Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

İn vitro Simüle Edilmiş Gastrointestinal Sıvıların Çok Alt Fazlı Değişimi Yoluyla Emülsiyonların Tek Bir Damlacıkta Sindirimi

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64158
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Applied Physics, Faculty of Sciences, Campus de Fuentenueva, University of Granada, 2Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Campus de Cartuja, University of Granada, 3Department of Software Engineering, School of Computer and Telecommunication Engineering, Campus de Aynadamar, University of Granada

Summary

OCTOPUS olarak adlandırılan çok fazlı bir değişim ile uygulanan bir kolye damlası yüzey film dengesi, orijinal toplu çözeltinin simüle edilmiş gastrointestinal sıvılarla sıralı alt faz değişimi ile sindirim koşullarının taklit edilmesine izin verir. Simüle edilen in vitro sindirim, sindirilen ara yüz tabakasının ara yüz gerginliği in situ olarak kaydedilerek izlenir.

Abstract

Emülsiyonlar şu anda obezite, besin takviyesi, gıda alerjileri ve sindirim hastalıkları gibi farklı gastrointestinal durumlarla başa çıkmak için besinleri ve ilaçları kapsüllemek ve vermek için kullanılmaktadır. Bir emülsiyonun istenen işlevselliği sağlaması, yani gastrointestinal sistem içinde belirli bir bölgeye ulaşması, lipolizi inhibe etmesi / geciktirmesi veya sindirilebilirliği kolaylaştırması, sonuçta gastrointestinal sistemdeki enzimatik bozunmaya duyarlılığına bağlıdır. Sudaki yağ emülsiyonlarında, lipit damlacıkları, emülgatörlerin emülsiyonu stabilize ettiği ve kapsüllenmiş bileşiği koruduğu ara yüz katmanları ile çevrilidir. Emülsiyonların özel bir sindirilebilirliğinin elde edilmesi, başlangıçtaki bileşimlerine bağlıdır, ancak aynı zamanda gastrointestinal sindirimin farklı aşamalarına maruz kaldıklarından bu ara yüzey katmanlarının evriminin izlenmesini gerektirir. Çok alt fazlı bir değişim ile uygulanan bir kolye damlası yüzey film dengesi, özelleştirilmiş bir statik çürütme modeli uygulayarak emülsiyonların yağa batırılmış tek bir sulu damlacıkta in vitro sindiriminin simüle edilmesini sağlar. Gastrointestinal sistemden geçiş, orijinal damlacık yığın çözeltisinin yapay medya ile subfaz değişimi ile taklit edilir ve gastrointestinal sistemin her bölmesinin / adımının fizyolojik koşullarını taklit eder. Ara yüz gerginliğinin dinamik evrimi, tüm simüle edilmiş gastrointestinal sindirim boyunca in situ olarak kaydedilir. Sindirilmiş arayüzlerin interfasiyal dilatasyonel elastikiyet ve viskozite gibi mekanik özellikleri, her sindirim aşamasından sonra (oral, gastrik, ince bağırsak) ölçülür. Her sindirim ortamının bileşimi, gastrointestinal patolojiler ve bebek sindirim ortamı dahil olmak üzere sindirim koşullarının özelliklerini hesaba katacak şekilde ayarlanabilir. Proteoliz ve lipolizi etkileyen spesifik ara yüz mekanizmaları tanımlanır ve emülsiyonların ara yüz mühendisliği ile sindirimi modüle etmek için araçlar sağlar. Elde edilen sonuçlar, düşük alerjenite, kontrollü enerji alımı ve azaltılmış sindirilebilirlik gibi özel işlevlere sahip yeni gıda matrisleri tasarlamak için manipüle edilebilir.

Introduction

Emülsiyon sindirimini içeren yağın nasıl sindirildiğini anlamak, özelleştirilmiş işlevselliğe sahip ürünleri rasyonel olarak tasarlamak için önemlidir1. Yağ sindirimi için substrat bir emülsiyondur, çünkü yağ mekanik etki ile tüketim üzerine emülsifiye edilir ve ağız ve midede biyosürfaktanlarla karıştırılır. Ayrıca, insanlar tarafından tüketilen yağın çoğu zaten emülsifiye edilmiştir (süt ürünleri gibi) ve bebekler veya bazı yaşlı insanlar söz konusu olduğunda, bu tek tüketim şeklidir. Bu nedenle, spesifik sindirim profillerine sahip emülsiyon bazlı ürünlerin tasarımı beslenmede çok önemlidir1. Ayrıca, emülsiyonlar, obezite3, besin takviyesi, gıda alerjileri ve sindirim hastalıkları gibi farklı gastrointestinal durumlarla başa çıkmak için besinleri, ilaçları veya lipofilik biyoaktifleri2'yi kapsülleyebilir ve verebilir. Sudaki yağ emülsiyonlarında, lipit damlacıkları proteinler, yüzey aktif maddeler, polimerler, parçacıklar ve karışımlar gibi emülgatörlerin ara yüzey katmanları ile çevrilidir4. Emülgatörlerin rolü iki yönlüdür: emülsiyon5'i stabilize edin ve kapsüllenmiş bileşiği belirli bir bölgeye koruyun / taşıyın. Emülsiyonların özel bir sindirilebilirliğinin elde edilmesi, başlangıçtaki bileşimlerine bağlıdır, ancak aynı zamanda gastrointestinal sistemden geçiş sırasında bu arayüzün sürekli evriminin izlenmesini gerektirir (Şekil 1).

Figure 1
Şekil 1: Bazı ana gastrointestinal durumlarla başa çıkmak için emülsiyonların ara yüzey mühendisliğinin uygulanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Lipid sindirimi nihayetinde bir ara yüz işlemidir, çünkü lipazların (gastrik veya pankreas) emülsifiye lipit damlacıklarının yağ-su arayüzüne ara yüzey tabakasından adsorpsiyonunu gerektirir, böylece yağda bulunan trigliseritlere serbest yağ asitleri ve monoasilgüritler halinde hidrolize edilir6. Bu, Şekil 2'de şematize edilmiştir. Gastrik lipaz, yağ-su arayüzü için midedeki pepsin ve fosfolipitlerle rekabet eder (Şekil 2, gastrik sindirim). Daha sonra, pankreas lipaz / kolipaz, ince bağırsakta tripsin / kimotripsin, fosfolipitler, safra tuzları ve sindirim ürünleri ile rekabet eder. Proteases, lipaz adsorpsiyonunu önleyerek veya destekleyen ara yüz kaplamasını değiştirebilirken, safra tuzları oldukça yüzey aktiftir ve lipaz adsorpsiyonunu teşvik etmek için kalan emülgatörün çoğunun yerini alır (Şekil 2, bağırsak sindirimi). Sonunda, lipolizin hızı ve derecesi, kalınlık, moleküller arası / intramoleküler bağlantılar ve elektrostatik ve sterik etkileşimler gibi ilk / gastrik sindirilmiş emülsiyonun ara yüz özelliklerine bağlıdır. Buna göre, ara yüz tabakasının sindirilirken evrimini izlemek, lipaz adsorpsiyonunu ve dolayısıyla lipit sindirimini etkileyen ara yüz mekanizmalarını ve olaylarını tanımlamak için deneysel bir platform sunar.

Figure 2
Şekil 2: Gastrointestinal lipid sindiriminde arayüzlerin rolünü gösteren şematik diyagram. Pepsin hidrolizi, gastrik fazda ara yüz kompozisyonunu değiştirirken, gastrik lipaz trigliseritleri hidrolize eder. İnce bağırsakta, tripsin / kimotripsin ara yüz filmini daha da hidrolize ederken, lipoliz BS / lipazların adsorpsiyonu, trigliseritlerin hidrolizi ve lipolitik ürünlerin BS miseller / kompleksinde çözünürizasyon yoluyla desorpsiyonu ile ilerler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Granada Üniversitesi'ndeki (UGR) kolye düşürme ekipmanı, toplu çözelti7'nin alt faz değişimini sağlayan patentli bir teknoloji olan koaksiyel çift kılcal damar ile uygulanmaktadır. Kolye damlasını tutan kılcal damar, bir çift mikroenjektörün her bir kanalına bağımsız olarak bağlanan iki koaksiyel kılcal damarın düzenlenmesinden oluşur. Her mikroenjektör bağımsız olarak çalışabilir ve düşürülen içeriğin akış yoluyla değiştirilmesine izin verir7. Buna göre, alt faz değişimi, yeni çözeltinin iç kılcal damar ile eşzamanlı enjeksiyonundan ve aynı akış hızını kullanarak dökme çözeltinin dış kılcal damarla ekstraksiyonundan oluşur. Bu işlem, ara yüzey alanını veya damlacığın hacmini bozmadan dökme çözeltinin değiştirilmesine izin verir. Bu prosedür daha sonra damlacık yığın çözeltisi8'in sekiz adede kadar sıralı alt faz değişimine izin veren çok alt fazlı bir değiş tokuşa yükseltildi. Bu, sindirim sürecinin, lipidik ortamda asılı kalan tek bir sulu damlacıkta, toplu çözeltiyi farklı bölmeleri (ağız, mide, ince bağırsak) taklit eden yapay ortamlarla sırayla değiştirerek simülasyonunu sağlar. Tüm kurulum, bileşenlerin ayrıntıları da dahil olmak üzere Şekil 3'te temsil edilmektedir. Mikroenjektördeki şırıngalar, her biri Şekil 2'de açıklanan bileşenlerle yapay sindirim sıvısını içeren bir mikrosantrifüj tüpüne bağlanan sekiz vias valfine bağlanır.

Figure 3
Şekil 3: OCTOPUS'un tüm bileşenlerle genel görünümü. CCD kamera, mikroskop, mikro konumlandırıcı, termostabilize hücre ve çift kılcal damar, sekiz vias valfine bağlı iki şırınga ile bir çift mikroenjektöre bağımsız olarak bağlanmıştır. Her şırınga kılcal damar, numune ve bir deşarj ile dört mikrosantrifüj tüpü ile bağlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4A , yapay sindirim sıvılarının her birinin, çift kılcal damar yoluyla subfaz değişimi ile kolye damlasına nasıl enjekte edildiğini göstermektedir. Şekil 2'de detaylandırılan her sindirim bileşiği, gastrointestinal sistemden geçişi simüle ederek eşzamanlı / sıralı olarak uygulanabilir. Yapay sindirim sıvıları, Şekil 4B'de şematize edildiği gibi, ilk emülgatörün ara yüz gerginliğini değiştiren farklı enzimler ve biyosürfaktanlar içerir. Yine UGR'de geliştirilen DINATEN yazılımı (bakınız Malzeme Tablosu), ilk ara yüz tabakası in vitro olarak sindirilirken ara yüz geriliminin evrimini gerçek zamanlı olarak kaydeder. Ayrıca, her sindirim aşamasından sonra, ara yüz tabakasının dilatasyonel elastikiyeti, stabilize edilmiş ara yüz tabakasına hacim / ara yüzey alanının periyodik salınımları uygulanarak ve ara yüz gerginliğinin tepkisi kaydedilerek hesaplanır. Salınımın periyodu/frekansı ve genliği değişebilir ve CONTACTO yazılımı ile görüntü işleme dilatasyonel reolojik parametrelerisağlar 8.

Figure 4
Şekil 4: Sindirim profillerine örnekler . (A) İlk emülgatör tabakası, farklı çözeltilerin kolye damlasına sıralı alt faz değişimi ile mikrosantrifüje yerleştirilen yapay sindirim ortamına maruz bırakılır. (B) İlk emülgatörün ara yüzey geriliminin (y ekseni), yapay ortamdaki çeşitli enzimler / biyosürfaktanlar tarafından in vitro olarak sindirildiği için zamanın bir fonksiyonu (x ekseni) olarak genel evrimi. Düz bağırsak sıvısı ile son bir subfaz değişimi, karışık misellerde çözünür yoluyla sindirilmiş lipitin desorpsiyonunu ölçer. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışma, kolye damlası ekipmanı9 ile ara yüz katmanlarının in vitro sindirimini ölçmek için tasarlanmış genel protokolü sunmaktadır. İlk ara yüz tabakası, Şekil 2'de gösterildiği gibi, gastrointestinal sistemden geçişi taklit eden koşullara sırayla maruz kalmaktadır. Bu farklı sindirim ortamları, mikrosantrifüj tüplerinde bulunan farklı çözeltilerin subfaz değişimi ile kolye damlasına enjekte edilir (Şekil 4A). Bu ortamların bileşimi, değerlendirilecek gastrointestinal koşullara, yani gastrik / intestinal proteoliz / lipolize bağlı olarak özelleştirilebilir ve kümülatif etkilerin ve sinerjilerin ölçülmesine izin verir10. Her bölmedeki sindirim sürecini taklit etmek için kullanılan deneysel koşullar, INFOGEST tarafından yayınlanan ve pH'ı ve elektrolit ve enzim miktarlarını detaylandıran uluslararası konsensüs protokolünü takip eder11. Kolye damlasına dayanan deneysel cihaz, simüle edilmiş sindirim süreci boyunca ara yüz gerginliğinin yerinde kaydedilmesini sağlar. Ara yüz tabakasının dilatasyonel reolojisi, her sindirim adımının sonunda hesaplanır. Bu şekilde, her emülgatör, Şekil 4B'de gösterildiği gibi, sindirilmiş arayüzlerin özelliklerini gösteren bir sindirim profili sunar. Bu, sindirim sürecinin farklı aşamalarına duyarlılığı veya direnci ile ilgili sonuçların çıkarılmasına izin verir. Genel olarak, yapay sindirim ortamı, kendi sindirim sıvılarında (mide veya bağırsak) çözünen asit / bazik pH, elektrolitler, proteazlar (mide ve bağırsak), lipazlar (mide ve bağırsak), safra tuzları ve fosfolipitler içerir. Şekil 4B, bir emülgatörün ara yüz gerginliğinin evriminin genel bir profilini gösterir, ilk önce proteaz etkisine maruz kalır, ardından lipazlar gelir. Genel olarak, ara yüz tabakasının proteolizi, hidrolize peptitlerin desorpsiyonu nedeniyle ara yüz gerginliğinde bir artışı teşvik eder9,12, lipoliz ise safra tuzlarının ve lipazların adsorpsiyonu nedeniyle ara yüz gerginliğinde çok dik bir azalmaya neden olur 13. Bağırsak sıvısı ile son bir subfaz değişimi, adsorbe edilmemiş / sindirilmiş materyalin toplu çözeltisini tüketir ve çözünür bileşiklerin desorpsiyonunu ve sindirilmiş lipitlerin karışık misellerde çözünmesini teşvik eder. Bu, kaydedilen artmış ara yüz gerilimi ile ölçülür (Şekil 4B).

Özetle, in vitro sindirimi tek bir damlacıkta simüle etmek için kolye damlasında uygulanan deneysel tasarım, sindirim işlemi ilk ara yüzey katmanı10'a sırayla uygulandığı için kümülatif etkilerin ve sinerjilerin ölçülmesine izin verir. Her sindirim ortamının bileşimi, gastrointestinal patolojiler veya bebek sindirim ortamı14 dahil olmak üzere sindirim koşullarının özelliklerini hesaba katmak için kolayca ayarlanabilir. Daha sonra, proteoliz ve lipolizi etkileyen ara yüz mekanizmalarının tanımlanması, emülsiyonların ara yüz mühendisliği ile sindirimi modüle etmek için kullanılabilir. Elde edilen sonuçlar, düşük alerjenite, kontrollü enerji alımı ve azalmış sindirilebilirlik15,16,17,18,19 gibi özel işlevlere sahip yeni gıda matrislerinin tasarımında uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Yüzey bilimi deneylerinde kullanılan tüm cam eşyalar için temizleme sırası

  1. Cam eşyaları suda seyreltilmiş konsantre bir temizleme çözeltisiyle (bakınız Malzeme Tablosu) (%10) fırçalayın.
  2. Bir dizi musluk suyu, propanol, damıtılmış su ve ultra saf su ile iyice durulayın. Bir kabinde kurutun ve kullanana kadar kapalı bir dolapta saklayın.

2. Numune hazırlama

  1. INFOGEST standartlaştırılmış protokolleri 11,20'ye göre yapay sindirim ortamı hazırlayın (bkz. Ayrıntılar için Tablo 1'e bakın ve yüzey aktif kontaminasyonunu ve numunelerin seyreltilmesini önlemek için ara yüzey çalışmasının gerekliliklerine küçük uyarlamalar ekleyin (1:10)10.
  2. Emülgatör çözeltisini aşağıdaki adımları izleyerek hazırlayın.
    1. 0.01 L'lik konsantre bir çözelti hazırlayın (1 kg· L−1) emülgatör veya emülgatörlerin bir karışımı (bakınız Malzeme Tablosu) bir başlangıç tamponunda (Tablo 1) ve gece boyunca hafif ajitasyon altında tutun.
    2. 0,1 kg'a kadar seyreltin· Arayüzü doyurmak için L−1 (veya gerektiğinde); Daha önce yayınlanan rapor21'i takiben sabit bir ara yüz bölgesinde 1 saatlik adsorpsiyondan sonra ara yüz gerginliğinde sahte bir platoya ulaşmak.
    3. Kullanmadan önce 15 dakika boyunca hafif ajitasyon altında tutun.
  3. Yağ fazını saflaştırın.
    1. Bir bitkisel yağ karışımı hazırlayın (ayçiçeği, zeytin, triolein, vb.) ve magnezyum metasilikat reçineler (bakınız Malzeme Tablosu) büyük bir beherde 2:1 w/w oranında. En az 3 saat boyunca hafif mekanik ajitasyon altında tutun.
    2. Karışımı ticari bir santrifüjde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj edin (bkz.
    3. Yağ karışımını vakum altında bir şırınga filtresi (0,2 μm gözenek boyutu) ile filtreleyin (bkz. Kullanıma kadar azotla kapatılmış ve kabarcıklanmış temiz amber şişelerde saklayın.

3. Ahtapotun kalibrasyonu ve temizliği

  1. Hem şırıngaları hem de tüm vanaları bir kılcal damardan (valf 6/4) ve dış çıkıştan (valf 8-mavi renk) temizleme sırası ayarlayarak tüm boruları ultra saf suyla durulayın. Bunu sol iletişim kutusundaki temizle düğmesine basarak gerçekleştirin (Ek Şekil 1A).
  2. Bir su damlacığı oluşturarak ve 5 dakika boyunca gerçek zamanlı olarak ölçerek oda sıcaklığında suyun yüzey gerilimi7'yi kontrol edin (Ek Şekil 1B, C).
    1. Diferansiyel yoğunluğu hava-su (0,9982 kg·) olarak ayarlayın L−1) sol iletişim kutusunda, Ek Şekil 1B.
  3. Temiz küveti (optik cam) 0,002 L temiz bitkisel yağ ile doldurun ve termostatik hücredeki küvet tutucuya yerleştirin (Şekil 3).
  4. Termostati ayarlayın ve 37 ° C'de sıcaklık dengesine izin verin.
  5. Oda sıcaklığında su-yağın ara yüzey gerilimini kontrol edin7.
    1. Diferansiyel yoğunluğu bitkisel yağ-suya ayarlayın (zeytinyağı: 0.800 kg· L−1) (Ek Şekil 1C).
    2. 0,5 μL·s−1 oranında 40 μL enjekte edin ve enjeksiyonun sonuna kadar her saniye gerçek zamanlı olarak ölçün. Bu basit bir dinamik işlemdir (Ek Şekil 1B, D).
    3. Ara yüzey gerilimini bir veri sayfasında damlacık hacminin bir fonksiyonu olarak çizin.
    4. Damlacık hacmi aralığının, damlacık hacminden bağımsız olarak ara yüzey gerilimi için bir değer sağladığından emin olun. Ara yüz alanını damlacık hacminin bir fonksiyonu olarak çizin.
    5. Aşağıdaki adımları izleyerek iki adım (Ek Şekil 1B ve Ek Şekil 2A) içeren bir süreç programlayın.
      1. Bir iç şırınga ile, bu sabit ara yüz gerginliği aralığında bulunan bir hacim enjekte edin.
      2. Ara yüz alanını adım 3.5.4'te seçilen değerde sabit tutun ve ara yüz gerginliğini 5 dakika7 boyunca kaydedin.

4. Her sindirim adımı için DINATEN'de bir deneysel sürecin programlanması

NOT: İşlem parametreleri için bkz: Ek Şekil 1B.

  1. İlk denetimi gerçekleştirin.
    1. Damla oluşumu için, kılcal damara (valf 6) 10 μL (±5 μL) emülgatör çözeltisi enjekte edin (Ek Şekil 2A).
    2. Adsorpsiyonu 1 saat boyunca 20 mm2'lik (±10mm2)sabit bir ara yüz alanına kaydedin (Ek Şekil 2B).
    3. Dilatasyonel reoloji8'i kaydedin (Ek Şekil 2C).
      1. Salınım genliğini 1.25 μL, periyot 10 s'ye ayarlayın.
      2. Adsorpsiyonu seçilen ara yüz bölgesinde (adım 4.1.2) 10 saniye boyunca kaydedin.
      3. Adım 4.1.3'ü farklı dönemlerde yineleyin: 5 sn, 20 sn, 50 sn ve 100 sn.
  2. Gastrik sindirimi kaydedin.
    1. Adsorpsiyon21'i seçilen ara yüz bölgesinde 10 sn boyunca kaydedin.
    2. Subfaz değişimi7 , kapak 2'deki sıvı (sSGF) ve gastrik enzimler (Tablo 1) ile (Ek Şekil 2D).
      1. Sol şırıngayı valf 2'den doldurun. Sol şırınga 5 μL·s−1'de olacak şekilde valf 6-kılcal damarına 125 μL enjekte edin.
      2. Kılcal damardan 125 μL'yi sağ şırınga ile 5 μL·s−1'de ekstrakte edin. Valf 8'den çıkmak için doğru şırıngayı boşaltın. Tam değişimi sağlamak için 4.2.2.1-4.2.2.2 arasındaki adımları 10 kez yineleyin.
    3. Adsorpsiyon21'i , 4.1.2 adımında seçilen ara yüz bölgesinde 1 saat boyunca kaydedin (Ek Şekil 2B).
    4. Dilatasyonel reoloji8'i kaydedin (Ek Şekil 2C).
      1. Salınım genliğini 1.25 μL, periyot 10 s'ye ayarlayın.
      2. Seçilen ara yüz alanının adsorpsiyonunu adım 4.1.2'de 10 sn boyunca kaydedin. Farklı periyotlarda tekrarlayın: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
  3. Bağırsak sindirimini kaydedin.
    1. Adsorpsiyon21'i, 10 s için adım 4.1.2'de seçilen ara yüz alanına kaydedin (Ek Şekil 2B).
    2. Subfaz değişimi7 , kapak 3'teki sıvı (sSIF) ve bağırsak enzimleri/safra tuzları/fosfolipitler ile (Tablo 1) (Ek Şekil 2D).
      1. Sol şırıngayı valf 2'den doldurun. Sol şırınga 5 μL·s−1'de olacak şekilde valf 6-kılcal damarına 125 μL enjekte edin. Kılcal damardan 125 μL'yi sağ şırınga ile 5 μL·s−1'de ekstrakte edin.
      2. Valf 8'den çıkmak için doğru şırıngayı boşaltın. Değişimin tamamlanmasını sağlamak için 4.3.2.1-4.3.2.2 arasındaki adımları 10 kez yineleyin.
    3. Adsorpsiyon21'i 4.1.2 adımında seçilen ara yüz alanına 1 saat boyunca kaydedin.
    4. Dilatasyonel reoloji8'i kaydedin (Ek Şekil 2C).
      1. Salınım genliğini 1.25 μL, periyot 10 s'ye ayarlayın.
      2. Seçilen ara yüz alanındaki adsorpsiyonu adım 4.1.2'de 10 sn boyunca kaydedin.
      3. Farklı periyotlarda tekrarlayın: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
  4. Aşağıdaki adımları izleyerek desorpsiyonu kaydedin.
    1. Adsorpsiyon21'i, 10 s için adım 4.1.2'de seçilen ara yüz alanına kaydedin (Ek Şekil 2B).
    2. Subfaz değişimi7 , valf 5'te sıvı ile (sSIF) (Tablo 1, Ek Şekil 2D).
      1. Sol şırıngayı valf 5'ten doldurun. Sol şırınga 5 μL·s−1'de olacak şekilde valf 5-kılcal damarına 125 μL enjekte edin.
      2. Kılcal damardan 125 μL'yi sağ şırınga ile 5 μL·s−1'de ekstrakte edin. Valf 8'den çıkmak için doğru şırıngayı boşaltın. Değişimin tamamlanmasını sağlamak için 4.4.2.1-4.4.2.2 arasındaki adımları 10 kez yineleyin.
    3. Adsorpsiyon21'i , 4.1.2 adımında seçilen ara yüz bölgesinde 1 saat boyunca kaydedin (Ek Şekil 2B).
    4. Dilatasyonel reoloji8'i kaydedin (Ek Şekil 2C).
      1. 1.25 μL, periyot 10 s genliğini koruyun.
      2. Seçilen ara yüz alanındaki adsorpsiyonu adım 4.1.2'de 10 sn boyunca kaydedin.
      3. Adım 4.4.4'ü farklı periyotlarda tekrarlayın: 5 sn, 20 sn, 50 sn, 100 sn.

5. Denemeyi ayarlama

  1. Mikrosantrifüj tüplerini yapay sindirim ortamı ile doldurun ve her birini ilgili boru ile ilgili valfe bağlayın.
  2. Boruyu valf 2, valf 3, valf 4 ve valf 5'ten harici çıkışa (valf 8) temizleyerek valf 2-5'e doldurun (Ek Şekil 1A).
  3. Vana 1'den valf 6-kılcal damara 5 kez temizleyerek valf 1'deki boruyu doldurun.
  4. Kılcal damarı yağ fazına yerleştirin. Sol şırıngayı valf 1 ile yükleyin (ilk çözelti, Tablo 1).
  5. Adım 4.1-başlangıç, adım 4.2-gastrik, adım 4.3-bağırsaklar ve adım 4.4-desorpsiyonu sırayla işlemeye başlayın ve verileri her işlemin sonunda kaydedin.

6. Görüntü işleme yazılımı CONTACTO 8 ile dilatasyonel reolojik parametrelerin hesaplanması

NOT: Ayrıntılar için bkz: Maldonado-Valderrama et al.8.

  1. Alan salınımına karşılık gelen görüntüleri belirli bir frekansta ve genlikte yükleyin (Ek Şekil 3A).
  2. Reolojiye basın (Ek Şekil 3B) ve dilatasyon parametrelerini elde edin (Ek Şekil 3C).
  3. Sonuçları kopyalayıp veri yayılma sayfasına yapıştırın.

7. Deney sonuçlarının çizilmesi

  1. Önceki adımın zamanının son verilerini ekleyerek sindirim işleminin her adımındaki zaman sütununu yeniden hesaplayın.
  2. Kullanılan sindirim sürecinin her bir adımı için ara yüz gerginliğini ve katkı maddesi süresini çizin.
  3. Her adımın sonunda sindirim aşamasına karşı elde edilen son ara yüz gerginliği / dilatasyonel elastikiyeti ve viskoziteyi çizin: başlangıç, gastrik sindirim, duodenal sindirim ve desorpsiyon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu bölümde, AHTAPOT ile ölçülen sindirim profillerinin farklı örnekleri gösterilmektedir. Simüle edilmiş sindirim profili eşleşmelerinin genel görünümü Şekil 4B'de gösterilmiştir. Ara yüz gerginliği genellikle sindirim profilinde zamana karşı temsil edilir. Dikkate alınan farklı aşamalar / sindirim adımları farklı renklerle temsil edilir. İlk faz başlangıç tabakasını oluşturur ve her bir duruma bağlı olarak emülgatörün veya protein / yüzey aktif maddenin / polimerin adsorpsiyon fazına karşılık gelir. Daha sonra, farklı sindirim sıvıları, yeni ortamı içeren toplu bir çözeltiye subfaz değişimi ile enjekte edilir. Yeni alt faz, ilk emülgatör tabakasının ara yüz gerginliğinde ve her sindirim adımının sonunda ölçülen dilatasyonel reolojide değişiklikler üretir. Sindirim süreci en fazla sekiz sindirim adımından oluşabilir.

Figure 5
Şekil 5: Gastrik sindirim profilleri örneği . (A) İnsan serum albümininin gastrik proteolizi. Sindirim ortamı, deney bölümünde T = 37 ° C'de ayrıntılı olarak açıklanan çözeltilerle subfaz değişimi ile uygulanır. Mavi: protein içeren ilk tampon, kırmızı: pepsin ile sSGF. del Castillo-Santaella et al.12'nin izniyle yeniden basılmıştır. (B) Narenciye pektininin gastrik lipolizi. Sindirim ortamı, deney bölümünde T = 37 ° C'de ayrıntılı olarak açıklanan çözeltilerle subfaz değişimi ile uygulanır. Mavi: narenciye pektin ile başlangıç tamponu, sarı: gastrik lipaz ile sSGF, gri: sSGF. Infantes-Garcia et al.17'nin izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5 , emülgatörlerin gastrik sindirimi için elde edilen bazı deneysel sonuçları göstermektedir. Şekil 5A'da, insan serum albümini ( HSA)12 ilk önce zeytinyağı-su arayüzüne adsorbe edilir ve 1 saat sonra bir platoya ulaşmak için ara yüz gerginliğini azaltır. Bu fazın sonunda, reoloji 0.1 Hz (10 s) frekansta (periyot) ölçülür. İkinci adımda, pepsinli sSGF, subfaz değişimi ile eklenir. Bu, diğer şırınga ile aynı hacmi çıkarırken bir şırınga ile bir hacim kazandırmaktan ibarettir. Bu şekilde, damlanın alanı değişmez şekilde adsorbe edilen bileşenleri yağ-su arayüzünde tutar. Değişim 10-15 kez tekrarlanır. sSGF ve pepsin ile subfaz değişimi sırasında, ilk protein tabakasını seyrelten proteinin hidrolizi nedeniyle ara yüz gerilimi artar (Şekil 5A). Şekil 5B'de, narenciye pektin (CP)17 , 40 dakika boyunca trigliserit yağ suyuna adsorbe olur, ardından 0.1 Hz'de dilatasyonel reoloji gelir. İkinci adımda, gastrik lipaz ile sSGF, damlanın kütlesine enjekte edilir; Proteoliz tersine, lipoliz lipazın adsorpsiyonu ve arayüzde kalan yağ asitlerinin oluşumu ile sonuçlanır ve ara yüz gerginliğini azaltır. Desorpsiyon fazı, hidrofilik üretimi veya lipolizin lipofilik ürünlerinin çözünmesini değerlendiren üçüncü adımdır. Şekil 5B , sSGF ile subfaz değişiminin ara yüzey geriliminin boş bir tepkisini sağladığını göstermektedir. Bu, geri dönüşümsüz olarak adsorbe olan ve çözünmeyen, arayüzde demirli kalan lipofilik sindirim ürünlerinin üretimi olarak yorumlanabilir. Gastrik fazda safra tuzlarının yokluğu, çözünme eksikliğinden sorumludur. Lipolizin derecesi, ulaşılan ara yüz gerginliğinin değeri ile kalitatif olarak analiz edilebilir.

Figure 6
Şekil 6: Bağırsak sindirim profillerine örnek . (A) 37 °C'de sSIF'te safra tuzlarının (siyah kareler), lipazın (gri üçgenler) ve lipaz + safra tuzlarının (turuncu eşkenar dörtgenler) adsorpsiyon-desorpsiyon profilleri. Macierzanka et al.13'ün izniyle yeniden basılmıştır. (B) Safra tuzlarının + lipazın daha önce adsorbe edilmiş F68 (koyu yeşil) ve F127 (açık yeşil) üzerine adsorpsiyonu, safra tuzlarının (sarı) sSIF'te adsorpsiyonu. Desorpsiyon: safra tuzları (turuncu), F68 (koyu mor) ve F127 (açık mor) üzerinde sSIF ile subfaz değişimi. Torcello-Gómez et al.19'un izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6, emülgatörlerin bağırsak sindirimi için elde edilen deneysel sonuçları göstermektedir. Gastrik sindirimin aksine, ince bağırsakta safra tuzlarının varlığı, sSIF ile subfaz değişimi ve toplu çözeltinin tükenmesi üzerine farklı desorpsiyon profilleri sunar. Şekil 6A, saf safra tuzları, saf lipaz ve karışık lipaz / safra tuzları 8,9,10,13 için elde edilen desorpsiyon profillerini göstermektedir. Safra tuzları, yağ-su arayüzüne geri dönüşümlü olarak adsorbe edilir ve bu nedenle, çıplak yağ-su arayüzünün 8,13 değerine ulaşmak için ara yüzey gerilimindeki artışla gösterildiği gibi, sSIF ile subfaz değişimi üzerine tamamen emilirler. Tersine, lipaz, sSIF tarafından subfaz değişiminden sonra ara yüz gerginliğinin sabit değeri ile verildiği gibi, geri dönüşümsüz olarak adsorbe olur. Lipaz ve safra tuzları karışımı, sSIF tarafından bir ara değere subfaz değişimi üzerine ara yüzey geriliminde sınırlı bir artışla ölçülen bir ara desorpsiyon profili sağlar. Kalan ara yüz tabakası lipaz ve serbest yağ asitleri içerir. Safra tuzları muhtemelen arayüzden emildi ve lipolizde oluşan serbest yağ asitlerinin bir kısmını çözündürdü. Şekil 6B, Pluronik'in iki varyantının lipolizi üzerine ara yüz gerginliğinin evrimini göstermektedir: F127 ve F6819. Şekil 6B, lipaz ve safra tuzlarının adsorpsiyonu ve serbest yağ asitlerinin yağ-su arayüzünde daha önce oluşturulmuş F68 ve F127 ara yüz filmlerine üretilmesi nedeniyle ara yüz gerginliğinde dik bir azalma olduğunu göstermektedir. Desorpsiyon adımı, lipolitik ürünlerin çözünmesini ölçen sSIF ile subfaz değişiminin neden olduğu artan ara yüzey gerilimini gösterir.

Figure 7
Şekil 7: Tam dinamik gastrointestinal sindirim profilleri örneği . (A) Hava-su arayüzünde AS-48 adsorbe edilmiş filmin in vitro sindirim profili . Sindirim ortamı, deney bölümünde T = 37 ° C'de ayrıntılı olarak açıklanan çözeltilerle subfaz değişimi ile uygulanır. Kontrol: AS-48 ile başlangıç tamponu, pepsin: pepsin ile sSGF, tripsin: tripsin + kimotripsin ile sSIF, desorpsiyon: sSIF. del Castillo-Santaella et al.18'in izniyle yeniden basılmıştır. (B) Zeytinyağı-su arayüzünde insan ve sığır serum albümini adsorbe edilmiş filmlerin in vitro sindirim profili. Sindirim ortamı, deney bölümünde T = 37 ° C'de ayrıntılı olarak açıklanan çözeltilerle subfaz değişimi ile uygulanır. Kontrol: HSA / BSA ile başlangıç tamponu, pepsin: pepsin ile sSGF, tripsin: tripsin + kimotripsin ile sSIF, lipoliz: lipaz ve safra tuzları ile sSIF, desorpsiyon: sSIF. Çizilen eğriler,% <5 sapmaları olan temsili deneylerdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7 , tam simüle edilmiş sindirim profillerinin örneklerini göstermektedir. Şekil 7A , hava-su arayüzünde adsorbe edilen gıda biyo-koruyucu AS-48'in sindirim profilini göstermektedir18. Sindirim süreci, bu peptidin proteoliline odaklanmak için tasarlanırken, yağın lipolizine ihtiyaç duyulmazken, hava-su arayüzünde olmak. Bu nedenle, Şekil 7A'daki simüle edilmiş sindirim beş adımdan oluşur: kontrol / başlangıç filmi, pepsinoliz, tripsinoliz ve desorpsiyon. Deneysel sonuçlar, bu bakteriyosinin yüzey gerilimi değişmeden kaldığı için hem pepsin hem de tripsin hidrolizine dirençli olduğunu göstermiştir. Buna göre, AS-48, in vitro sindirime dirençli iyi bir gıda biyo-koruyucu olarak kabul edildi. Şekil 7B, yağ-su arayüzünde adsorbe edilen insan ve sığır serum albüminlerinin adsorbe edilmiş katmanlarının in vitro sindirim profillerini karşılaştırmaktadır22. Bu simülasyon, bu iki protein23 tarafından stabilize edilen emülsiyonların sindirilebilirliğini taklit etmek ve kurkumin4'ün kapsüllenmesini değerlendirmek için tasarlanmıştır. Bu nedenle, simüle edilmiş sindirim beş adımdan oluşan özelleştirildi: kontrol / başlangıç, pepsinoliz, tripsinoliz, lipoliz ve desorpsiyon. Deneysel sonuçlar, pepsin sindiriminden sonra artmış ara yüz gerginliği gösterdi ve pepsinolize duyarlılığın arttığını gösterdi. Bu, sığır varyantının adsorpsiyon üzerine artan açılımına ve pepsine duyarlı bölgeleri açığa çıkarmasına bağlandı. Daha sonra tripsinoliz ve lipoliz tamamen benzer sindirim profilleri sağlamıştır (Şekil 7B).

Figure 8
Şekil 8: Gastrointestinal sindirimin nihai değerlerine örnek. (A) Ara yüz gerginliği, (B) dilatasyonel elastikiyet, (C) zeytinyağı-su arayüzünde β-laktoglobulin adsorbe edilmiş filmin in vitro sindiriminin dilatasyonel viskozitesi. Dilatasyon parametreleri, sindirilen arayüz her adımda dengelendikten sonra 1 Hz, 0.1 Hz ve 0.01 Hz'de ölçüldü. Sindirim ortamı, deney bölümünde T = 37 ° C'de ayrıntılı olarak açıklanan çözeltilerle subfaz değişimi ile uygulanır. Kontrol: protein ile başlangıç tamponu, pepsin: pepsin ile sSGF, tripsin: tripsin + kimotripsin ile sSIF, lipoliz: lipaz ve safra tuzları ile sSIF, desorpsiyon: sSIF. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Genel olarak, farklı sindirilmiş ara yüz katmanlarının doğasını değerlendirmek ve karşılaştırmak için, nihai ara yüz gerginliği ve sindirilmiş arayüzler için elde edilen dilatasyonel elastikiyet/viskozite, tasarlanan sindirim sürecinde göz önünde bulundurulan adımların her biri için çizilir. Şekil 8, 1 Hz, 0.1 Hz ve 0.01 Hz frekanslarında ölçülen ara yüzey gerilimini (Şekil 8A), dilatasyonel elastikiyeti (Şekil 8B) ve dilatasyonel viskoziteyi (Şekil 8C) göstermektedir. Çizilen değerler, yağ-su arayüzünde adsorbe edilen β-laktoglobulinin her sindirim adımından sonra elde edildi16. Şekil 8A, proteolizin (pepsin ve tripsin) ara yüz gerginliğinde küçük artışlar sağladığını, lipolizin ise bu değeri azalttığını ve desorpsiyonun tekrar arttığını göstermektedir. Dilatasyonel elastikiyetle ilgili olarak, protein yağ-su arayüzünde elastik ve birbirine bağlı filmler oluşturur. Safra tuzlarının varlığı, düşük elastikiyete sahip oldukça hareketli ve akışkan ara yüzey filmleri üretir. Son olarak, kalan lipolitik ürünler desorpsiyondan sonra yapışkan bir elastik film geliştiremez. Dilatasyonel elastikiyet, salınım frekansı ile biraz artar (Şekil 8B). Son olarak, Şekil 8C'de gösterilen ara yüz filmlerinin dilatasyonel viskozitesi yalnızca daha düşük frekansta tespit edilebilir ve arayüzde çok katmanlı, agregalar veya diğer dağıtıcı yapıların varlığını tespit eder. β-laktoglobulinin sindirim profilinin nabızla muamele edilen β-laktoglobulin için elde edilen sindirim profili ile karşılaştırılması, bu tür fiziksel tedaviye tabi tutulan proteinlerin sindirilebilirliğinin arttığını göstermiştir16.

Başlangıç Arabelleği 0,00113 mol L-1 NaH2PO4, pH 7,0
Basitleştirilmiş Simüle Mide Sıvısı (sSGF) [NaH2PO4] = 0,00113 mol L-1, [NaCl] = 0,15 mol L-1, pH 3,0
Basitleştirilmiş Simüle Bağırsak Sıvısı (sSIF) [NaH 2 PO4] =0,00113 mol L-1, [NaCl] = 0,15 mol L-1, [CaCl2] = 0,003 mol L-1, pH 7,0
Gastrik Enzimler pepsin (50 ∙ 10 3 U L-1), gastrik lipaz (0.5 ∙ 103 U L-1)
Bağırsak enzimleri tripsin (2.5 ∙ 10 3 U L-1), kimotripsin (0.625 ∙ 10 3 U L-1), pankreas lipaz (50∙ 10 3 U L-1), ko-lipaz (150 ∙ 10 3 U L-1)
Safra tuzları karışımı 0.01 mol L-1 M. Safra tuzları karışımı: Sodyum Taurocholate ve Sodyum Deoksikolat (50/50) veya Sodyum Taurocholate ve sodyum Glycodeoxycholate (50/50)

Tablo 1: Yapay sindirim ortamının bileşimi.

Ek Şekil 1: DINATEN bilgisayar arayüzünün temel işlemleri. (A) DINATEN bilgisayar arayüzünün genel görünümü; soldaki iletişim kutusu tüm vanalara bağlı iki şırıngayı gösterir ve enjeksiyon/ekstraksiyon ve temizliği kontrol eder. Merkezi iletişim kutusu komutu, bırakma görüntüsünü ve sonuçları içeren tabloyu içerir. (B) Gerçek zamanlı hesaplama, zamanın bir fonksiyonu olarak otomatik ölçüm sağlar. (C) Diferansiyel yoğunluğu dahil etmek için sol komut. (D) Basit bir dinamik işlem, enjeksiyon/ekstraksiyon hacmini, hızını ve yakalama sürelerini kontrol eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Her sindirim adımını (süreci) programlamak için arayüz. (A) Sabit hacimli ve sabit enjeksiyon hızına sahip sol şırınga ile damla oluşumu. (B) Sabit ara yüz bölgesinde adsorpsiyon: kontrol. (C) Sabit genlik, periyot ve döngü sayısına sahip reoloji. (D) Alt faz değişimi: Her iki şırıngayı aynı oranda enjekte edin ve çıkarın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Görüntü analizi CONTACTO yazılımı ile dilatasyon parametrelerinin hesaplanması. (A) Sabit bir periyotta salınıma karşılık gelen görüntülerin analizi. (B) Seçilen görüntülerin ara yüz tabakasının dilatasyon parametrelerinin hesaplanması. (C) Dilatasyonel analizden elde edilen sonuçları gösteren iletişim kutusu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makalede, kolye damlası ekipmanı kullanarak ara yüz katmanlarının in vitro sindirimini ölçmek için genelleştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Protokol, literatürle karşılaştırmayı kolaylaştırmak için INFOGEST11,20 uyumlaştırılmış protokolüne dayanan sindirim tamponlarının bileşimini ayarlayarak deneyin özel gereksinimlerine göre ayarlanabilir. Sindirim enzimleri ve biyosürfaktan maddeler ayrı ayrı, sırayla veya birlikte eklenebilir. Bu ikinci seçeneğin dikkatle yapılması gerekir, çünkü ara yüz tabakasının doygunluğu, sadece çok düşük bir ara yüzey gerginliği sağlayarak farklı fenomenleri engelleyecek ve damlacığın düşmesine neden olabilir. Her sindirim bileşeninin etkisini analiz edebilmek için, farklı sindirim enzimleri sırayla ve farklı konsantrasyonlarda eklenir. Bu sayede her bir bileşenin etkileri analiz edilip sistematize edilebilmekte, sinerjiler sıralı toplama ile değerlendirilmektedir. Ayrıca, damlacıkların düşmesini önlemek için, bazı konsantrasyonlarseyreltilir 9. Elde edilen sonuçlar, koşullar basitleştirilmiş bir sistemi hesaba katacak şekilde ayarlandığından, emülsifiye sistemlere doğrudan tahmin edilemez. Bununla birlikte, ara yüz gerginliğinin evrimi, ara yüz tabakası sindirildikçe ara yüz kaplamasının evrimini gösterir10. Benzer şekilde, dilatasyonel reolojinin evrimi, sindirim ilerledikçe arayüzün mekanik özellikleri hakkında bazı bilgiler sağlar9. Bu sonuçlar, emülsifiye sistemlere uygulanmak üzere uyarlanabilen ve dikkatlice yorumlanabilen yararlı bilgiler içerir.

Kolye damlası ekipmanı, Şekil 2'de gösterildiği gibi, özellikle ara yüz tabakasında meydana gelen in situ olayların değerlendirilmesine izin verir. İlk olarak, tek bir emülsiyon damlacığını temsil eden bir başlangıç ara yüz tabakası oluşturulur. Bu ilk katman farklı sindirim koşullarına maruz kalır ve sulu fazdaki farklı bileşenlerin varlığı nedeniyle bileşimini sırayla değiştirir. Ayrıca, lipazlar yağ fazına erişmek ve yağı hidrolize etmek için bu ara yüz tabakasının üstesinden gelmelidir. Bu ara yüz olayları, başlangıçta oluşturulan aynı ara yüz katmanında değerlendirilmelidir. Bir emülsiyonun in vitro sindirime tabi tutulması, farklı zamanlarda örneklemeye ve sindirilirken emülsiyondaki değişikliklerin değerlendirilmesine (damlacık boyutu, zeta potansiyeli) izin verecektir, ancak her bir emülsiyon damlacığını çevreleyen ara yüz tabakasının yerinde değerlendirilmesine izin vermeyecektir. Bu nedenle, çok alt fazlı değişim ile uygulanan kolye damlası ekipmanı, emülsiyonların ara yüzey mühendisliğine odaklanmak için tamamlayıcı bir teknik içerir14.

Bu metodolojinin ilk sınırlaması, damlacığın düşmesini önlemek için seyreltilmesi gereken çeşitli ürünlerle ara yüz tabakasının doygunluğu ile tam olarak ilgilidir. Bir başka deneysel konu, kabarcıkların çekirdeklenmesini önlemek için tüm yapay ortamların gazdan arındırılmasıdır ve bu da kılcal damardan damlacık kopmasına neden olabilir. Emülsifiye sistemlere ekstrapolasyon yaparken emülsiyon sistemlerine kıyasla daha büyük yağ-su oranını dikkate almak da önemlidir. Son olarak, dilatasyonel reoloji, sindirim enzimleri tarafından oluşturulan ve bozulan ara yüz tabakası içindeki moleküller arası ve moleküller arası ilişkiler hakkında bilgi içermesine rağmen, emülsiyon stabilitesini yorumlamak ve tahmin etmek zordur. Toplamda, çok alt fazlı bir değişim cihazı ile uygulanan kolye damlası, damlacık boyutu dağılımının evrimini ve elektroforez22 ile protein sindiriminin zeta potansiyelini takip eden emülsiyonlar12'nin in vitro sindirim çalışmalarını tamamlamak için yararlı bir ekipman parçasıdır. Sindirim sisteminin cinsiyet değişikliğini, bebek sindirimini veya sindirim sorunlarını hesaba katacak şekilde değiştirilmesi, deneysel prosedürün gelecekteki uygulamalarını içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkileyebilecek bilinen hiçbir rakip finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu araştırma, MCIN/AEI/10.13039/501100011033 tarafından finanse edilen RTI2018-101309-B-C21 ve PID2020-631-116615RAI00 projeleri ve "ERDF Avrupa'yı Yapmanın Bir Yolu" tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışma (kısmen) Granada Üniversitesi (İspanya) Biyokolloid ve Akışkanlar Fiziği Grubu (ref. PAI-FQM115) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich C4129 Enzyme
Beta-lactoglobulin Sigma-Aldrich L0130 Emulsfier
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Emulsfier
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Electrolyte
Centrifuge Kronton instruments Centrikon T-124 For separating oil and resins
Citrus pectin Sigma-Aldrich P9135 Emulsfier
co-lipase FROM PORCINE PANCREAS Sigma C3028 Enzyme
CONTACTO University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
DINATEN University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
Gastric lipase Lipolytech RGE15-1G Enzyme
Human Serum Albumin Sigma-Aldrich 70024-90-7 Emulsifier
INFOGEST http://www.proteomics.ch/IVD/
Lipase from porcine pancreas, type II Sigma-Aldrich L33126 Enzyme
Magnesium metasilicate resins Fluka 1343-88-0 Resins to purify oil
Micro 90 International products M-9051-04 Cleaner
NaCl Sigma 7647-14-5 Electrolyte
NaH2PO4 Scharlau 10049-21-5 To prepare buffer
OCTOPUS Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange
Olive oil Sigma-Aldrich 1514 oil
Pancreatic from porcine pancreas Sigma P7545-25 g Enzyme
Pepsin Sigma-Aldrich P6887 Enzyme
Pluronic F127 Sigma P2443 Emulsifier
Pluronic F68 Sigma P1300 Emulsfier
Sodium deoxycholate Sigma Bile salts
Sodium glycodeoxycholate Sigma C9910 Bile salts
Sodium taurocholate Sigma 86339 Bile salts
Syringe Filter Millex-DP SLGP033R  Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone
Trypsin Sigma-Aldrich T1426 Enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McClements, D. J. The biophysics of digestion: Lipids. Current Opinion in Food Science. 21, 1-6 (2018).
  2. McClements, D. J., Li, Y. Structured emulsion-based delivery systems: Controlling the digestion and release of lipophilic food components. Advances in Colloid and Interface Science. 159 (2), 213-228 (2010).
  3. Corstens, M. N., et al. Food-grade micro-encapsulation systems that may induce satiety via delayed lipolysis: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2218-2244 (2017).
  4. Aguilera-Garrido, A., del Castillo-Santaella, T., Galisteo-González, F., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Investigating the role of hyaluronic acid in improving curcumin bioaccessibility from nanoemulsions. Food Chemistry. 351, 129301 (2021).
  5. Rodríguez Patino, J. M., Carrera Sánchez, C., Rodríguez Niño, M. R. Implications of interfacial characteristics of food foaming agents in foam formulations. Advances in Colloid and Interface Science. 140 (2), 95-113 (2008).
  6. Wilde, P. J., Chu, B. S. Interfacial & colloidal aspects of lipid digestion. Advances in Colloid and Interface Science. 165 (1), 14-22 (2011).
  7. Cabrerizo-Vílchez, M. A., Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Neumann, A. W. Axisymmetric drop shape analysis as penetration Langmuir balance. Review of Scientific Instruments. 70 (5), 2438-2444 (1999).
  8. Maldonado-Valderrama, J., Muros-Cobos, J. L., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Bile salts at the air-water interface: Adsorption and desorption. Colloids and surfaces B: Biointerfaces. 120, 176-183 (2014).
  9. Maldonado-Valderrama, J., Terriza, J. A. H., Torcello-Gómez, A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. In vitro digestion of interfacial protein structures. Soft Matter. 9, 1043-1053 (2013).
  10. Maldonado-Valderrama, J. Probing in vitro digestion at oil-water interfaces. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 39, 51-60 (2019).
  11. Brodkorb, A., et al. INFOGEST static in vitro simulation of gastrointestinal food digestion. Nature Protocols. 14 (4), 991-1014 (2019).
  12. del Castillo-Santaella, T., Maldonado-Valderrama, J., Molina-Bolivar, J. A., Galisteo-Gonzalez, F. Effect of cross-linker glutaraldehyde on gastric digestion of emulsified albumin. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 145, 899-905 (2016).
  13. Macierzanka, A., Torcello-Gómez, A., Jungnickel, C., Maldonado-Valderrama, J. Bile salts in digestion and transport of lipids. Advances in Colloid and Interface Science. 274, 102045 (2019).
  14. Maldonado-Valderrama, J., Torcello-Gómez, A., del Castillo-Santaella, T., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Subphase exchange experiments with the pendant drop technique. Advances in Colloid and Interface Science. 222, 488-501 (2015).
  15. Bellesi, F. A., Ruiz-Henestrosa, V. M. P., Maldonado-Valderrama, J., Del Castillo Santaella, T., Pilosof, A. M. R. Comparative interfacial in vitro digestion of protein and polysaccharide oil/water films. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 161, 547-554 (2018).
  16. Del Castillo-Santaella, T., Sanmartín, E., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Arboleya, J. C., Maldonado-Valderrama, J. Improved digestibility of β-lactoglobulin by pulsed light processing: A dilatational and shear study. Soft Matter. 10 (48), 9702-9714 (2014).
  17. Infantes-Garcia, M. R., et al. In vitro gastric lipid digestion of emulsions with mixed emulsifiers: Correlation between lipolysis kinetics and interfacial characteristics. Food Hydrocolloids. 128, 107576 (2022).
  18. del Castillo-Santaella, T., Cebrián, R., Maqueda, M., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Assessing in vitro digestibility of food biopreservative AS-48. Food Chemistry. 246, 249-257 (2018).
  19. Torcello-Gómez, A., Maldonado-Valderrama, J., Jódar-Reyes, A. B., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Martín-Rodríguez, A. Pluronic-covered oil-water interfaces under simulated duodenal conditions. Food Hydrocolloids. 34, 54-61 (2014).
  20. Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5 (6), 1113-1124 (2014).
  21. Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Development of a constant surface pressure penetration langmuir balance based on axisymmetric drop shape analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 249 (2), 263-273 (2002).
  22. del Castillo-Santaella, T., et al. Hyaluronic acid and human/bovine serum albumin shelled nanocapsules: Interaction with mucins and in vitro digestibility of interfacial films. Food Chemistry. 383, 132330 (2022).
  23. Aguilera-Garrido, A., et al. Applications of serum albumins in delivery systems: Differences in interfacial behaviour and interacting abilities with polysaccharides. Advances in Colloid and Interface Science. 290 (5), 102365 (2021).

Tags

Biyokimya Sayı 189
<em>İn vitro</em> Simüle Edilmiş Gastrointestinal Sıvıların Çok Alt Fazlı Değişimi <em>Yoluyla</em> Emülsiyonların Tek Bir Damlacıkta Sindirimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maldonado-Valderrama, J., del… More

Maldonado-Valderrama, J., del Castillo Santaella, T., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. Á. In vitro Digestion of Emulsions in a Single Droplet via Multi Subphase Exchange of Simulated Gastrointestinal Fluids. J. Vis. Exp. (189), e64158, doi:10.3791/64158 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter