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Biochemistry

Fluorimetría de barrido nanodes diferencial para el cribado en el descubrimiento de plomo basado en fragmentos

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/62469
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1, 1
1Oncode Institute and Division of Biochemistry, the Netherlands Cancer Institute, 2Institute for Organic Chemistry and Chemical Biology, Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Johann Wolfgang Goethe-University

Summary

El monitoreo de los cambios en la temperatura de fusión de una proteína objetivo(es decir,el ensayo de cambio térmico, TSA) es un método eficiente para examinar bibliotecas de fragmentos de unos pocos cientos de compuestos. Presentamos un protocolo TSA que implementa la fluorimetría de escaneo nano-diferencial asistida por robótica (nano-DSF) para monitorear la fluorescencia intrínseca de triptófano y la retrodisparión de luz para la detección de fragmentos.

Abstract

Los ensayos de cambio térmico (ECA) examinan cómo cambia la temperatura de fusión (Tm)de una proteína objetivo en respuesta a los cambios en su entorno(por ejemplo,la composición del tampón). La utilidad de la TSA, y específicamente de la fluorimetría de barrido nano-diferencial (nano-DSF), se ha establecido a lo largo de los años, tanto para encontrar condiciones que ayuden a estabilizar una proteína específica como para observar la unión al ligando mediante el monitoreo de los cambios en el aparente Tm. Este artículo presenta un cribado eficiente de la biblioteca de fragmentos Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) (768 compuestos) mediante el uso de nano-DSF, monitoreando Tm para identificar la posible unión de fragmentos. Los requisitos previos con respecto a la calidad y concentración de proteínas para realizar experimentos nano-DSF se describen brevemente seguidos de un protocolo paso a paso que utiliza un dispensador robótico de nano litros comúnmente utilizado en los laboratorios de biología estructural para preparar las muestras requeridas en placas de 96 pozos. El protocolo describe cómo las mezclas de reactivos se transfieren a los capilares necesarios para las mediciones de nano-DSF. Además, este documento proporciona protocolos para medir la desnaturalización térmica (monitoreo de la fluorescencia intrínseca de triptófano) y la agregación (monitoreo de la retro-dispersión de la luz) y los pasos posteriores para la transferencia y el análisis de datos. Finalmente, se discuten experimentos de detección con tres objetivos de proteínas diferentes para ilustrar el uso de este procedimiento en el contexto de las campañas de descubrimiento de plomo. El principio general del método descrito puede transferirse fácilmente a otras bibliotecas de fragmentos o adaptarse a otros instrumentos.

Introduction

Los programas de descubrimiento de fármacos a menudo comienzan examinando compuestos químicos por su capacidad para interactuar y / o modificar la función de los objetivos de los medicamentos, la mayoría de las veces proteínas. Los llamados "hits" que se encuentran en tales pantallas, establecen las bases para el descubrimiento de nuevas pistas y candidatos de desarrollo, y para la mayoría de los nuevos medicamentos que se están licenciando en estos días. Por lo tanto, la disponibilidad de métodos de alto rendimiento es indispensable para examinar un enorme número de objetivos disponibles con un gran número de compuestos diferentes para identificar rápidamente su unión estricta o su capacidad para modular una función específica del objetivo. Después de que se identifican los aciertos, las combinaciones de objetivos de acierto más prometedoras se introducen en una extensa cartera de desarrollo de fármacos utilizando otras tecnologías, a menudo costosas y que consumen mucho tiempo, para comprender las "relaciones estructura-actividad" (SAR).

Los enfoques de biología estructural, como los ofrecidos por los programas de acceso financiados con fondos de la UE "Infrastructure for NMR, EM, and X-rays for Translational Research" (iNEXT) y su sucesor actual iNEXT-Discovery, se utilizan a menudo para estudiar las interacciones de numerosos compuestos con extremo detalle al tiempo que mejoran la afinidad y las propiedades farmacológicas de los golpes iniciales mediante varias rondas de química sintética1. Los compuestos de plomo que surgen de estas campañas "de golpe a plomo" se convierten en candidatos de desarrollo y entran en estudios preclínicos. La metodología de detección molecular bien desarrollada se puede clasificar aproximadamente en dos enfoques, a saber, el descubrimiento de plomo basado en ligandos (LBLD) y el descubrimiento de plomo basado en fragmentos (FBLD). En las campañas de LBLD, los receptores de proteínas se examinan con unos pocos miles de ligandos seleccionados a mano (basados en la estructura de los ligandos naturales o la estructura del objetivo), o con muchas decenas de miles de compuestos en bibliotecas de ligandos similares a medicamentos que cubren una gran parte del espacio químico.

Por lo general, los compuestos se prueban para su actividad inhibitoria en un ensayo de actividad, generalmente monitoreando una función enzimática. En las campañas FBLD2,3,4,5,sin embargo, algunos cientos de compuestos que suelen ser más pequeños que los medicamentos (100-200 Dalton) se prueban por su capacidad para unirse al objetivo directamente, sin el uso de un ensayo de actividad. Esta unión podría interferir con la actividad objetivo y puede medirse mediante muchos métodos biofísicos que informan directamente sobre la capacidad de los fragmentos para unirse al objetivo, o por métodos estructurales como la cristalografía de rayos X6 y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear7,y más recientemente, también la microscopía crioeónica. Cuando los fragmentos se unen en diferentes lugares que están cerca uno del otro en la proteína, los diferentes fragmentos de unión, generalmente de baja afinidad, se pueden combinar racionalmente químicamente para crear un pequeño conjunto de pistas que se pueden estudiar con más detalle. Esto con frecuencia resulta en compuestos de mayor afinidad y más potentes, y esta metodología ha comenzado a producir moléculas importantes con potencial clínico. La elección de una biblioteca de fragmentos "ideal" que explote los grupos químicos de manera eficiente ha sido un área activa de investigación durante muchos años8,9,10.

Si bien el énfasis inicial se centró en cubrir todo el espacio químico, la atención posterior se centró en permitir que la combinación química aguas abajo de los impactos de fragmentos produjera compuestos de plomo. Tal investigación ha llevado a las llamadas bibliotecas "preparadas". Estos contienen fragmentos con al menos un grupo funcional que permiten un seguimiento rápido y barato de la química sintética para un progreso eficiente en el estudio de SAR. Una de las actividades catalizadas por iNEXT fue actualizar la biblioteca preparada desarrollada por investigadores del Diamond Light Source and Structural Genomics Consortium. Este esfuerzo combinado dio como resultado la biblioteca DSi-Poised11,que también ha sido validada dentro de iNEXT12. Más tarde, esta biblioteca se alineó con la disponibilidad de compuestos en la base de datos REAL de Enamine Ltd., una organización de investigación química y productora de grandes colecciones de bloques de construcción y bibliotecas de compuestos para la detección. DSi-Poised ahora está disponible para cualquier persona para su compra, pero también está disponible en muchos laboratorios asociados de iNEXT-Discovery para proyectos de detección de fragmentos compatibles.

Las tecnologías de cristalografía de rayos X de alta gama y biología estructural de RMN tienen sus ventajas y desventajas para FBLD. Ambos requieren muestras de objetivos aisladas y producen los detalles atómicos de alta resolución que se requieren para FBLD. Sin embargo, los cristales son necesarios para la cristalografía de rayos X, y los fragmentos se unen a cavidades en las regiones de proteínas bien ordenadas que no están involucradas en la construcción de la red cristalina tridimensional. La RMN en solución a menudo produce diferentes impactos de la cristalografía de rayos X, ya que no se ve afectada por el entorno cristalino y es buena para detectar la unión también en regiones proteicas parcialmente ordenadas. Sin embargo, aunque los experimentos de RMN basados en ligandos son relativamente rápidos, todavía requieren una cantidad sustancial de tiempo y material y se pueden hacer rutinariamente solo para objetivos o dominios de proteínas relativamente pequeños. Con el propósito de priorizar compuestos para experimentos cristalográficos o de RMN, se han utilizado enfoques biofísicos13,14,15.

A medida que la instrumentación reciente y los protocolos computacionales permiten una detección cristalográfica eficiente para FBLD al determinar estructuras y analizar ~ 1,000 fragmentos de manera muy eficiente, esta priorización se ha vuelto menos esencial en la investigación basada en rayos X. Sin embargo, para la RMN, sigue siendo deseable utilizar experimentos más baratos y rápidos para priorizar la detección de la biblioteca y ahorrar tiempo del instrumento en los equipos de gama más alta. Al mismo tiempo, el uso de una combinación de tecnologías esencialmente diferentes puede proporcionar una confirmación independiente de eventos vinculantes, o incluso golpes adicionales que no se recogen empleando solo el método de cristalografía o RMN. Las técnicas cristalográficas y de RMN requieren equipos muy costosos y, a menudo, solo se pueden realizar en instalaciones externas dedicadas con la ayuda de expertos locales altamente calificados. Además, el análisis adecuado de los resultados también exige una gran experiencia. Si bien programas como iNEXT e iNEXT-Discovery están democratizando el acceso a tales instalaciones16, se ha reconocido que la detección de FBLD barata, rápida y de alto rendimiento por otros métodos puede alentar los programas de detección de drogas en una gama mucho más amplia de laboratorios. Tales resultados se pueden usar como una indicación para construir colaboraciones con químicos medicinales y priorizar los experimentos de detección más costosos a los compuestos más prometedores si las instalaciones de RMN y cristalografía imponen restricciones en el número de compuestos que se pueden examinar.

La TSA forma un método biofísico rápido, eficiente y relativamente barato y accesible17 que se puede utilizar para la detección de FBLD. Se ha utilizado en múltiples entornos, desde ayudar a encontrar condiciones proteicas estables para ensayos de cristalización18,hasta encontrar compuestos que se unen a objetivos específicos en las células19. Los AAST también se han utilizado para medir las constantes de disociación de las proteínas diana de unión a ligandos, ya que la unión a ligandos a menudo conduce a alteraciones en la estabilidad térmica. En todos los ATS, el cambio en la temperatura de desnaturalización de una proteína (su estabilidad) se mide en función de un aumento lento de la temperatura. Una forma eficiente de seguir la desnaturalización de proteínas al calentarse es mediante DSF o Thermofluor, que cuantifica el enfriamiento por fluorescencia de un colorante hidrófobo (típicamente naranja Sypro) tras la interacción con regiones hidrofóbicas expuestas de proteína que se despliega debido al aumento de la temperatura.

Nano-DSF se refiere típicamente a la medición de la estabilidad térmica de la proteína en ausencia de colorantes externos. Uno de los primeros instrumentos que ofreció esta posibilidad fue el OPTIM1000 que mide un amplio espectro de intensidad de luz, así como la dispersión de la luz de una muestra. Esta máquina permitió la medición simultánea del despliegue de proteínas (típicamente después de la fluorescencia de triptófano) y la agregación de proteínas (ya que las nanopartículas formadas resultan en un aumento de la dispersión de la luz a ~ 400 nm). Más tarde, el Prometheus introdujo el uso de la retrorreflectación para medir la agregación y la detección sensible de la señal de fluorescencia, permitiendo el cribado de bajas concentraciones de proteínas con buena sensibilidad20. En la siguiente sección se describe cómo se utilizó Prometheus para demostrar un protocolo de detección de fragmentos para detectar impactos para diferentes objetivos de proteínas. Una breve introducción sobre la calidad y cantidad de proteína esperada es seguida por un protocolo paso a paso para preparar, realizar y analizar los experimentos de detección de fragmentos. Los resultados de cribado de tres proteínas se han mostrado como datos de ejemplo obtenidos como parte de las colaboraciones iNEXT-Discovery.

Protocol

NOTA: Las proteínas utilizadas en los experimentos de nano-DSF deben ser puras (>95%) y homogéneas según lo juzgado por la electroforesis en gel de dodecilsulfato-poliacrilamida de sodio. Antes de realizar el criba de fragmentos, se debe determinar la estabilidad de las proteínas en diversas condiciones tampón. Se debe usar un tampón de baja fuerza iónica y baja sal que interfiera mínimamente con la proteína para no afectar su interacción directa con los fragmentos. Los búferes que se utilizan normalmente en este protocolo para comprobar la estabilidad se muestran en la Tabla suplementaria S1. La concentración de la proteína que debe utilizarse para este experimento como solución de stock es típicamente de 0,2 mg ml-1. Para examinar toda la biblioteca DSi-Poised (768 compuestos), se necesita un total de ~ 12 ml de proteína de esa concentración, un total de ~ 2.5 mg. La biblioteca DSi-Poised utilizada en estos experimentos se suministró en formato de 96 pozos(Figura 1). La concentración de los fragmentos se ajustó a 100 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) al 20% v/v. Cabe señalar que el protocolo de mezcla descrito aquí da como resultado bajas concentraciones finales de DMSO de 0.4% v / v; aunque es muy poco probable que esto afecte la estabilidad de la proteína, se debe verificar el efecto de DMSO para cada nueva proteína.

Figure 1
Figura 1: Los tipos de placas utilizadas para estos experimentos. (A) Placa de fondo en U. (B) Placa de 96 pozos. (C) Una vista en primer plano de la placa de 96 pozos que muestra el subwell 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación del plato

  1. Saque una placa de fragmento del congelador de -20 °C/-80 °C y déjela descongelar a temperatura ambiente, con un suave agitación en un agitador de sobremesa. Centrifugar la placa a 500 × g durante 30 s para recoger las gotas que se adhieren al costado de los pozos.
    NOTA: Como la biblioteca de fragmentos está disponible disuelta en DMSO-d6 (punto de fusión 19 °C), es esencial asegurarse de que cada compuesto esté completamente descongelado y solubilizado.
  2. Tome una placa de cristalización MRC de 2 pozos(Figura 1A)y pipetee 14.7 μL de la solución de almacenamiento de proteínas en cada subsano. Para hacer esto de una manera eficiente en el tiempo, mantenga la proteína en un depósito de reactivo(Tabla de Materiales)y use una pipeta multicanal para la dispensación(Figura 2A,B).
    NOTA: Para la biblioteca DSi-Poised, dependiendo del formato, no todos los pozos de la placa de 96 pozos contienen compuestos. Normalmente, las filas A, H y las columnas 1, 12 se rellenan con DMSO. Por lo tanto, las filas A, H y las columnas 1, 12 no deben llenarse con proteínas, ya que estos pozos no contendrán ningún fragmento al final del siguiente paso; solo DMSO será transferido allí por el robot. Tenga en cuenta que las filas y columnas vacías difieren en algunas placas.

Figure 2
Figura 2: Esquema del procedimiento de cribado de fragmentos. (A) Utilización de una pipeta multicanal y un depósito de reactivo para dispensar la proteína. (B) Dispensar la proteína en la placa de 96 pozos. (C) Dosificación de fragmentos por el robot dispensador. (D) Carga de la proteína en los capilares. (E) Cajón que muestra el soporte capilar. (F) Vista de cerca del titular capilar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Descripción general del equipo utilizado en estos experimentos. ( A )Robotnanodispensador utilizado para la dispensación de fragmentos. Se indican las posiciones de las placas. (B) Interfaz de programa para definir una nueva placa. (C) Interfaz del programa dispensador. (D) El programa de dispensación utilizado para dispensar los fragmentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Nanodisposición de fragmentos por el robot Mosquito

  1. Compruebe el tipo de placa en la que se suministran los fragmentos (Tabla de Materiales).
  2. Verifique las definiciones de fragmentos y placas de proteínas en el mosquito.
    1. Encienda el nanodispensador(Figura 3A). Asegúrese de que no haya obstáculos alrededor de los componentes móviles.
    2. Abra la interfaz gráfica de usuario, haga clic en la pestaña Configuración, y en Configuración de cubierta,verifique si el tipo de placa en la que se suministran los compuestos y aquella en la que se ha transferido la proteína en la sección 1 ya están presentes en la lista de las placas disponibles. De lo contrario, haga clic en Opciones| Placas y cree una nueva definición de placa rellenando los valores correctos para el tipo de propiedad (Figura 3B).
      NOTA: Estos valores para la placa MRC de 2 pozos y la placa de 96 pozos utilizados en este experimento se muestran en la Tabla Suplementaria S2 y la Tabla Suplementaria S3,respectivamente.
  3. El programa de dispensación
    1. En la ficha Configuración, especifique las posiciones de la placa en Configuración de cubierta.
      NOTA: El mosquito utilizado en este experimento tiene dos posiciones de placa en la cubierta. La posición 1 se define como la placa de origen,y la posición 2 es la placa de destino.
    2. Usando el menú desplegable, elija placa inferior Greiner U para la Posición 1 y placa MRC 2-well para la Posición 2 (Figura 2C). Guarde el protocolo.
  4. Dispensación de fragmentos
    1. Coloque la placa de fragmento en la Posición 1 y la placa de proteína en la Posición 2 de la cubierta (Figura 3A).
    2. En la ficha Protocolo (Figura 3D),haga clic en Archivo y elija el protocolo guardado en la sección 2.3 para dispensar los fragmentos. Definir el volumen de los fragmentos a dispensar; utilizar 0,3 μL. Para una placa típica, donde las columnas 1 y 12 no contienen fragmentos, defina la ubicación Inicio en la columna 2 y la ubicación Final en la columna 11. En algunas placas, si las columnas 2 u 11 están vacías, use las columnas 3 y 10 como valores de inicio y fin, respectivamente.
      NOTA: Debido a la configuración de Mosquito, solo se pueden omitir columnas, no filas; para las filas, el mosquito pipeteará DMSO. Asegúrese de que la opción Cambio de sugerencias esté seleccionada como Siempre, para no contaminar la biblioteca de fragmentos.
    3. Haga clic en Ejecutar para iniciar el programa. Después de completar la dispensación, que tarda ~ 2 minutos, retire la proteína y las placas de fragmentos del robot y vuelva a sellarlas con una película de sellado adhesiva. Centrifugar brevemente la placa de proteína (500 × g,30 s) para recoger las gotas que se adhieren a los lados de los pozos antes de proceder al siguiente paso.

3. Medición de nano-DSF

NOTA: Anteriormente se ha publicado una descripción detallada sobre la realización de NSA mediante El NT.48 de Prometheus20. Aquí se mencionan puntos importantes en el contexto de la detección de fragmentos.

  1. Inspección de placas antes de la medición
    1. Inspeccione visualmente los pozos de la placa de proteínas en busca de precipitaciones que podrían haber ocurrido debido a la adición de los fragmentos. Si se observa precipitación en muchos pozos, reduzca la concentración de los fragmentos y repita el experimento.
      NOTA: Se recomienda mantener la placa de proteína a temperatura ambiente; los fragmentos tienden a volverse insolubles a temperaturas más bajas.
  2. Preparando el Prometeo
    1. Encienda el instrumento Prometheus. En la pantalla táctil, pulse Abrir cajón para acceder al módulo de carga capilar del instrumento. Retire la banda magnética del módulo de carga y limpie el espejo con etanol para eliminar cualquier partícula de polvo.
  3. Transferencia de la placa de fragmentos de proteína a los capilares
    NOTA: Este paso implica transferir la muestra mixta de proteína / fragmento de cada pozo en la placa de proteína a los capilares para su uso con el Prometheus. Para esto, aunque normalmente se utiliza el tipo capilar estándar, es posible utilizar los capilares de alta sensibilidad para concentraciones de proteínas muy bajas.
    1. Coloque la placa de proteína y los capilares junto al instrumento para tener fácil acceso al módulo de carga capilar.
    2. Tome un capilar, sostenlo en un extremo y toque la solución en la placa de proteína con el extremo más alejado del capilar para transferir la muestra por acción capilar. Siempre use guantes y asegúrese de no tocar el capilar en el medio, ya que las impurezas(por ejemplo,partículas de polvo) de los guantes afectarían la medición.
    3. Coloque el capilar en la posición designada del soporte, asegurándose de que esté correctamente alineado y centrado.
    4. Repita los pasos 3.3.2 y 3.3.3, llenando así todas las posiciones del módulo de carga. Cargue todos los capilares que necesitará para la medición.
      NOTA: Para una sola tirada, se puede cargar un máximo de 48 capilares.
    5. Al final, coloque la banda magnética en la parte superior de los capilares para mantenerlos en su lugar y presione Cerrar cajón para comenzar el experimento.
  4. Realizar el experimento nano-DSF
    1. Gammagrafía con fluorescencia
      1. Abra la aplicación Prometheus PR. ThermControl, y cree un nuevo proyecto haciendo clic en Iniciar nueva sesión con el nombre ProteinName_ScreenName_PlateNumber. Primero, haga un Discovery Scan para detectar la fluorescencia de las muestras.
        NOTA: Los niveles de fluorescencia idealmente deben estar por encima de 3,000 recuentos para cada muestra. No se medirán las muestras que tengan fluorescencia por encima del límite de saturación del instrumento (20.000 recuentos).
      2. Alterar la señal de fluorescencia de las muestras ajustando el poder de excitación del láser (Figura 4).
    2. Desnaturalización térmica
      1. Haga clic en la pestaña Melting Scan. Para realizar el experimento, ajuste la temperatura de inicio a 20 °C, la temperatura final a 95 °C y la pendiente de temperatura a 1 °C min-1. Haga clic en Iniciar medición.
    3. Anotación del experimento
      1. Después de que comiencen los experimentos, haga clic en la pestaña Anotación y resultados. Anota cada capilar dándole un número único de placa y pozo.
        NOTA: Por ejemplo, el capilar 1B2 correspondería a la Placa 1 y al pozo B2. En esta pestaña, se pueden agregar columnas adicionales para el experimento, por ejemplo,nombre de la proteína, tampón, concentración de proteínas. Una vez finalizado el experimento, los resultados también se muestran en esta pestaña. Este es un buen momento para hacer una pausa al final del día; los experimentos se llevan a cabo durante la noche, los resultados se pueden recopilar al día siguiente.
    4. Visualización y exportación de datos
      1. Una vez finalizado el experimento, haga clic en la pestaña Melting Scan para ver las curvas de fusión y dispersión de las muestras. Para exportar los resultados en una hoja de cálculo, haga clic en la pestaña Melting Scan, haga clic en Exportary elija Exportar datos procesados en el menú desplegable.

Figure 4
Figura 4: Ajuste de la potencia de excitación y la señal de fluorescencia. ( A ) Conunapotencia de excitación del 80%, la señal de fluorescencia para la mayoría de las muestras está más allá del límite de saturación. (B)La señal de fluorescencia se reduce a niveles medibles al disminuir el poder de excitación al 60%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Iteración

  1. Repita los pasos 1-3 para realizar 16 ejecuciones en toda la biblioteca de Enamine de 768 compuestos (16 × 48 = 768).
  2. Como la medición de cada placa tarda ~1,5 h en completarse, complete la anotación (3.4.3) y prepare la siguiente placa de fragmentos de proteína repitiendo los pasos de las secciones 1 y 2.
    NOTA: En un día de trabajo típico, se pueden medir 4-6 placas, dependiendo de la experiencia. La proyección de toda la biblioteca DSi se puede terminar en un total de 3-4 días.

5. Análisis de datos

  1. Examinar los datos generados
    1. Una vez completada cada ejecución, haga clic en la pestaña Anotaciones y resultados para mostrar los resultados. Para cada muestra, concéntrese en dos valores calculados que son más importantes en esta visión general: 1) La temperatura de inicio de dispersión (Inicio # 1 para Dispersión), que indica la temperatura al comienzo del aumento de los eventos de dispersión de la muestra y es característica de la agregación; 2) el valor Tm (Punto de inflexión #1 para La relación)extraído de la relación entre los eventos de fluorescencia a valores de 330 y 350 nm que típicamente corresponden a los cambios máximos de la fluorescencia de triptófano sobre los cambios en su entorno.
    2. Asegúrese de verificar la dispersión y las curvas de fusión para cada capilar en la pestaña Escaneo de fusión para asegurarse de que estos valores sean confiables.
  2. Exportación e inspección a una hoja de cálculo
    1. Exporte los datos de todas las diferentes ejecuciones para su inspección a un software de hoja de cálculo, como se describe en 3.4.4, y para crear tablas y gráficos generales. Haga clic en las diversas hojas de cálculo en el archivo de hoja de cálculo para anotar la información en cada hoja.
      1. En la hoja Información general, tenga en cuenta que cada fila corresponde a un experimento. A lo largo de una descripción general de los parámetros(por ejemplo,temperatura inicial y final), observe los valores calculados para el Tm y el inicio de la dispersión (consulte 5.1 anterior para nombres y explicación, y archivos suplementarios 1 y 2 para un ejemplo). Como el software calcula dos o más valores de Tm (punto de inflexión # 1 y # 2 para ratio) para algunas muestras, observe la curva de transición de fusión para determinar cuál de los valores de Tm es correcto.
      2. En la hoja Ratio, observe que cada columna corresponde a una muestra y cada fila a los datos leídos en cada paso de temperatura. Observe los valores de recuento de fluorescencia correspondientes a cada paso de temperatura y utilízalos para trazar las curvas de fusión para muestras específicas, trazando la columna de temperatura contra la columna de recuento de fluorescencia. Tenga en cuenta que los datos de la Relación (primera derivada), 330 nm, 330 nm (primera derivada), 350 nm, 350 nm (primera derivada) se utilizan para calcular la relación y su primera derivada (que tiene un máximo a la tasa máxima de cambio) en un formato similar.
      3. Observe datos similares para la dispersión en la hoja de dispersión. Genere la curva de dispersión para cada muestra trazando la columna de temperatura contra la columna de dispersión. Busque la Hoja para la primera derivada de dispersión.
  3. Creación y validación de una visión general global para todos los fragmentos
    1. Después de verificar los valores correctos de Tm para los fragmentos, combine las columnas ID de ejemplo y Punto de inflexión de relación 330/350 nm (Tm)de todas las ejecuciones en un único archivo de resultado nuevo, copiando estas columnas de cada ejecución.
    2. Utilice el valor promedio de Tm de la proteína nativa (típicamente calculado en diez tiradas) y reste de los valores de Tm de cada muestra, para obtener el ΔTm. Ordene los resultados sobre ΔTm en orden descendente para identificar las muestras que dan como resultado el mayor desplazamiento.
    3. Divida los fragmentos en contenedores dependiendo del desplazamiento ΔTm, y genere una tabla de frecuencias para toda la biblioteca trazando el ΔTm para cada contenedor contra el número de fragmentos (Figura 5). Para mayor comodidad, muestre el eje que representa el número de fragmentos en la escala logarítscula. Bin la muestra con ΔTm ±1, y adaptar los otros bins a cada ejecución para ajustar empíricamente el número de valores atípicos.

Representative Results

Se realizó una pantalla completa de la biblioteca DSi-Poised (768 fragmentos) en tres proteínas de interés médico, a saber, el cinetocoro externo altamente expresado en la proteína Cancer 1 (Hec1, o Ndc80), el dominio regulador de repetición tetraricopéptida (TPR) de la quinasa 1 del huso monopolar (Mps1) y la proteasa similar al SARS-CoV-2 3C, Nsp5, que se desprende del extremo C de la poliproteína replicasa en 11 sitios. Las condiciones tampón elegidas para cada proteína, así como la concentración de proteínas y Tm de las proteínas, se muestran en la Tabla Suplementaria S4.

Figure 5
Figura 5: Distribución de frecuencia del cambio en la temperatura de fusión (ΔTm)para las tres proteínas, Hec1, Mps1 y Nsp5, presentadas en este estudio como resultados representativos. Abreviaturas: Hec1 = Proteína altamente expresada en cáncer 1; Mps1 = quinasa monopolar del huso 1; Nsp5 = proteasa similar al SARS-CoV-2 3C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los resultados de los tres cribado utilizando el protocolo descrito anteriormente, mostrados como la distribución de frecuencia del cambio en Tm versus el número de fragmentos, se muestran en la Figura 5. Estas gráficas se han generado tal y como se describe en el apartado 5.3 del protocolo, trazando la frecuencia del cambio observado en Tm. La importancia del cambio debe definirse de manera subjetiva para cada proyecto diferente, como se describe en la sección de discusión a continuación. Los valores negativos indican una reducción en la temperatura de fusión en presencia de un fragmento, un valor positivo un aumento en Tm. A partir de tales gráficas, es fácil observar que para Nsp5, todos los fragmentos tienen un efecto desestabilizador, mientras que para Hec1 y Mps1, se observan golpes estabilizadores y desestabilizadores. Esto se puede esperar y se discutirá.

Discussion

Este protocolo describe un método de rendimiento medio a alto para examinar bibliotecas de fragmentos utilizando algunos instrumentos comunes de robótica y medición. Las pantallas como las descritas en este protocolo pueden ser realizadas rutinariamente por la Instalación de Proteínas NKI en Ámsterdam, por ejemplo, como un servicio iNEXT-Discovery, a menudo incluso de forma gratuita para los usuarios después de la solicitud de propuesta y la revisión por pares. En tales casos, la biblioteca DSi-Poised puede ser proporcionada por la instalación, pero el uso de otras bibliotecas también se puede discutir en el contexto de cada aplicación de usuario diferente y acuerdo de servicio. La elección de los instrumentos en este protocolo representa soluciones prácticas para muchos laboratorios, pero no debe considerarse como un estándar de oro. Se recomiendan métodos sin etiquetas para medir la estabilidad térmica de la proteína objetivo para el cribado de fragmentos, en lugar de métodos que utilizan etiquetas ambientalmente sensibles para detectar el despliegue en un termociclador de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa.

Los métodos sin etiquetas, como el que se presenta aquí utilizando el instrumento Prometheus, tienen algunas ventajas: utilizan bajas cantidades de proteína, a menudo un par de órdenes de magnitud menos; pueden utilizarse para medir simultáneamente la dispersión de la muestra y, por lo tanto, la agregación; y las etiquetas utilizadas para detectar el despliegue en otros enfoques pueden interactuar de manera diferente con cada fragmento, lo que resulta en artefactos de medición. Este protocolo se ha descrito en el contexto del robot Mosquito, que permite el pipeteo de un volumen muy pequeño de muestra (0,3 μL) que no se puede hacer manualmente. El Mosquito es un robot popular, presente en muchos laboratorios que trabajan en biología estructural y proyectos de descubrimiento de fármacos; sin embargo, el protocolo puede utilizar claramente enfoques alternativos para el pipeteo de bajo volumen.

Las bibliotecas de fragmentos contienen compuestos disueltos en DMSO. Uno de los desafíos iniciales es encontrar la concentración óptima de DMSO en la que la proteína permanezca estable y los compuestos permanezcan solubles. Esto implica realizar las mediciones a varias concentraciones de DMSO para determinar las condiciones óptimas para la detección. La dilución de proteína a fragmento utilizada aquí da como resultado concentraciones de DMSO de 0.2%; la mayoría de las proteínas son bastante estables en estas condiciones. La cantidad de proteína requerida para llevar a cabo el cribado para la biblioteca de 768 compuestos es de ~ 2-3 mg en total, ya que las mediciones se llevan a cabo típicamente a bajas concentraciones de proteínas (0.2 mg mL-1). Trabajar con concentraciones de proteínas relativamente bajas no solo reduce los costos de producción de proteínas, sino que también reduce las posibilidades de precipitación de proteínas. La baja concentración de proteínas no afecta la detección de la unión a fragmentos, ya que la concentración de los fragmentos en el experimento es de ~ 2 mM, lo que permite identificar también aglutinantes débiles.

Como la detección de transición de fusión en estos experimentos se basa en la intensidad de la fluorescencia, un aspecto crítico es determinar el poder de excitación del láser al que llevar a cabo las mediciones. La interacción de los compuestos con la proteína puede (i) no tener ningún efecto sobre su fluorescencia intrínseca, (ii) resultar en enfriamiento, o (iii) aumentar su fluorescencia intrínseca. Además de esto, trabajar con bajas concentraciones de proteínas significa que el recuento de fluorescencia para la proteína nativa sería bajo. Por lo tanto, la potencia de excitación debe ajustarse de tal manera que se puedan medir la mayoría de las muestras. El perfil de dispersión de cada ejecución proporciona información importante sobre los efectos de agregación que podrían desencadenarse por la adición de cualquier fragmento. Además, el efecto de la temperatura sobre la solubilidad del compuesto también se puede ver en el perfil de dispersión.

Inesperadamente, para muchos compuestos se observó que la dispersión en realidad disminuyó con el aumento de la temperatura(Figura 6). Por lo tanto, es importante observar tanto la curva de transición de fusión como el perfil de dispersión que lo acompaña para decidir sobre la confiabilidad de cada experimento, especialmente para aquellos fragmentos que se consideran candidatos para mediciones más exigentes por cristalografía de rayos X o espectroscopia de RMN, o incluso considerados como éxitos para la química de seguimiento. Una limitación específica del método para fines de detección de fragmentos es que muchos fragmentos en la biblioteca DSi-Poised tienen una fluorescencia intrínseca significativa, a veces incluso más allá del límite de saturación del detector, y por lo tanto estos no pueden ser examinados adecuadamente para la unión al objetivo incluso a baja potencia de excitación. Otro punto a tener en cuenta para este método es que solo se puede usar con proteínas que contienen residuos de triptófano.

Figure 6
Figura 6: Efecto de la temperatura sobre la solubilidad del compuesto. Curva de transición de fusión y perfil de dispersión de Hec1 con dos compuestos diferentes. (A) El perfil de dispersión muestra que para esta muestra, la solubilidad no se ve afectada por la temperatura. (B) El perfil de dispersión muestra que la solubilidad de esta muestra aumenta con el aumento de la temperatura. Por lo tanto, la curva de transición de fusión en este caso no es confiable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una pregunta abierta es qué debe considerarse como un cambio significativo en Tm,no desde una perspectiva matemática, sino desde el punto de vista práctico: ¿qué cambio en Tm es importante considerar como indicativo de la unión de un ligando a una proteína? En estos ejemplos, se observan desplazamientos de menos de 1 °C para el 74% de los fragmentos para la unión de Hec1, el 66% para Mps1 y el 53% para Nsp5. Considerar 1 °C como "cambio significativo" difícilmente proporcionaría golpes que sean dignos de perseguir mediante la química de seguimiento. En los gráficos generales(Figura 5),se consideraron contenedores de 1, 2, 5 o más de 5 grados de desplazamiento de Tm, ya sea positivo o negativo. Esto requiere modificación de acuerdo a cada caso específico para dar una buena visión general y permitir una toma de decisiones informada, determinando el siguiente paso. En particular, para algunas proteínas, se observaron tanto la estabilización como la deseses estabilización del objetivo dependiendo de los fragmentos considerados. Ambos eventos son interesantes, ya que ambos pueden ser el resultado de la unión de fragmentos, y ambos pueden conducir a una buena molécula de seguimiento para manipular el comportamiento de la proteína.

Queda una última pregunta, a saber, "¿qué define un éxito útil?". De hecho, la respuesta depende de la situación específica. Por ejemplo, para Hec1, todos los fragmentos que estabilizan la proteína en más de 2 grados o la desestabilizan en más de 5 fueron comunicados a nuestros colaboradores de química, quienes diseñaron nuevas moléculas basadas en estos golpes. Para Nsp5, sin embargo, los golpes más desestabilizadores se comunicaron a nuestros colaboradores de RMN para confirmar los golpes derivados de nanoDSF con experimentos de RMN. En otras palabras, los resultados de cribado obtenidos de este protocolo deben analizarse con precaución y de manera dependiente del contexto, tomando decisiones informadas basadas en la pregunta específica y la metodología circundante. En cualquier caso, el método descrito aquí es un enfoque complementario a las metodologías existentes, como la detección basada en rayos X y RMN, que puede tener como objetivo confirmar, priorizar o dar nuevas ideas para las campañas de química.

Tabla suplementaria S1: Lista de tampones utilizados para el cribado de proteínas. Abreviaturas: HEPES = ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatanosulfónico; TDT = ditiothreitol; MOBS = ácido 4-(N-morfolino)butanosulfónico. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria S2: Propiedades de la placa MRC de 2 pomos para su uso con el robot nanodispensador. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria S3: Propiedades de la placa de fondo en V de 96 podos para su uso con el robot nanodispensador. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria S4: El tampón, la concentración de proteínas y Tm de las proteínas discutidas en resultados representativos. Abreviaturas: TDT = ditiothreitol; Hec1 = Proteína altamente expresada en cáncer 1; Mps1 = quinasa monopolar del huso 1; Nsp5 = proteasa similar al SARS-CoV-2 3C. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo suplementario 1: Parámetros generales-datos de ejemplo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: valores Tm y ΔTm para 406 fragmentos-datos de ejemplo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Disclosures

No hay revelaciones.

Acknowledgments

"Este trabajo se benefició del acceso a NKI Protein Facility, un centro Instruct-ERIC. El apoyo financiero ha sido proporcionado por iNEXT, proyecto número 653706, e iNEXT-Discovery, proyecto número 871037, financiado por el programa Horizonte 2020 de la Comisión Europea".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ClearVue Sheets Molecular Dimensions adhesive sealing film for protein plate
CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape CORNING adhesive sealing film for fragment plate
DSi poised library Enamine Fragment library containing 768 compounds used in this study
Elisa Reagent Reservior ThermoFisher Scientific 15075 Reagent reservior used for pipetting the protein
Greiner round (U) bottom plates Cat. No. 650201 Fragments supplied in these plates
Mosquito type X1 sptlabtech Part nr- 3019-0003 Nanolitre dispenser
MRC 2-well crystallization plate MRC96T-PS
Pierce ELISA Reagent Reservoirs Pierce
Prometheus High Sensitivity capillaries Catalog PR-C006
Prometheus NT.48 nanoDSF Nanotemper Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO) nanoDSF and light back scattering
Prometheus Standard capillary type Catalog PR-C002
TX-1000 Thermoscientific Centrifuge for plates

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References

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Bioquímica Número 171 Ensayo de desplazamiento térmico detección de fragmentos diseño de fármacos SARS-CoV-2 Nsp5 Hec1 Mps1
Fluorimetría de barrido nanodes diferencial para el cribado en el descubrimiento de plomo basado en fragmentos
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Ahmad, M. U. D., Fish, A., Molenaar, … More

Ahmad, M. U. D., Fish, A., Molenaar, J., Sreeramulu, S., Richter, C., Altincekic, N., Schwalbe, H., Wienk, H., Perrakis, A. Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery. J. Vis. Exp. (171), e62469, doi:10.3791/62469 (2021).

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