प्रत्येक माप चैनल को बदले में देखें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि धुंधला मौजूद है और चैनल ऑफसेट को समायोजित करके छवियों को केंद्रित किया जाता है।
    12. डेटा को रिमोट विश्लेषण के लिए सर्वर पर अपलोड करने के लिए, ऑनलाइन जॉब्स बॉक्स और संबंधित स्क्रीन नाम पर क्लिक करें; इससे इमेजिंग के बाद डाटा को सर्वर पर ऑटोमेटिक अपलोड किया जा सकेगा।
    13. सेव बटन पर क्लिक करके परख प्रोटोकॉल को सेव करें।
    14. शीर्ष पर रन प्रयोग टैब पर क्लिक करें और प्रयोग प्लेट का नाम है, तो शुरूपर क्लिक करें ।

6. डेटा विश्लेषण

नीचे दो अलग-अलग डेटा विश्लेषण विधियां हैं, उप-धारा 6.1 चुनें यदि उप-धारा 5.1 का पालन किया गया था, या उप-धारा 5.2 का पालन किया गया था तो उप-धारा 6.2 चुनें।

  1. लाइव-सेल समय-चूक माइक्रोस्कोप द्वारा प्राप्त फागोसिटोसिस छवियों का विश्लेषण
    1. अनुशंसित ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें और इंस्टॉल करें (सामग्री की तालिकादेखें)। सॉफ्टवेयर खोलें।
    2. इनपुट मॉड्यूल बॉक्स में, छवियोंका चयन करें।
    3. विंडोज एक्सप्लोररसे, डेटा के फ़ोल्डर को खोलें, जिसमें बीकन-1, बीकन-2 आदि नाम के उप-फ़ोल्डर शामिल हैं। फ़ाइल सूची बॉक्स में बीकन फ़ोल्डर्स के सभी का चयन करें और खींचें।
    4. इनपुट मॉड्यूल बॉक्स में, मेटाडेटाका चयन करें। निकालने के लिए मेटाडेटा?, हांका चयन करें । मेटाडेटा निष्कर्षण विधिके बगल में ड्रॉप-डाउन मेनू में, फ़ाइल/फ़ोल्डर नामों से निकालेंचुनें । मेटाडेटा स्रोतके लिए, फ़ोल्डर नामचुनें। नियमित अभिव्यक्ति के अधिकार के लिए आवर्धक ग्लास पर क्लिक करें, और टाइप करें".*[\.*](? P.*) $ "रेगेक्स टेक्स्टबॉक्स में (उद्धरण अंकों को छोड़कर)। सबमिट पर क्लिक करें। मेटाडेटा से निकालने केलिए, सभी छवियोंको चुनें। स्क्रीन के नीचे अपडेट पर क्लिक करें। छवियों को अब बीकन द्वारा समूहित किया जाएगा।
    5. इनपुट मॉड्यूल बॉक्स में, नाम और प्रकार का चयन करें। निम्नलिखित प्रक्रिया प्रत्येक टाइमपॉइंट को सही फ्लोरेसेंस चैनल को सौंपे जाने के लिए छवियों की अनुमति देगी। इमेज मिलान नियम (ड्रॉप-डाउन मेनू) को नाम असाइन करें। नियम मानदंड का चयन निम्नलिखित नियमों के सभी (ड्रॉप-डाउन मेनू) से मेल खाते हैं। फ़ाइल (ड्रॉप-डाउन मेनू), करता है (ड्रॉप-डाउन मेनू), शामिल (ड्रॉप-डाउन मेनू), DAPI (टेक्स्ट बॉक्स)। इन छवियों को आवंटित करने के लिए नाम DAPI (टेक्स्ट बॉक्स) । इमेज टाइप ग्रेस्केल इमेजई (ड्रॉप-डाउन मेन्यू) चुनें। इमेज मेटाडेटा (ड्रॉप-डाउन मेनू) से तीव्रता सीमा निर्धारित करें।
    6. स्क्रीन के नीचे, ऐडएस्ट इमेजपर क्लिक करें, और चरण 6.1.5 दोहराएं। DAPI को आरएफपीसे बदलें, ताकि आरएफपी छवियों को समूहित किया जा सके।
    7. CY5 चैनल छवियों के लिए चरण 6.1.6 दोहराएं।
    8. स्क्रीन के नीचे अपडेट पर क्लिक करें, छवि फ़ाइलों को अब DAPI, RFP और CY5 लेबल वाले तीन कॉलम में सूचीबद्ध किया जाएगा।
    9. इनपुट मॉड्यूल बॉक्स में, समूहोंका चयन करें। क्या आप अपनी छवियों को समूहित करना चाहते हैं?, हांका चयन करें । मेटाडेटा श्रेणीके लिए ड्रॉप-डाउन मेनू में, बीकनचुनें।
    10. विश्लेषण मॉड्यूल बॉक्स में, सभी मॉड्यूल की एक सूची को कॉल करने के लिए सफेद अंतरिक्ष पर सही क्लिक करें।
    11. ऐड | पर क्लिक करें इमेज प्रोसेसिंग | लचर प्रेसफ़ीचर्स । इनपुट इमेज के रूप में पहले ड्रॉप-डाउन बॉक्स से DAPI चुनें। आउटपुट इमेज को "डीएपीस्पेकल्स" के नाम दें। 20 पिक्सल के फीचर साइज के साथ ऑपरेशन टाइप एन्हांस और फीचर टाइप स्पेक्टल्सका चयन करें । स्पीड और सटीकता का विकल्प फास्ट/हेक्सागोनलचुनें ।
    12. एक नया मॉड्यूल बनाएं। | जोड़ें ऑब्जेक्ट प्रोसेसिंग | राजकुमारीऑब्जेक्ट्स की पहचान करें। इनपुट इमेज के रूप में पहले ड्रॉप-डाउन बॉक्स से डीएपीस्पीकल्स चुनें। प्राथमिक वस्तुओं को "नाभिक" नाम दें। 10 से 35 पिक्सेल इकाइयों के रूप में वस्तुओं के विशिष्ट व्यास इनपुट; इस पैरामीटर को अनुकूलित किया जा सकता है। दहलीज रणनीति ग्लोबल,थ्रेसहोल्ड विधि रिडलरकैवर्ड,चौरसाई विधि स्वचालितचुनें, और थ्रेसहोल्ड सुधार कारक को 0-1 निचले और ऊपरी सीमाओं के साथ 12 के रूप में दें। झुरमुट वस्तुओं को आकार में अलग करने की विधि बदलें लेकिन अन्य मापदंडों को अपनी डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स पर छोड़ दें।
      नोट: आईपीएससी-मैक्रोफेज नाभिक को मोटे तौर पर चरण 6.1.12 में खंडित किया गया है, एक छवि प्रसंस्करण चरण के बाद जो व्यास को कम करता है और नाभिक के विपरीत बढ़ता है। यह महत्वपूर्ण है कि केवल प्रतिभाशाली नाभिक का चयन किया जाता है क्योंकि एसएच-SY5Ys बेहोशी नाभिक के रूप में दिखाई देगा और अन्यथा आईपीएससी-मैक्रोफेज के रूप में गलत होगा। चयनित नाभिक के अनुपात को समायोजित करना, सीमा सुधार कारक को बढ़ाना या घटाना। परीक्षण चरण के दौरान, परिणामी नाभिक चयन की तुलना बीकन के चरण छवि से करें, जहां सेल आकृति विज्ञान का उपयोग करके आईपीएससी-मैक्रोफेज और एसएच-SY5Y के बीच अंतर करना आसान है।
    13. एक नया मॉड्यूल बनाएं। | जोड़ें इमेज प्रोसेसिंग | सही है किमिनेशनकैल्कुलेट । इनपुट इमेज के रूप में पहले ड्रॉप-डाउन बॉक्स से CY5 चुनें। आउटपुट इमेज "IllumCY5" का नाम दें। कैसे रोशनी का चयन करें केलिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से पृष्ठभूमि चुनें। अन्य मापदंडों को उनकी डिफ़ॉल्ट सेटिंग पर छोड़ दें।
    14. एक नया मॉड्यूल बनाएं। ऐड | पर क्लिक करें इमेज प्रोसेसिंग | इसकेलिए सही तरीके से किया गया है । इनपुट इमेज के रूप में पहले ड्रॉप-डाउन बॉक्स से CY5 चुनें। आउटपुट इमेज "CorrCY5" का नाम दें। रोशनी का चयन करने केलिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से IllumCY5 चुनें। कैसे रोशनी का चयन करें केलिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से विभाजित चुनें।
      नोट: चरण 6.1.13-6.1.14 का उद्देश्य CY5 छवियों की पृष्ठभूमि प्रकाश व्यवस्था में भिन्नता को सही करना है, जो अन्यथा सही सेल विभाजन में हस्तक्षेप करेगा।
    15. एक नया मॉड्यूल बनाएं। ऐड | पर क्लिक करें ऑब्जेक्ट प्रोसेसिंग | सेक्युलरीऑब्जेक्ट्स की पहचान करें। इनपुट इमेज के रूप में पहले ड्रॉप-डाउन बॉक्स से CorrCY5 चुनें। इनपुट ऑब्जेक्ट्स के रूप में नाभिक चुनें। माध्यमिक वस्तुओं "मैक" का नाम दें। दूरी केरूप में पहचान की विधि चुनें - बी . दहलीज रणनीति ग्लोबल,थ्रेसहोल्डिंग विधि रिडलरकैवर्ड,चौरसाई विधि कोई चौरसाई काचयन करें, और दहलीज सुधार कारक को 0-1 निचले और ऊपरी सीमा के साथ 1 के रूप में दें। अन्य मापदंडों को उनकी डिफ़ॉल्ट सेटिंग पर छोड़ दें।
      नोट: सेल सेगमेंटेशन चरण को सेल सीमाओं को विकसित करने या सिकोड़ने के लिए सीमा सुधार कारक को समायोजित करके अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। आईपीएससी-मैक्रोफेज स्टेनिंग की ताकत बढ़ाने या इमेजिंग के दौरान CY5 लाइट क्यूब की रोशनी से सेगमेंटेशन एफिशिएंसी में भी सुधार किया जा सकता है।
    16. एक नया मॉड्यूल बनाएं। ऐड | पर क्लिक करें इमेज प्रोसेसिंग | लचर प्रेसफ़ीचर्स । इनपुट इमेज के रूप में पहले ड्रॉप-डाउन बॉक्स से आरएफपी चुनें। आउटपुट इमेज को "फ़िल्टर्डआरएफपी" के नाम दें। 15 पिक्सल के फीचर साइज के साथ ऑपरेशन टाइप एन्हांस और फीचर टाइप स्पेक्टल्सका चयन करें । सुविधा आकार को अनुकूलित किया जा सकता है। स्पीड और सटीकता का विकल्प फास्ट/हेक्सागोनलचुनें ।
    17. एक नया मॉड्यूल बनाएं। ऐड | पर क्लिक करें ऑब्जेक्ट प्रोसेसिंग | राजकुमारीऑब्जेक्ट्स की पहचान करें। इनपुट इमेज के रूप में पहले ड्रॉप-डाउन बॉक्स से फ़िल्टर्डआरएफपी चुनें। प्राथमिक वस्तुओं का नाम "पीएचआर"। 5-20 पिक्सेल इकाइयों के रूप में वस्तुओं के ठेठ व्यास इनपुट। थ्रेसहोल्ड स्ट्रैटजी मैनुअलका चयन करें और मैन्युअल रूप से एक सीमा टाइप करें, उदाहरण के लिए, 0.005. झुरमुट वस्तुओं को आकार में अलग करने के लिए विधि बदलें लेकिन अन्य मापदंडों को उनकी डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स पर छोड़ दें।
      नोट: एसएच-SY5Ys को चरण 6.1.17 में खंडित किया गया है, एक छवि प्रसंस्करण चरण के बाद जो व्यास को कम करता है और विराम के विपरीत बढ़ता है। मैनुअल थ्रेसिंग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि पीएच-संवेदनशील डाई की तीव्रता फागोसिटोस किए गए कणों में समय के साथ बढ़ जाती है, और अन्य थ्रेसहोल्ड रणनीतियां कृत्रिम रूप से प्रारंभिक समय बिंदुओं में पीएच-संवेदनशील डाई समय रेखा की संख्या को बढ़ा देगी। परीक्षण मोड का उपयोग करके, प्रत्येक बाद के प्रयोगात्मक दोहराने के लिए मैन्युअल थ्रेसहोल्ड को समायोजित किया जाना चाहिए।
    18. एक नया मॉड्यूल बनाएं। ऐड | पर क्लिक करें ऑब्जेक्ट प्रोसेसिंग | संबंधित आपत्ति । ड्रॉप-डाउन मेनू से इनपुट चाइल्ड ऑब्जेक्ट्स पीएचआर चुनें। ड्रॉप-डाउन मेनू से इनपुट पैरेंट ऑब्जेक्ट्स मैक चुनें। सभी बच्चे माप के लिए प्रति माता पिता के साधनों की गणना के लिए?, हांका चयन करें । बाल-माता-पिता की दूरी(कोई नहीं)की गणना न करें।
      नोट: चरण 6.1.18 आईपीएससी-मैक्रोफेज के लिए पीएच-संवेदनशील डाई सिग्नल से संबंधित है, जो आईपीएससी-मैक्रोफेज प्रति फागोसिटोस वस्तुओं की औसत संख्या की माप की अनुमति देता है।
    19. एक नया मॉड्यूल बनाएं। ऐड | पर क्लिक करें फाइल प्रोसेसिंग | निर्यात करने के लिए उछलाशीट। टैब के रूप में कॉलम परिसीमन का चयन करें और बीकन नंबर को इंगित करने के लिए फ़ाइल नामों के लिए एक उपसर्ग जोड़ें। निर्यात के लिए विशिष्ट माप चुनें, जैसा कि नीचे दर्शाया गया है (चरण 6.1.19.1 - 6.1.19.4); अन्य मापदंडों को उनकी डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स पर छोड़ना।
      1. इमेज | गिनती | पीएचआर और मैक का चयन करें
      2. इमेज | फ़ाइलनाम
      3. इमेज | समूह
      4. मैक | बच्चों | पीएचआर
    20. आउटपुट बॉक्स में, व्यू आउटपुट सेटिंग्सपर क्लिक करें । इस प्रयोग के लिए डेस्कटॉप पर एक नया फ़ोल्डर बनाएं और इसे डिफ़ॉल्ट आउटपुट फ़ोल्डर के रूप में सेट करें।
    21. पाइप लाइन फाइल | बचाओ सेवप्रोजेक्ट के रूप में...।
    22. नीचे-बाएं कोने में स्टार्ट टेस्ट मोड पर क्लिक करके एक प्रतिनिधि छवि पर पाइपलाइन का परीक्षण और अनुकूलन करें। कार्यक्रम स्वचालित रूप से परीक्षण के लिए पहली छवि का चयन करता है और पाइपलाइन के प्रत्येक चरण को आंखों के प्रतीकों पर क्लिक करके देखा जा सकता है, जो आउटपुट को दिखाई देता है, और फिर रनपर क्लिक करता है। परीक्षण के लिए इस्तेमाल बीकन बदलने के लिए, शीर्ष मेनू बार में टेस्ट | पर क्लिक करें इमेज ग्रुप चुनें। एक बीकन के भीतर छवि (समय बिंदु) को बदलने के लिए, शीर्ष मेनू बार में टेस्ट | पर क्लिक करें इमेज सेट चुनें। जिन मापदंडों को अनुकूलित किया जाना चाहिए, उन्हें पिछले चरणों में बताया गया है।
    23. पाइपलाइन से संतुष्ट होने पर, एग्जिट टेस्ट मोड पर क्लिक करें और उन्हें बंद करने के लिए खुली आंखों के प्रतीकों पर क्लिक करें। पाइप लाइन को बचाएं। पूर्ण छवि विश्लेषण शुरू करने के लिए छवियों का विश्लेषण करने पर क्लिक करें।
    24. उत्पन्न होने वाली टेक्स्ट फ़ाइलों को उपयुक्त स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर के साथ स्प्रेडशीट के रूप में खोला जा सकता है, और "छवि" लेबल वाली फ़ाइल में प्रत्येक छवि टाइमपॉइंट के लिए एक पंक्ति होगी, जिसमें पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करने वाले कॉलम होंगे।
      नोट: Count_Mac और Count_pHr आईपीएससी-मैक्रोफेज की संख्या और एक छवि में पहचाने गए पीएच-संवेदनशील वस्तुओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। Count_pHr डेटा का उपयोग न करें, क्योंकि गिनती में मंद फ्लोरोसेंट एसएच-SY5Ys शामिल हैं जिन्हें फागोसिटोस नहीं किया गया है। कॉलम Mean_Mac_Children_pHr_Count एक व्यक्तिगत छवि के लिए प्रति मैक (चरण 6.1.18 सेरिसऑब्जेक्ट) के प्रति फागोसिटोसेड पीएचआर ऑब्जेक्ट्स की औसत संख्या लेता है, यानी, बीकन का व्यक्तिगत समय बिंदु।
    25. डेटा की व्यवस्था करें ताकि प्रत्येक बीकन स्प्रेडशीट पर एक अलग कॉलम हो, वर्णिका क्रम की पंक्तियों के रूप में व्यवस्थित छवियां, स्प्रेडशीट वर्कबुक की विभिन्न शीट्स पर कब्जा करने वाले विभिन्न मापदंडों के साथ।
    26. प्रति छवि स्पॉट की पैरामीटर संख्या उत्पन्न करने के लिए, Count_Mac द्वारा माप Mean_Mac_Children_pHr_Count गुणा करें। प्रत्येक बीकन के लिए मतलब Count_Mac की गणना करें। उस बीकन के लिए Count_Mac मतलब द्वारा प्रति छवि स्थानों की संख्या को विभाजित करें, प्रति सेल स्पॉट की पैरामीटर संख्या पैदा करें।
      नोट: चरण 6.1.26 आईपीएससी-मैक्रोफेज काउंट (Count_Mac) में होने वाले किसी भी गलत उतार-चढ़ाव को सही करता है, जो डेटा को औसत आईपीएससी-मैक्रोफेज काउंट में सामान्य करके बीकन के सभी टाइमपॉइंट्स में गिना जाता है।
    27. प्रत्येक छवि पंक्ति को फागोसिटोसिस शुरू होने (न्यूनतम में) के बाद से समय असाइन करें।
    28. कुओं/बीकन को दोहराने के लिए साधन और मानक विचलन उत्पन्न करें । फोगोसाइटोसिस की दर की कल्पना करने के लिए समय (एक्स-एक्सिस) के मुकाबले प्रति सेल (वाई-एक्सिस) स्पॉट की संख्या को ग्राफ करें।

Figure 2
चित्र 2:उच्च सामग्री फैगोसाइटोसिस विश्लेषण में सेल विभाजन। एक गैर-phagocytosed एसएच-SY5Y के करीब निकटता में एक आईपीएससी-मैक्रोफेज के अच्छे बनाम गरीब विभाजन को प्रदर्शित करने के लिए चित्रण, एक दूसरे एसएच-SY5Y पूरी तरह से phagocytosed के साथ । ग्रे में दिखाए गए दोनों सेल प्रकारों के साथ, कंप्यूटर विश्लेषण द्वारा चित्रित आईपीएससी-मैक्रोफेज सेल सीमा (नीला) रेखांकित की गई है। एसएच-SY5Ys जिन्हें फागोसिटोसिस घटनाओं के रूप में गिना जाता है, उन्हें विश्लेषण से बाहर किए जाने पर हरे या उल्लिखित लाल रंग की रूपरेखा तैयार की जाती है। बीच में छवि खराब विभाजन को दर्शाती है; आईपीएससी-मैक्रोफेज में उप-इष्टतम चित्रण है जिसमें सेल सीमा के भीतर गैर-फैगोसाइटोसेड एसएच-SY5Y शामिल है, जिसे एक फैगोसाइटोसिस घटना के रूप में गिना जाएगा। सही पर छवि आईपीएससी-मैक्रोफेज सेल सीमा को परिभाषित करने वाले अधिक कड़े मापदंडों के कारण अच्छी विभाजन दिखाती है, जिसके कारण गैर-फैगोसाइटोसेड एसएच-SY5Y को विश्लेषण से सही ढंग से बाहर रखा गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. उच्च सामग्री माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त फागोसिटोसिस छवियों का विश्लेषण
    1. अनुशंसित इमेज-प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) में लॉग इन करें।
    2. स्क्रीन नाम फ़ोल्डर का चयन करें, और इमेजिंग बाएं हाथ के मेनू से उप-फ़ोल्डर चलाते हैं। इमेज एनालिसिस आइकन (आवर्धक ग्लास वाली स्क्रीन) पर क्लिक करें। विश्लेषण पाइपलाइन स्थापित करने के लिए प्लेट लेआउट पर अच्छी तरह से एक प्रतिनिधि का चयन करें।
    3. पहला विश्लेषण बिल्डिंग ब्लॉक इनपुट इमेज है। स्टैक प्रोसेसिंग(व्यक्तिगत विमान)और फ्लैटफील्ड सुधार(कोई नहीं)के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स छोड़ दें। अगले बिल्डिंग ब्लॉक को जोड़ने के लिए, ब्लॉक के शीर्ष दाएं कोने पर + साइन पर क्लिक करें, और न्यूक्लिय का चयन करें।
    4. फाइंड न्यूक्लियीमें चैनल को डीएपीआईके रूप में स्थापित किया गया , जो आरओआई आबादी को कोई नहीं, सी के रूप में विभाजन की विधि के रूप में स्थापितकरता है । विधि बॉक्स में एक ड्रॉप-डाउन मेनू होता है जो पैरामीटर को अनुकूलित करने की अनुमति देता है, जिसमें सामान्य सीमा (यानी, 0.40) और क्षेत्र (यानी, >30 माइक्रोन2)के लिए सेटिंग्स होती हैं। उत्पादन आबादी "नाभिक" का नाम दें। + प्रतीक पर क्लिक करके अगले बिल्डिंग ब्लॉक जोड़ें और साइटोप्लाज्म का चयन करें।
    5. साइटोप्लाज्म खोजेंमें, चैनल को एलेक्सा 647 और विधि को बीके रूप में सेट करें। विधि बॉक्स में एक ड्रॉप-डाउन मेनू होता है जो पैरामीटर को अनुकूलित करने की अनुमति देता है, जिसमें सामान्य सीमा (यानी, 0.45) और व्यक्तिगत सीमा (यानी, 0.20) के लिए सेटिंग्स होती हैं। + प्रतीक पर क्लिक करके अगले बिल्डिंग ब्लॉक जोड़ें और चुनिंदा पॉपुलेशन का चयन करें।
      नोट: साइटोप्लाज्म सेगमेंटेशन को ठीक से अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है ताकि इसमें किसी भी आसन्न एसएच-SY5Ys को शामिल न किया जा सके जिसे फगोसाइटोस किए गए नहीं किया गया है लेकिन फैगोसाइटोसेड कार्गो को बाहर नहीं करता है (चित्र 2देखें)।
    6. चुनिंदा पॉपुलैरिटीमें, डिफॉल्ट सेटिंग्स रखें, जो जनसंख्या नाभिक,विधि कॉमन फिल्टर,सीमा वस्तुओं को हटानेके लिए एक टिक, और "नाभिक चयनित" नाम की आउटपुट आबादी होगी। + प्रतीक पर क्लिक करके अगले बिल्डिंग ब्लॉक जोड़ें और मॉर्फोलॉजी गुणों की गणना करें।
    7. आकृति विज्ञान गुणों की गणनामें , आबादी को नाभिक चयनितकरने के लिए निर्धारित किया गया है , क्षेत्र को सेलके लिए, मानककी विधि । ड्रॉप-डाउन मेनू में, यह सुनिश्चित करें कि क्षेत्र और गोलाई का चयन किया जाता है (μm2)। आउटपुट आबादी "आकृति विज्ञान सेल" का नाम दें। + प्रतीक पर क्लिक करके अगले बिल्डिंग ब्लॉक जोड़ें और चुनिंदा पॉपुलेशन का चयन करें।
    8. चुनिंदा जनसंख्या (2)में, चयनित जनसंख्या नाभिक औरगुणों द्वारा विधि फ़िल्टरचुनें। फ़िल्टर F1के तहत ड्रॉप-डाउन बॉक्स में, मॉर्फोलॉजी सेल एरिया [माइक्रोन2]काचयन करें। ड्रॉप-डाउन बॉक्स से दाईं ओर > चुनें, और बॉक्स में 160 टाइप करें। उत्पादन आबादी का नाम "नाभिक चयनित 2"। + प्रतीक पर क्लिक करके अगले बिल्डिंग ब्लॉक जोड़ें और खोजें स्पॉटका चयन करें ।
      नोट: इस कदम में किसी भी अनुचित रूप से खंडित कोशिकाओं, और आगे के विश्लेषण से किसी भी मृत कोशिकाओं को शामिल नहीं किया गया है । कट-ऑफ आकार को बढ़ाकर या कम करके अनुकूलन करना आवश्यक हो सकता है।
    9. फाइंड स्पॉट्समें, चैनल एलेक्सा 568का चयन करें, आरओआई जनसंख्या नाभिक चयनित 2,आरओआई क्षेत्र सेल,विधि बी,और उत्पादन जनसंख्या "स्पॉट" का नाम दें। यदि आवश्यक हो तो विधि को अनुकूलित किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो, ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करके, पता लगाने की संवेदनशीलता (यानी, 0.20) और विभाजन संवेदनशीलता (यानी, 0.400) के लिए सेटिंग्स के साथ। + प्रतीक पर क्लिक करके अगले बिल्डिंग ब्लॉक जोड़ें और मॉर्फोलॉजी गुणों की गणना करें।
    10. आकृति विज्ञान गुण (2) की गणनामें, जनसंख्या स्पॉट,क्षेत्र स्पॉट,और विधि मानकका चयन करें। ड्रॉप-डाउन मेनू में, यह सुनिश्चित करें कि क्षेत्र और गोलाई का चयन किया जाता है (μm2)। आउटपुट गुणों को "आकृति विज्ञान स्पॉट" नाम दें। + प्रतीक पर क्लिक करके अगले बिल्डिंग ब्लॉक जोड़ें और चुनिंदा पॉपुलेशन का चयन करें।
    11. चुनिंदा जनसंख्या (3)में, गुणों द्वारा जनसंख्या स्थलों और विधि फ़िल्टरका चयन करें। फ़िल्टर F1के तहत ड्रॉप-डाउन बॉक्स में, स्पॉट एरिया [पीएक्स2],>, 20 काचयन करें। फ़िल्टर F2के तहत ड्रॉप-डाउन बॉक्स में, स्पॉट एरिया [पीएक्स2],<, 2500का चयन करें। फ़िल्टर F3के तहत ड्रॉप-डाउन बॉक्स में, मॉर्फोलॉजी स्पॉट गोलाई, >, 0.6का चयन करें। फ़िल्टर F4के तहत ड्रॉप-डाउन बॉक्स में, स्पॉट टू रीजन तीव्रता, >, 2.5का चयन करें। आउटपुट आबादी "चयनित स्पॉट" का नाम दें। + प्रतीक पर क्लिक करके अगले बिल्डिंग ब्लॉक जोड़ें और चुनिंदा पॉपुलेशन का चयन करें।
      नोट: स्वचालित स्पॉट चयन में कई छोटे फ्लोरोसेंट धब्बे होंगे जो आईपीएससी-मैक्रोफेज के भीतर ऑटोफ्लोर्सेंट निकायों से परिणाम देते हैं। इस कदम का उद्देश्य क्षेत्र, गोलाई और स्थानों की तीव्रता के लिए कड़े कट-ऑफ लागू करके ऑटोफ्लोरेसेंट निकायों को फ़िल्टर करना है, और कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
    12. चुनिंदा जनसंख्या (4)में, जनसंख्या नाभिक चयनित 2 और गुणों द्वारा विधि फ़िल्टरका चयन करें । फ़िल्टर F1के तहत ड्रॉप-डाउन बॉक्स में, स्पॉट, >, 0.5 की संख्या काचयन करें। आउटपुट आबादी "स्पॉट पॉजिटिव सेल" का नाम दें। + प्रतीक पर क्लिक करके अगले बिल्डिंग ब्लॉक जोड़ें और परिभाषित परिणामोंका चयन करें ।
    13. परिभाषित परिणामोंमें, आउटपुटकी सूची के रूप में पहली विधि का चयन करें । डिफ़ॉल्ट सेटिंग प्रत्येक आबादी के लिए गणना की जाने वाली वस्तुओं की संख्या के लिए है। जनसंख्या के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू पर क्लिक करें: नाभिक का चयन 2 और यह सुनिश्चित करें कि वस्तुओं की संख्या टिक गई है, और सभी ड्रॉप-डाउन मेनू पर लागू करने में सभी का चयन करें। जनसंख्या स्पॉट पॉजिटिव सेल केलिए, यह सुनिश्चित करें कि वस्तुओं की संख्या टिक गई है। अन्य आबादी के लिए, किसी भी मापदंडों की रिपोर्ट करना आवश्यक नहीं है। फॉर्मूला आउटपुटके रूप में दूसरी विधि का चयन करें, और फॉर्मूला (a/b) * 100 टाइपकरें । चर के रूप में चुनें एक स्पॉट पॉजिटिव सेल- ऑब्जेक्ट्स की संख्या,और वेरिएबल बी के रूप में नाभिक का चयन 2- ऑब्जेक्ट्स की संख्या। आउटपुट को "स्पॉट पॉजिटिव सेल (%)" के रूप में नाम दें।
    14. पाइपलाइन को सहेजें: डिस्क (नीचे तीर के साथ एक फ्लॉपी डिस्क) के लिए आइकन सेव एनालिसिस पर क्लिक करें।
    15. आइकन बैच विश्लेषण (स्क्रीन के शीर्ष के साथ एक फ़नल और cogs प्रतीक) पर क्लिक करें। बाईं ओर प्रायोगिक फ़ोल्डर्स से, कच्चे डेटा फ़ाइल का चयन करें, जो चयनित मापों की संख्या को 1तक अपडेट करना चाहिए। विश्लेषण विकल्प क्षेत्र में, विधिके लिए ड्रॉप-डाउन मेनू पर क्लिक करें, और मौजूदा विश्लेषणका चयन करें। पर क्लिक करें ... स्क्रिप्ट फ़ाइल के बगल में प्रतीक, और सहेजे गए विश्लेषण फ़ाइल (प्रत्यय .aas) के लिए ब्राउज़ करें। फिर, विश्लेषण शुरू करने के लिए अगले हरे तीर पर क्लिक करें। विश्लेषण प्रगति की निगरानी जॉब स्टेटस (स्क्रीन के ऊपरी-दाएं हाथ के कोने में) पर क्लिक करके की जा सकती है।
    16. एक बार विश्लेषण पूरा हो जाने के बाद, टैब एक्सपोर्टपर क्लिक करें, प्रयोग फ़ोल्डर चुनें, और एक गंतव्य फ़ोल्डर चुनें। डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स को छोड़ दें, जो डेटा निर्यात करते हैं लेकिन झगड़ा छवियां नहीं, और निर्यात शुरू करते हैं।
    17. एक उपयुक्त स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में स्प्रेडशीट के रूप में डाउनलोड की गई फाइल खोलें। कुओं पंक्तियों और स्तंभों में मापदंडों में व्यवस्था कर रहे हैं। स्पॉट पॉजिटिव सेल (%), नाभिक चयनित 2 -स्पॉट की संख्या - मतलब प्रति अच्छी तरह से, और नाभिक चयनित 2 - कुल स्पॉट क्षेत्र - मतलब प्रति अच्छी तरह से, और प्रत्येक पैरामीटर के लिए ताजा स्प्रेडशीट के लिए इन की नकल कॉलम में डेटा का चयन करें। पैरामीटर की गणना प्रत्येक स्थिति के कुओं को दोहराने के लिए मतलब है, और ग्राफ के रूप में उपयुक्त है ।

7. निश्चित एसएच-SY5Ys की एकरूपता के लिए गुणवत्ता नियंत्रण परख

  1. चरण 2.2 से लाइव एसएच-SY5Ys का एक एलिकोट ले लीजिए और अनुलग्नक वी-फिटसी धुंधला (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए एक किट से एनेक्सिन बाध्यकारी बफर में लगभग 200,000 कोशिकाओं प्रति एमएल की एकाग्रता पर पुनर्निर्दाद करें।
  2. चरण 2.4 से फिक्स्ड एसएच-एसवाईवाई का एक एलिकोट ले लीजिए और लगभग 200,000 कोशिकाओं प्रति एमएल की एकाग्रता पर एनेक्सिन बाध्यकारी बफर में पुनर्स व्यय करें।
  3. एनेक्सिन वी-फिटसी के 5 माइक्रोन और प्रोपिडियम आयोडाइड के 5 माइक्रोन के साथ दो टेस्ट ट्यूब तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें)। एक ट्यूब में लाइव एसएच-SY5Ys के 500 μL जोड़ें, और दूसरे के लिए तय एसएच-SY5Ys के 500 μL।
  4. तीन नियंत्रण ट्यूब तैयार करें: एक एनेक्सिन वी-फिटसी के 5 माइक्रोन के साथ, एक प्रोपिडियम आयोडाइड के 5 माइक्रोन के साथ, और एक ट्यूब खाली। लाइव और फिक्स्ड एसएच-SY5Ys के 1:1 अनुपात को एक साथ मिलाएं और प्रत्येक नियंत्रण ट्यूब में इसका 500 माइक्रोल जोड़ें।
  5. पाइपिंग करके धीरे-धीरे ट्यूब मिलाएं। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट, प्रकाश से संरक्षित।
  6. तुरंत एक प्रवाह साइटोमीटर (पूर्व = 488 एनएम) पर उपाय; एनेक्सिन वी-फिटसी के लिए फिटसी सिग्नल डिटेक्टर (आमतौर पर FL1) और प्रोपिडियम आयोडाइड के लिए फाइकोरीथ्रिंन उत्सर्जन सिग्नल डिटेक्टर (आमतौर पर FL2) का उपयोग करके एम = 530 एनएम।
  7. फिटसी बनाम पीआई सिग्नल के डॉट प्लॉट्स प्रदर्शित करने के लिए किसी भी प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और डबल-निगेटिव आबादी का चयन करने के लिए आयताकार गेटिंग टूल का उपयोग करें। दोहरी-नकारात्मक आबादी के भीतर, एफएससी बनाम एसएससी प्रदर्शित करें और बहुत कम एफएससी और एसएससी के साथ आबादी के चारों ओर एक अपवर्जन गेट बनाने के लिए एक बहुभुज गेटिंग टूल का उपयोग करें, जिसे मलबे के रूप में वर्गीकृत किया गया है और इसलिए आगे के विश्लेषण से बाहर रखा गया है। फिटसी बनाम पीआई सिग्नल के रूप में शेष घटनाओं को प्रदर्शित करें और फिटसी-/पीआई-, फिटसी +/पीआई-, फिटसी-/पीआई +, और फिटसी +/पीआई + घटनाओं के लिए एक चतुर्भुज गेट सेट करने के लिए एकल दाग और अन दाग नियंत्रण का उपयोग करें ।
    नोट: लाइव एसएच-SY5Ys के साथ किसी न किसी हैंडलिंग, भंवर या लंबे ऊष्मायनों से बचें, जो कृत्रिम रूप से फॉस्फेटिडिलसेरीन डिस्प्ले को प्रेरित कर सकता है। बिना किसी देरी के साइटोमेट्री प्रवाह के लिए आगे बढ़ें। एक वांछनीय परिणाम यह है कि फिक्स्ड एसएच-SY5Ys में फिटसी-/पीआई-इवेंट्स का अनुपात <5% है । प्रतिनिधि परिणाम अनुपूरक चित्रा S1में दिखाए जाते हैं ।

Representative Results

लाइव-सेल टाइम-लैप्स इमेजिंग पहले उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया गया था, जिसमें जंगली प्रकार के आईपीएससी-मैक्रोफेज को 20,000 कोशिकाओं पर अच्छी तरह से वरीयता दी गई थी। एसएच-SY5Ys की विभिन्न मात्रा लागू की गई थी (10,000-30,000 प्रति कदम 3.1 में सेल काउंट से अनुमानित), और फैगोसाइटोसिस अवरोधक साइटोचलासिन डी कुछ कुओं के साथ पूर्व-इनक्यूबेटेड (1 एच) था, जो एसएच-SY5Ys की प्रत्येक राशि के लिए फागोसिटोसिस को नियंत्रित करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य कर रहा था। इमेजिंग एसएच-SY5Ys और छवियों के अलावा अगले 3 घंटे के लिए 5 मिनट के अंतराल पर कब्जा कर लिया गया के बाद ४० मिनट शुरू (डेटा प्रारंभिक ४० मिनट देरी भी शामिल है) । एक प्रतिनिधि समय-चूक वीडियो को अनुपूरक डेटामें शामिल किया गया है, और चित्र 3में दिखाए गए मात्रात्मक आंकड़ों का विश्लेषण किया जाता है। 10,000 एसएच-SY5Ys प्रति अच्छी तरह से की मात्रा के साथ, प्रति सेल phagocytosed कणों (धब्बे) की संख्या समय के साथ रैकरली में वृद्धि हुई है, और साइटोचलासिन डी द्वारा लगभग 50% तक बाधित किया गया था। साइटोचलासिन डी द्वारा अवरोध अनुमान से कमजोर था, सबसे अधिक संभावना अपर्याप्त तकनीकी या जैविक प्रतिकृति के कारण होती है, क्योंकि प्रति स्थिति केवल एक अच्छी तरह से तीन छवि क्षेत्रों के साथ चित्रित किया गया था। एसएच-SY5Ys की उच्च मात्रा के साथ अच्छी तरह से (20,000 और 30,000), फैगोसाइटोसिस ने खराब रैखिकता का प्रदर्शन किया, जो देखने के अधिक भीड़ भरे क्षेत्र में आईपीएससी-मैक्रोफेज और एसएच-SY5Ys के खराब विभाजन के कारण होने की संभावना है।

फिक्स्ड-सेल हाई-कंटेंट इमेजिंग पहले से उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया गया था, जिसमें जंगली प्रकार के आईपीएससी-मैक्रोफेज के साथ 20,000 कोशिकाओं पर अच्छी तरह से, एसएच-SY5Ys की कई अलग-अलग मात्रा (10,000-80,000 प्रति अच्छी तरह) थी, और परख प्लेट को 5 एच के बाद तय किया गया था और इमेज किया गया था। फिगर 4एमें फागोसिटोसिस की एक प्रतिनिधि छवि प्रस्तुत की जाती है और चित्र 4बी17में दिखाए गए विश्लेषण किए गए डेटा। एसएच-SY5Ys की मात्रा बढ़ाने के परिणामस्वरूप प्रति कोशिका फैगोसाइटोसेड कणों (धब्बे) की संख्या अधिक हुई; हालांकि, एसएच-SY5Y मात्रा के दोहरीकरण से केवल प्रति सेल स्पॉट की संख्या में 1.5x की वृद्धि होती है। यह इंगित करता है कि परीक्षण की गई मात्रा फेगोसाइटोसिस तक दर-सीमित नहीं है। बाद में उच्च सामग्री इमेजिंग फागोसिटोसिस परख को फैगोसाइटोसिस(चित्रा 4 सी)17के कई अवरोधकों का उपयोग करके मान्य किया गया था। ऐक्टिन पॉलीमराइजेशन अवरोधक साइटोचलासिन डी और जैस्प्लेकिनोलाइड ने क्रमशः 91% और 90% तक फैगोसाइटोसिस को बाधित किया, जब फागोसिटोसिस से पहले 1 घंटे के लिए पूर्व-इनक्यूबेटेड किया जाता है। परख के मजबूत जेड ' जब साइटोचलासिन डी या जैसप्लेकिनोलाइड का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है, तोक्रमशः0.7 और 0.8 के रूप में गणना की जाती है। लाइसोसोम एसिडिफिकेशन अवरोधक बाफिलोमाइसिन ए 1 ने फागोसाइटोसिस से पहले 1 घंटे तक इनक्यूबेटेड होने पर फैगोसाइटोसिस को 31% तक काफी कम कर दिया। लाइसोसोम एसिडिफिकेशन अवरोधक बनाम ऐक्टिन अवरोधक के कमजोर प्रभाव से पता चलता है कि आंतरिक कार्गो का पता लगाने के लिए फागोसोम के पूर्ण अम्लीकरण की आवश्यकता नहीं हो सकती है। Recombinant एनेक्सीन वी विशेष रूप से एसएच-SY5Ys की सतह पर उजागर फॉस्फेटिडिलसेरीन को ब्लॉक करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, लिगामेंट तक पहुंचने से phagocytic रिसेप्टर्स को रोकने, एक महत्वपूर्ण "खाओ-मुझे" संकेत । एसएच-SY5Y इसके अलावा से तुरंत पहले कुओं में जोड़े जाने पर रीकॉम्बिनेंट एनेक्सिन वी के अलावा 30% तक फैगोसाइटोसिस में काफी कमी आई। फिक्स्ड एसएच-SY5Ys को फ्लोरोसेंट एनेक्सिन वी प्रोब का उपयोग करके फॉस्फेटिडिलसेरीन का पर्दाफाश करने की पुष्टि की गई थी, जबकि लाइव एसएच-SY5Ys एनेक्सिन वी स्टेनिंग(चित्रा 4D)के लिए नकारात्मक थे।

माइक्रोग्लिगल फैगोसाइटोसिस रिसेप्टर ट्रेम2 को पहले एपोप्टोटिक न्यूरॉन्स21के फैगोसाइटोसिस के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है । TREM2 के R47H उत्परिवर्तन अल्जाइमर रोग के देर से शुरू करने के लिए एक जोखिम जीन है, और TREM223के ligand बाध्यकारी को कम करने के लिए परिकल्पना की है । R47H TREM2 और TREM2 KO के फैगोसाइटिक फ़ंक्शन का आकलन करने के उद्देश्य से, फिक्स्ड-सेल हाई-कंटेंट फैगोसाइटोसिस परख को WT/R47H/KO TREM217के साथ आइसोजेनिक आईपीएससी-मैक्रोफेज लाइनों का उपयोग करके किया गया था । 1 से 5 घंटे तक फागोसिटोसिस अवधि की कई लंबाई का परीक्षण किया गया, जो फागोसिटिक कार्गो (40,000 एसएच-SY5Ys) के कंपित अतिरिक्त का उपयोग करके किया गया था। परिणामस्वरूप संकेत 4 घंटे के लिए रैखिक रूप से बढ़ जाता है, 5 घंटे(चित्रा 5)17पर थोड़ा बंद समतल । डब्ल्यूटीई की तुलना में TREM2 KO में कम फेगोसाइटोसिस दर और क्षमता (% स्पॉट पॉजिटिव कोशिकाएं) स्पष्ट थी, जबकि R47H TREM2 उत्परिवर्ती ने बदल दिया फागोसिटोसिस नहीं दिखाया। TREM2 KO कोशिकाओं में फागोसिटिक दोष R47H TREM2 उत्परिवर्तन द्वारा फेनोकोपीड नहीं है, प्रतीत होता है क्योंकि TREM2 फ़ंक्शन सामान्य फागोसिटोसिस का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है।

Figure 3
चित्र 3:लाइव-सेल समय-चूक फागोसिटोसिस परख के लिए उदाहरण डेटा। जंगली प्रकार के आईपीएससी-मैक्रोफेज BIONi010-C (ईसीएसीसी आईडी: 66540023) द्वारा मृत एसएच-SY5Ys का तेज 3 घंटे के लिए 5 मिनट के अंतराल पर चित्रित किया गया है। ग्राफ पर प्रदर्शित टाइम्स फागोसिटोसिस की दीक्षा से हैं, जिसमें माप के बिना पहले 40 मिनट शामिल हैं। तीन दोहराने वाले कुओं से प्रति सेल स्पॉट की औसत संख्या की साजिश रची जाती है। 10,000 एसएच-SY5Ys के फागोसिटोसिस को 1 घंटे पूर्व उपचार के साथ 10 माइक्रोन सिम साइटोचालासिन डी के साथ बाधित किया जाता है, जबकि एसएच-सि 5वायस (20,000 और 30,000) की उच्च मात्रा में फागोसिटोसिस का उप-उप-क्षमता क्वांटिफिकेशन होता है। मानक विचलन (एसडी), एन = 1 प्रयोग ± मतलब है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:फिक्स्ड-सेल हाई-कंटेंट फैगोसाइटोसिस परख का अनुकूलन और सत्यापन। (ए)एसएच-SY5Ys फैगोसाइटो की प्रतिनिधि उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी छवि जंगली प्रकार के आईपीएससी-मैक्रोफेज बायोनी010-सी (ईसीएसीसी आईडी: 66540023) द्वारा की गई । 40,000 एसएच-SY5Ys के साथ 3 एच टाइम-पॉइंट दिखाया गया है। फ्लोरेसेंस चैनलों को विलय कर दिया जाता है, जिसमें आईपीएससी-मैक्रोफेज दाग को लाल, नीले रंग के रूप में नाभिक और एसएच-SY5Ys को पीले रंग के रूप में दिखाया गया है। इनसेट पैनल छवि का एक खंड है जो 3x बढ़ाया गया है।(ख)5 घंटे के बाद फैगोसाइटोडेड डेड एसएच-SY5Ys के प्रति सेल स्पॉट की संख्या, जंगली प्रकार के आईपीएससी-मैक्रोफेज के लिए कार्गो के अलावा विभिन्न मात्रा का उपयोग करके। मतलब ± मतलब (SEM) के मानक त्रुटि, एन = 3 फसल के लिए । (C)फागोसिटोसिस (3 एच) 10 माइक्रोनम साइटोचलासिन डी (साइट), 1 माइक्रोन बाम बाफिलोमाइसिन ए 1 (बाफ), 1 माइक्रोएम जैस्प्लेकिनोलाइड (1 एच प्री-ट्रीटमेंट के साथ) के साथ बाधित है; जैस), और 13 μg/mL recombinant एनेक्सिन वी (मृत एसएच-SY5Ys के लिए एक साथ जोड़ा; ऐन) । कोई एसएच-SY5Ys जोड़ा के साथ आईपीएससी-मैक्रोफेज एक नकारात्मक नियंत्रण (-ve) के रूप में इस्तेमाल किया गया, और सकारात्मक (+ ve) नियंत्रण एसएच-SY5Ys के साथ अनुपचारित आईपीएससी-मैक्रोफेज जोड़ा गया है । प्रयोग दोहराने के लिए डेटा को मतलब के लिए सामान्यीकृत किया गया था। इसका मतलब है ± SEM, एन = 3-6 फसल के लिए और दो जंगली प्रकार सेल लाइनों के साथ (SFC840-03-03, इस लाइन के लक्षण वर्णन में वर्णित है (फर्नांडीस एट अल21 और BIONi010-C) । 1-तरह से है Dunnett पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ ANOVA, अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना । * पी < ०.०५, * * * पी < ०.००१ । (घ)फ्रेशली फिक्स्ड एसएच-SY5Ys फॉस्फेटिलसेरीन डिस्प्ले (एनेक्सटिन वी-फिटसी) के लिए समान रूप से दाग देते हैं और इसमें सीमित सेल पारगम्यता (प्रोपिडियम आयोडाइड) होती है । लाइव एसएच-SY5Ys एनेक्सिन वी-फिटसी या प्रोपिडियम आयोडाइड के लिए दाग नहीं है, सिवाय संस्कृति में कुछ मृत कोशिकाओं पर मौजूद फोकल धुंधला के लिए। आंकड़े अल्जाइमर अनुसंधान और थेरेपी17से अनुमति के साथ पुन: पेश कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:Phagocytosis TREM2 KO में कम है, लेकिन R47H TREM2 आईपीएससी-मैक्रोफेज में नहींहै । उच्च सामग्री फैगोसाइटोसिस परख कंपित परिवर्धन के साथ 40,000 एसएच-SY5Ys प्रति अच्छी तरह से प्रदर्शन किया। मापदंडों के लिए साधनों की मात्रा निर्धारित की गई थी: प्रति सेल स्पॉट की संख्या, स्पॉट क्षेत्रों की राशि(μm 2)प्रति सेल, और प्रति क्षेत्र फैगोसाइटोस्ड कणों वाली कोशिकाओं का प्रतिशत। प्रति प्रयोग प्रत्येक जीनोटाइप के लिए डेटा को सामान्यीकृत किया गया था। मतलब ± SEM, एन = 3 फसल के लिए। बार-उपाय 2-तरह से ANOVA, डुनेट के बाद-तदर्थ परीक्षण, हर बार डब्ल्यूटीई से जोड़ीवार तुलना: * पी < 0.05, * * पी < 0.01, * * * पी < 0.001। आंकड़े अल्जाइमर अनुसंधान और थेरेपी17से अनुमति के साथ पुन: पेश कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा S1: एसएच-SY5Ys तैयारी के लिए उदाहरण QC। अलग एसएच-SY5Ys 0% (लाइव कोशिकाओं), 1%, और पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 2% के साथ 10 मिनट के लिए तय किया गया था, तो धोया । कोशिकाओं को एनेक्सिन वी-फिटसी और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) से दाग दिया गया और तुरंत प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापा गया। एक चतुर्भुज द्वार रखने के लिए एकल दाग और अन दाग नियंत्रण का उपयोग करके, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर में रंग घनत्व डॉट भूखंड बनाए गए थे। क्वाड्रेंट को उस चतुर्भुज के भीतर की घटनाओं के प्रतिशत के साथ एनोटेट किया जाता है। लाइव कोशिकाएं मुख्य रूप से Q4 में होती हैं, और निश्चित कोशिकाएं मुख्य रूप से Q2 में होती हैं। Q1 = एनेक्सटिन वी-/पीआई-, Q2 = एनेक्सटिन V+/PI+, Q3 = एनेक्सटिन V+/PI-, Q4 = एनेक्सटिन वी-/पीआई-(लाइव सेल) । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक वीडियो: लाइव सेल समय-चूक फैगोसाइटोसिस। एसएच-SY5Ys के प्रतिनिधि समय-चूक वीडियो जंगली प्रकार के आईपीएससी-मैक्रोफेज BIONi010-C (ईसीएसीसी आईडी: 66540023) द्वारा phagocytosed । छवियों को 3 घंटे के लिए हर 5 मिनट लिया गया । वीडियो फसली है और प्रति सेकंड 3 फ्रेम पर चलाता है, परख के पिछले १.५ घंटे दिखा । एसिड के प्रति संवेदनशील डाई-दाग एसएच-SY5Ys को लाल, सिग्नल तीव्रता में दिखाया गया है जो फागोसोम एसिडिफिकेशन के साथ बढ़ रहा है। होचस्ट 33342 के साथ सना हुआ सेल न्यूक्लियी नीले रंग में दिखाया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

माइक्रोग्लिया में महत्वपूर्ण कार्य होते हैं जो न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की दीक्षा और प्रगति को प्रभावित करते हैं, जिसमें एपोटोटिक न्यूरॉन्स के फागोसिटोसिस शामिल हैं। बिगड़ा माइक्रोग्लियल फागोसिटोसिस और सिनेप्सेस के अनुचित फागोसिटोसिस दोनों न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से जुड़े हुए हैं, हालांकि अंतर्निहित तंत्र और करणीय संबंध अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं4,23। यह पेपर आईपीएससी-मैक्रोफेज द्वारा एपोटोटिक कोशिकाओं के फागोसिटोसिस को मापने के लिए एक फागोसिटोसिस को रेखांकित करता है, या तो लाइव-सेल समय-चूक इमेजिंग रीडआउट या फिक्स्ड-सेल हाई-कंटेंट माइक्रोस्कोपी, या एक ही परख पर दोनों का संयोजन। इस बहुमुखी प्रतिभा का मतलब है कि परख का उपयोग कुछ कुओं में समय के साथ व्यक्तिगत फेगोसाइटिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है या कई शर्तों या उपचारों के साथ उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है। चूंकि उच्च सामग्री परख एक ही समय बिंदु पर तय की जाती है, इसलिए एक साथ कई परख प्लेटें तैयार की जा सकती हैं। उच्च सामग्री परख रोग से जुड़े आनुवंशिक वेरिएंट के साथ मैक्रोफेज/माइक्रोग्लिया की विशेषता या phagocytosis में परिवर्तन के लिए छोटे अणु अवरोधकों स्क्रीनिंग के लिए संभावित उपयोगिता है । परख को अन्य माइक्रोग्लिया मॉडल, या संभावित एस्ट्रोसाइट्स के फागोसिटोसिस का अध्ययन करने के लिए भी आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। फागोसिटोसिस परख को संभावित रूप से लाइव-सेल इमेजिंग दाग के साथ मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया, कैल्शियम, या आरओएस संकेतक, और प्रोटीन के लिए पोस्ट-फिक्सेशन इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला किया जा सकता है। मौजूदा फैगोसाइटोसिस परख के साथ तुलना में जो एपोप्टोटिक न्यूरोनल कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, मुख्य लाभ जो इस प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं वह यह है कि फैगोसाइटिक कार्गो की तैयारी अपेक्षाकृत सरल और तेजी से होती है, और परिणामस्वरूप एक समान उत्पाद होता है। अन्य परखें 2घंटे25 के लिए एस-नाइट्रोसो-एल-सिस्टीन के साथ न्यूरॉन्स या एसएच-SY5Ys के एपोप्टोसिस को प्रेरित करती हैं, 3 एच22के लिए ओकाडाइक एसिड, स्टैरोस्पोरीन 4-16 एच26, 27,28, 29यायूवी-विकिरण के लिए 24 एच30के लिए, और इसके परिणामस्वरूप एपोप्टोसिस के विभिन्न चरणों में कोशिकाएं हो सकती हैं। इसके अलावा, लाइव-सेल इमेजिंग और उच्च सामग्री इमेजिंग readouts पहले वर्णित नहीं किया गया है, जहां तक लेखकों को पता है । फैगोसाइटिक कार्गो तैयार करने के लिए पैराफॉर्मेल्डिहाइड-फिक्सेशन का उपयोग करने की मुख्य सीमा यह है कि यह एपोप्टोसिस की प्रक्रिया को पूरी तरह से पुनः रीकैपिटल नहीं करता है, क्योंकि निर्धारण कोशिकाओं को एपोप्टिक निकायों में विभाजित होने से रोकता है, जो उनके छोटे आकार के कारण अधिक तेजी से फेगोसाइटो होने की संभावना है। यह ज्ञात नहीं है कि न्यूक्लियोटाइड के स्राव पर क्या प्रभाव निर्धारण होता है "मुझे ढूंढें" संकेत (उदाहरण के लिए, एटीपी, यूडीपी) लक्ष्य कोशिका से जो phagocytes को आकर्षित करते हैं। एपोप्टोटिक कोशिकाओं के समान, फिक्स्ड एसएच-SY5Ys प्रोपिडियम आयोडाइड के लिए कुछ झिल्ली पारगम्यता प्रदर्शित करता है। झिल्ली पार पारियक्षा "मुझे खोजें" संकेतों की रिहाई से जुड़ी हुई है; हालांकि, यह तय एसएच-SY5Ys में अध्ययन नहीं किया गया है, और अगर न्यूक्लियोटाइड भी जल्दी जारी कर रहे हैं, वे दूर बह जाएगा इससे पहले कि एसएच-SY5Ys आईपीएससी-मैक्रोफेज में जोड़ रहे हैं ।

प्रोटोकॉल में पहला महत्वपूर्ण कदम एक पीएच-संवेदनशील लाल फ्लोरोसेंट डाई के एक एसटीपी एस्टर के साथ मृत एसएच-SY5Ys का धुंधला है। यह डाई तेजी से और सहसंयोजक रूप से मृत एसएच-SY5Ys की सतह पर मुफ्त प्राथमिक अमीनों के साथ प्रतिक्रिया करता है। धुंधला होने की अवधि को अनुकूलित करने की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, लेबलिंग से पहले डाई को संभालने के साथ देखभाल की जानी चाहिए। लेबलिंग प्रतिक्रिया मुक्त अमीनों युक्त बफ़र्स में नहीं किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यदि डीएमएसओ स्टॉक ठंडे जलीय बफर या उच्च अंतिम एकाग्रता में पतला हो जाता है तो वर्षा का खतरा होता है। अपरिपक्वता माइक्रोस्कोप के नीचे घने अंधेरे वस्तुओं के रूप में दिखाई देगी। इसके अतिरिक्त, पीएच-संवेदनशील डाई समाधान नियमित प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूबों से चिपक जाता है और धीरे-धीरे धोता है; इसलिए, लेबलिंग चरण के लिए कम बाध्यकारी ट्यूबों की सिफारिश की जाती है। एक पीएच-संवेदनशील डाई का उपयोग, स्थायी रूप से फ्लोरोसेंट डाई के बजाय, घिरा हुआ कणों की पहचान को एड्स करता है, बनाम कण जो प्लाज्मा झिल्ली को पड़ोसी करते हैं। चूंकि तटस्थ पीएच पर कुछ फ्लोरेसेंस है, इसलिए फागोसाइटिक कार्गो और आईपीएससी-मैक्रोफेज के घनत्व को सटीक विभाजन के लिए पर्याप्त कम रखा जाना चाहिए, हालांकि काफी अधिक है कि कई फैगोसाइटिक घटनाओं पर कब्जा कर लिया जाता है। उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी कुएं में कार्गो के मध्यम घनत्व के साथ फागोसिटोसिस की सटीक पहचान करने में सक्षम थी (2 एसएच-SY5Ys प्रति आईपीएससी-मैक्रोफेज) । इसके विपरीत, गहरे लाल स्पेक्ट्रम में माइक्रोस्कोप की कमजोर संवेदनशीलता के कारण, लाइव-सेल समय-चूक इमेजिंग डेटा में आईपीएससी-मैक्रोफेज का विभाजन कम आत्मविश्वास से लबरेज था और झूठी सकारात्मक (हर दो आईपीएससी-मैक्रोफेज के लिए 1 एसएच-SY5Y) की संभावना को कम करने के लिए कार्गो के बहुत कम घनत्व का उपयोग करना आवश्यक था। अनुपचारित और साइटोचलासिन डी-इलाज कुओं के बीच तुलना के साथ उचित विभाजन और कार्गो घनत्व का सत्यापन किया जाना चाहिए। एक अच्छी तरह से अनुकूलित परख में, साइटोचलासिन डी को अनुपचारित नमूनों के सापेक्ष प्रति सेल स्पॉट की औसत संख्या को 90% तक कम करना चाहिए।

प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम आईपीएससी-मैक्रोफेज धुंधला है, जो सेल की पहचान करने और छवि विश्लेषण में खंडित करने की अनुमति देता है ताकि किसी भी बाहरी एसएच-SY5Ys को गिनती से बाहर रखा जा सके। अनुशंसित डाई सेल-पार्टेंट है, जो साइटोप्लाज्म, फिक्सेबल और गैर-विषाक्त (सामग्रियों की तालिका देखें) के भीतर एक अघुलनशील फ्लोरोसेंट उत्पाद में परिवर्तित हो जाता है। उच्च सामग्री इमेजिंग फैगोसाइटोसिस परख के साथ आईपीएससी-मैक्रोफेज के उपयोग के लिए धुंधला कदम अनुकूलित किया गया था, और हमारा सुझाव है कि यदि अन्य सेल प्रकारों का उपयोग किया जाता है तो इसे फिर से अनुकूलित किया जाना चाहिए। कोशिकाओं के भीतर अघुलनशील फ्लोरोसेंट उत्पाद के जमाव में सुधार करने के लिए कोशिका धुंधला की अवधि को बढ़ाया जा सकता है। यदि डाई एकाग्रता अनुकूलित है, तो कार्बनिक विलायक वाहन के जहरीले स्तर से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।

परख की सफलता के लिए तीसरा महत्वपूर्ण कारक डेटा विश्लेषण है। प्रदान की गई विश्लेषण पाइपलाइनों का उद्देश्य आदेशात्मक के बजाय मार्गदर्शन का होना है, क्योंकि तीव्रता या सेल आकृति विज्ञान को धुंधला करने के मतभेद लिखित पाइपलाइनों के विभाजन की प्रभावशीलता को कम कर सकते हैं। इसलिए उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों पर पाइपलाइन के परीक्षण के साथ कुछ अनुकूलन की आवश्यकता होगी, और जिन मापदंडों को अनुकूलित किया जाना चाहिए, वे प्रोटोकॉल पाठ में इंगित किए जाते हैं। नकारात्मक नियंत्रणों में एक ऐसी स्थिति शामिल होनी चाहिए जहां आईपीएससी-मैक्रोफेज को एसएच-SY5Ys के अलावा से पहले साइटोचलासिन डी जैसे शक्तिशाली फैगोसाइटोसिस अवरोधक के साथ पूर्व-इलाज किया जाता है। एक और संभव नकारात्मक नियंत्रण एसएच-SY5Ys के अलावा परख के अंत में आईपीएससी-मैक्रोफेज के पहले अनुपचारित कुओं के लिए है, निर्धारण से पहले 10 मिनट, जो कार्गो के कुछ बसने की अनुमति देता है, लेकिन phagocytosis की एक प्रशंसनीय मात्रा के लिए बहुत कम है । एक फागोसिटोसिस घटना को आईपीएससी-मैक्रोफेज की सीमाओं के भीतर एक लाल फ्लोरोसेंट वस्तु के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसे डीप रेड फ्लोरेसेंस चैनल का उपयोग करके सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम द्वारा परिभाषित किया गया है। यदि कोशिकाओं का विभाजन खराब है(चित्रा 2),तो आईपीएससी-मैक्रोफेज के करीब निकटता में कई गैर-फैगोसाइटेड एसएच-SY5Ys को गलत तरीके से विश्लेषण में शामिल किया जा सकता है, यानी झूठी सकारात्मक। अच्छे विभाजन को प्राप्त करने में सबसे महत्वपूर्ण कारक आईपीएससी-मैक्रोफेज का कठोर चित्रण है। दोनों विश्लेषणों के लिए विभाजन स्वचालित है, इसलिए हर सेल के लिए सही विभाजन प्राप्त करना संभव नहीं है; हालांकि, कुछ मापदंडों को विभाजन को अधिक इष्टतम बनाने के लिए समायोजित किया जा सकता है, संदर्भ के रूप में कुछ परीक्षण छवियों का उपयोग करके। इष्टतम विभाजन का आकलन करने के लिए साइटोचलासिन डी नियंत्रण महत्वपूर्ण है क्योंकि इस स्थिति में पाई गई फैगोसाइटिक घटनाओं की एक उच्च संख्या इंगित करती है कि विभाजन उप-इष्टतम है। डेटा विश्लेषण पाइपलाइन का अनुकूलन आदर्श रूप से तब तक दोहराया जाना चाहिए जब तक कि साइटोचलासिन डी कंडीशन बनाम कोई अवरोधक में प्रति फैगोसाइटिक घटनाओं की संख्या 80%-90% कम न हो।

फैगोसाइटोसिस परख के साथ समस्याएं जो सबसे अधिक होने की संभावना है: (1) सकारात्मक नियंत्रणों में कमजोर पीएच-संवेदनशील फ्लोरेसेंस, (2) परख के अंत में मैक्रोफेज का विरल या असमान वितरण, या (3) गैर-फैगोसाइटोस्ड एसएच-SY5Ys से विश्लेषण में झूठी-सकारात्मक की उच्च संख्या। कमजोर पीएच-संवेदनशील फ्लोरेसेंस के समस्या निवारण को सबसे पहले यह जांचना चाहिए कि एसएच-SY5Ys के धुंधला होने के परिणामस्वरूप एक मजबूत मैजेंटा रंग के साथ एक सेल गोली हुई। यदि रंग कमजोर है, तो सुनिश्चित करें कि एक ताजा डाई स्टॉक का उपयोग किया जाता है, यह सुनिश्चित करें कि लेबलिंग बफर अमीन-मुक्त है, धुंधला होने से पहले एसएच-SY5Ys में एक अतिरिक्त धोने जोड़ें, जांच करें कि एसएच-SY5Ys की सही संख्या दाग रही है या नहीं, यह सुनिश्चित करें कि कोई डाई उपजी सबूत में नहीं हैं, और डाई की लेबलिंग एकाग्रता को अनुकूलित करें। यदि एसएच-SY5Ys दृढ़ता से दाग रहे हैं, तो जांच करें कि क्या परख प्लेट में जोड़ा गया एकाग्रता सही है, और यह सुनिश्चित करें कि आईपीएससी-मैक्रोफेज स्वस्थ हैं और बहुत पुराने नहीं हैं। दूसरे प्रकार के मुद्दे, असमान मैक्रोफेज वितरण, पिपटिंग के दौरान कोशिकाओं के नुकसान से परिणाम दे सकते हैं और संकीर्ण-बोर युक्तियों से बचने के लिए कोशिकाओं द्वारा अनुभवी पाइपिंग बलों को कम करने के लिए कदम उठाए जाने चाहिए। अगर समस्या बनी रहती है तो सेल-परमीट डाई के साथ आईपीएससी-मैक्रोफेज लोड करने के इनक्यूबेशन समय को कम करें। तीसरी समस्या, विश्लेषण में गैर-phagocytosed कणों के गलत समावेश के बारे में, इंगित करता है कि विश्लेषण पाइपलाइन के अधिक अनुकूलन की आवश्यकता है । समस्या निवारण सबसे पहले सेल विभाजन पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए और क्या सॉफ्टवेयर आसन्न वस्तुओं सहित है । जिन विशिष्ट मापदंडों को समायोजित किया जा सकता है, उन्हें प्रासंगिक चरणों के नीचे दिए गए नोटों में सुझाव दिया जाता है (लाइव-सेल समय-चूक विश्लेषण के लिए चरण 6.1.11-6.1.15 और उच्च सामग्री विश्लेषण के लिए चरण 6.2.4-6.2.8)। यदि सेल सेगमेंटेशन को और बेहतर नहीं बनाया जा सकता है, तो उच्च सामग्री विश्लेषण में एक अतिरिक्त कदम (चरण 6.2.8) है जिसमें अनुचित रूप से खंडित आईपीएससी-मैक्रोफेज शामिल नहीं हैं। इसके अलावा, आईपीएससी-मैक्रोफेज के भीतर पीएच-संवेदनशील फ्लोरेसेंस के स्वीकृत स्थानों को फ़िल्टर करने वाले मॉड्यूल को अनुकूलित किया जा सकता है, जिससे स्वीकृत वस्तुओं की सीमा तीव्रता में वृद्धि होती है, जिससे गैर-फैगोसाइटोस्ड एसएच-SY5Ys (लाइव-सेल समय-चूक विश्लेषण के लिए चरण 6.1.17) को बाहर करने में मदद मिलनी चाहिए, और उच्च सामग्री विश्लेषण के लिए चरण 6.2.11)।

हमने फैगोसाइटोसिस परख के लिए दो प्रकार के माइक्रोस्कोपी रीडआउट विकसित किए हैं कि प्रत्येक के फायदे और सीमाएं हैं। लाइव-सेल टाइम-लैप्स इमेजिंग में फैगोसाइटोसिस काइनेटिक्स के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने के गुण हैं और उच्च सामग्री इमेजिंग प्लेटफार्मों की तुलना में अधिक व्यापक रूप से उपलब्ध है। अनुशंसित ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर माइक्रोस्कोप स्रोत के लिए नास्तिक है और इसका उपयोग लाइव-सेल समय-चूक क्षमता के साथ या बिना किसी अच्छी गुणवत्ता वाले फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ किया जा सकता है। लाइव-सेल इमेजिंग की मुख्य सीमा सीमित संवेदनशीलता और प्रकाशिकी है, जो आईपीएससी-मैक्रोफेज के अच्छे विभाजन का पता लगाना और प्रदर्शन करना अधिक चुनौतीपूर्ण बनाती है। इस सीमा को या तो आईपीएससी-मैक्रोफेज धुंधला की अवधि में वृद्धि करके, या यदि उपलब्ध हो तो अधिक संवेदनशील माइक्रोस्कोप पर स्विच करके कम किया जा सकता है। यदि उच्च सामग्री इमेजिंग इमेजिंग सिस्टम उपलब्ध है तो उच्च सामग्री इमेजिंग फैगोसाइटोसिस परख अनुशंसित रीडआउट है। उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम उच्च थ्रूपुट और अधिक विश्वसनीय डेटा को सक्षम करते हैं, जिससे इस परख का उपयोग स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है, जिसमें ≥0.7 के एक मजबूत जेड 'को "प्रति सेल स्पॉट की संख्या"आउटपुट 20के लिए उम्मीद की जाएगी। लाइव-सेल टाइम-लैप्स विधि की तुलना में, उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी रीडआउट में उच्च संवेदनशीलता होती है, स्वचालन और गति की उच्च डिग्री होती है, अधिक कुओं और इमेजिंग क्षेत्रों को संसाधित किया जा सकता है, और उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल छवियां उत्पादित की जाती हैं। सेल सेगमेंटेशन अच्छी छवियों के साथ अधिक प्रभावी है, और विभाजन को उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा अतिरिक्त रूप से सहायता प्रदान की जाती है जो अत्यधिक अनियमित आकार की कोशिकाओं के लिए उपयुक्त अधिक सेल विभाजन विधियां प्रदान करता है। उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर ने ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर की तुलना में फैगोसाइटोसिस के अधिक मापदंडों की भी गणना की, जैसे कि फैगोसाइटिक कोशिकाओं का प्रतिशत। उच्च सामग्री फैगोसाइटोसिस परख की मुख्य सीमा इमेजिंग सिस्टम और विश्लेषण सॉफ्टवेयर की लागत और पहुंच में से एक है।

अंत में, इस पेपर में प्रस्तुत मात्रात्मक फैगोसाइटोसिस परख विट्रो में मृत न्यूरॉन्स के माइक्रोग्लिया फागोसिटोसिस मॉडलिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण है। माइक्रोग्लिया को आईपीएससी-मैक्रोफेज द्वारा मॉडलिंग किया जाता है और मृत न्यूरॉन्स पैराफॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड एसएच-SY5Ys द्वारा मॉडलिंग कर रहे हैं । हालांकि सबसे प्रामाणिक माइक्रोग्लिया और मृत/एपोप्टोटिक न्यूरॉन मॉडल प्रकाशित नहीं है, ये तैयार करने के लिए आसान कर रहे है और स्केलेबल । परख ही अत्यधिक बहुमुखी है, इमेजिंग readout विस्तृत के दो प्रकार के साथ, और यह क्षमता के लिए विभिंन माइक्रोग्लिया/मैक्रोफेज मोनोकल्चर मॉडल, या एक अलग सेल प्रकार के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित करने के लिए phagocytic कार्गो के रूप में कार्य किया है । उच्च सामग्री इमेजिंग readout मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए लाभप्रद है और फागोसिटोसिस के छोटे अणु मॉड्यूलर, या आईपीएससी-मैक्रोफेज में स्क्रीन आनुवंशिक वेरिएंट को बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, चूंकि उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम महंगे और डेटा-भारी हैं, इसलिए एक वैकल्पिक इमेजिंग रीडआउट को प्रोटोकॉल में लाइव-सेल टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोप का उपयोग करके शामिल किया गया है, जिसे जरूरत पड़ने पर किसी भी अच्छी गुणवत्ता वाले पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ वैल मिल्लर और डॉ सोहैब निजामी और उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी तक पहुंच के लिए डॉ डेनियल एबरर को धन्यवाद देते हैं । इसके अलावा, लेखकों परख विकास सलाह के लिए डॉ एम्मा मीड शुक्रिया अदा करते हैं, और श्रीमती कैथी ब्राउन iPSC समर्थन के लिए । इस काम को ऑक्सफोर्ड मार्टिन स्कूल एलसी0910-004 से जेम्स मार्टिन स्टेम सेल फैसिलिटी ऑक्सफोर्ड (एए.C.) को अतिरिक्त सहायता के साथ अल्जाइमर रिसर्च यूके ऑक्सफोर्ड ड्रग डिस्कवरी इंस्टीट्यूट (ARUK ODDI, अनुदान संदर्भ ARUK-2020DDI-OX) द्वारा समर्थित किया गया था; पार्किंसंस यूके (J-1403) से स्मारक ट्रस्ट डिस्कवरी पुरस्कार; एमआरसी डिमेंशिया प्लेटफॉर्म यूके स्टेम सेल नेटवर्क कैपिटल इक्विपमेंट MC_EX_MR/N50192X/1, पार्टनरशिप एमआर/N013255/1, और मोमेंटम MC_PC_16034 अवॉर्ड्स ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tube Falcon 352096 For centrifugation of cells
2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes
2-mercaptoethanol 50 mM Gibco 31350010 Component of Factory media
4% paraformaldehyde in PBS Alfa Aesar J61899 For fixation of cells
6-well plate, tissue culture treated
AggreWell-800 24-well plate STEMCELL Technologies 34815 Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies
Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit Abcam ab14085 Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.
Automated cell counter
Benchtop centrifuge
Benchtop microcentrifuge
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid Perkin Elmer 6055302 96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay
CellProfiler software Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.
CellTracker Deep Red dye Thermo Fisher C34565 Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media. 
Class 2 laminar air flow safety cabinet
CO2 gas bottle Accessory for EVOS FL Auto
CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2
Columbus Image Data Storage and Analysis System Perkin Elmer Columbus Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.
Cytochalasin D Cayman 11330 Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM.
DMEM/F12 Gibco 11320074 Component of SH-SY5Y media
DMSO Sigma D8418 Solvent for CellTracker and pHrodo dyes
EVOS FL Auto Imaging System Thermo Fisher AMF4300 Live-cell time-lapse imaging microscope
EVOS Light Cube CY5 Thermo Fisher AMEP4656 Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Light Cube DAPI Thermo Fisher AMEP4650 Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Light Cube RFP Thermo Fisher AMEP4652 Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Onstage Incubator Thermo Fisher AMC1000 Accessory for EVOS FL Auto
Fetal Bovine Serum Sigma F4135 Component of SH-SY5Y media
Flow cytometer
Flow cytometry analysis software
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Invitrogen A1413302 hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture
GlutaMAX Supplement Gibco 35050-038 Component of both Factory and Macrophage media
HBSS Lonza BE 10-547F Hank’s balanced salt solution for washing steps
Human recombinant BMP4 Gibco PHC9534 Component of Embryoid Body media
Human recombinant IL-3 Gibco PHC0033 Component of both Factory and Macrophage media
Human recombinant SCF Miltenyi Biotech 130-096-695 Component of Embryoid Body media
Human recombinant VEGF Gibco PHC9394 Component of Embryoid Body media
Live Cell Imaging Solution Thermo Fisher A14291DJ Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys
Low protein binding 2 mL tubes Eppendorf 30108.132 For staining SH-SY5Ys
M-CSF Thermo Fisher PHC9501 Component of both Factory and Macrophage media
mTeSR1 Medium STEMCELL Technologies 85850 iPSC media
Multichannel 20-200 uL pipette For liquid handling of 96-well plate
NucBlue Live ReadyProbes Reagent Thermo Fisher R37605 Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.
Opera Phenix High-Content Screening System Perkin Elmer HH14000000 High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media
pHrodo iFL Red STP-Ester Thermo Fisher P36011 pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution. 
Serological pipette filler
T175 flask, tissue culture treated Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories"
T75 flask Vessel for SH-SY5Y culture
Transparent plate sealers Greiner Bio-One 676001 For assay plate storage and transportation
TrypLE Express (1X), no phenol red Gibco 12604013 Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.
Water bath, set to 37°C
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red Lonza BE04-418F Component of Factory and Macrophage media
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red Lonza 04-744Q Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors

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References

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Hall-Roberts, H., Di Daniel, E., James, W. S., Davis, J. B., Cowley, S. A. In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages. J. Vis. Exp. (168), e62217, doi:10.3791/62217 (2021).

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