Un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano

Resumen

Hasta hace poco, los estudios de expresión en el cerebro humano se limita a la cuantificación de ARN o de proteína. Con las técnicas de inmunoprecipitación de cromatina se describe en este artículo, será posible asignar metilación de las histonas y otros reguladores epigenética de la expresión génica en el cerebro postmortem.

Resumen

Enfermedades neuropsiquiátricas crónicas como la esquizofrenia, enfermedad bipolar y el autismo se cree que el resultado de una combinación de factores genéticos y ambientales que podrían resultar en alteraciones epigenéticas de la expresión génica y otras patología molecular. Tradicionalmente, sin embargo, los estudios de expresión en el cerebro post mortem se limitaron a la cuantificación de ARNm o proteína. Las limitaciones encontradas en la investigación postmortem del cerebro tales como variabilidad en el tiempo y la autolisis integridades tejido también es probable que el impacto de los estudios de estructuras de orden superior de la cromatina. Sin embargo, la organización nucleosomal de ADN genómico como el ADN: núcleo de unión de histonas - parece ser preservado en gran medida en muestras representativas de los bancos diferentes del cerebro. Por lo tanto, es posible estudiar el patrón de metilación y otras modificaciones covalentes de las histonas en definir loci del genoma en el cerebro postmortem. A continuación, presentamos una versión simplificada nativos inmunoprecipitación de cromatina (NChIP) protocolo para muestras de cerebro congelado (no fijos) humanos. A partir de la digestión nucleasa micrococcal de homogeneizados de cerebro, NChIP seguido por qPCR se puede completar en tres días. La metodología que aquí se presenta debe ser útil para dilucidar los mecanismos epigenéticos de la expresión génica en el cerebro humano normal y enfermo.

Protocolo

Procedimiento:

1 ^ª Jornada

1. Homogeneizar 50-500 mg de tejido congelado cuestión post-mortem gris con Douncing Buffer.

! PRECAUCIÓN - tejidos humanos deben ser manipulados con cuidado bajo condiciones de estricta seguridad. Se debe manipular a las normas de seguridad BSL-2 o superior.

1. Tener previamente disecado, post-mortem de cerebros de los -80 ° C, los Dounce en el volumen cerebral de Buffer 5X Douncing, y el lugar en el tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Combinado de la muestra y el control de los pares se procesan simultáneamente.

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Discusión

El protocolo descrito aquí es particularmente útil para los investigadores interesados ​​en las firmas de metilación de las histonas y / o ADN del cerebro humano, ya que estas marcas de la cromatina puede ser menos propensa a los artefactos post-mortem, en comparación con otros tipos de modificaciones, incluyendo (histonas) acetilación y fosforilación ^{1, 2.} El cerebro postmortem se presta al estudio de la mono-nucleosomal los preparativos, el ADN permanece en gran parte unido a las histonas centrales, al menos en las muestras con.......

Materiales

Soluciones:

• Buffer nChIP Douncing: 10 mM Tris, 4 _mM de MgCl2, 1 mM _de CaCl2 ajustar el pH a 7.5
• 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl ajustar el pH a 7.5
• Sal de amortiguación de lavado a baja: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
• Buffer de lavado a alta sal: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl
• Cloruro de litio Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% de ácido desoxicólico, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl
• Tampón TE: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
• Tampón de Elución: 0,1 M NaHCO _3, 1% SDS
• Proteinasa K tampón de digestión (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, SDS 2%, NaCl 2M ajustar el pH a 8.0
• 3 M de acetato de sodio: 24,61 g de acetato de sodio anhidro (MW = 82.03) en 100 ml de agua destilada en autoclave. Ajustar el pH a 5.2 con ácido acético concentrado.