En snabb teknik för visualisering av Live Immobiliserade jästceller

Summary

En snabb teknik för visualisering av växande immobiliserade jästceller, här gäller för fluorescerande reportrar på den tysta parning lokus HML och HMR

Abstract

Vi presenterar här en enkel, snabb och extremt flexibel teknik för immobilisering och visualisering av växande jästceller av epifluorescence mikroskopi. Tekniken passar lika bra för visualisering av statisk jäst populationer eller tidsförlopp experiment upp till tio timmar långa. Min mikroskopi undersöker epigenetiska arv vid den tysta parning loci i S. cerevisiae. Det finns två tysta parning loci, HML och HMR, som normalt inte uttrycks som de är förpackade i heterochromatin. I sir1 muterade bakgrunden ljuddämpning är försvagad så att varje lokus antingen kan vara i uttrycks eller tystade epigenetiska tillstånd, så i befolkningen som helhet finns en blandning av celler av olika epigenetiska stater för både HML och HMR. Min mikroskopi visade att det inte finns något samband mellan den epigenetiska tillstånd HML och HMR i en enskild cell. sir1 celler växla stokastiskt epigenetiska tillstånd, inrättande tysta vid ett tidigare uttryckt locus eller uttrycker en tidigare tystade lokus. Min tid naturligtvis mikroskopi spåras enskilda sir1 celler och deras avkomma att göra poäng frekvensen i varje av de fyra möjliga epigenetiska strömbrytare, och därmed stabiliteten i varje epigenetiska stater i sir1 celler. Se även Xu et al. Mol. Cell 2006.

Protocol

1. Immobiliserade celler för tidsförloppet epifluorescence mikroskopi. Observera att detta protokoll är bara användbar om syftet linserna på din mikroskop är under mikroskop scenen.
   
   
2. Placera celler vid önskad koncentration i flytande medier på en lång täckglas (ungefär 24x50mm)
   
   
3. Skär en agar-block av önskad storlek från ett syntetiskt media platta (dessa har lägre autofluorescens) och placera över cellerna. Placera sidan av agar blockerar inte hanteras av pincett i kontakt med cellerna.
   
   
4. För kortare kurser (upp till 3 timmar), är detta inrättas tillräckligt. Om celler går när visualiseras på mikroskop, minska volymen av celler eller öka område på agar blocket.
   
   
5. För längre tidsförlopp, placera en droppe av färska flytande medier på toppen av agar blocket, och placera en glasskiva ovanpå agar blocket. Denna bild minskar avdunstningen genom toppen av agar blocket. Om så önskas kan kanterna på agar blocket i kontakt med täckglas förseglas med vaselin för att ytterligare minska fukt. Jag har använt detta inrättat för filmer upp till 9 timmar lång, med cellerna att dela på vild typ priser.

Discussion

Detta är en snabb teknik som immobilizes jästceller samtidigt tillåta tillväxt. Vi har följt jäst tillväxt för upp till tio timmar, med jästen som visar vilda priser typ divisionen under hela försöksperioden. Observera att denna inställning kräver att objektivet ligga under mikroskop scenen.