Name: confocal microscopy for protein localization
Uploaded: 2023-04-30T07:08:35.000Z
Duration: 13 min 13 s
Channel: JoVE

1. Malzemeler
Buffers
<ol>
	<li>Yıkama tamponu: 1 X kalsiyum veya magnezyum içermeyen steril fosfat tamponlu salin (PBS)</li>
	<li>Fiksasyon tamponu: PBS'de %1 paraformaldehit</li>
	<li>Geçirgenlik tamponu: PBS'de% 0.1 Triton X-100</li>
	<li>Bloke edici tampon: PBS'de% 1 sığır serum albümini</li>
	<li>Hücre büyüme ortamı:% 10 fetal sığır serumu (FBS), penisilin / streptomisin ve L-glutamin ile desteklenmiş DMEM</li>
</ol>
Ekipman
<ol başlat="6">
	<li>Laminer akış başlığı</li>
	<li>Nemlendirilmiş inkübatör (37°C, %5 CO2)</li>
	<li>Konfokal lazer tarama mikroskobu; burada, Nikon Eclipse Ti lazer</li>
</ol>
Malzemeler ve Reaktifler
<ol başlat="9">
	<li>Odacıklı hücre kültürü slaytları</li>
	<li>DAPI ile solmaya karşı dayanıklı montaj ortamı (çekirdekleri boyamak için)</li>
	<li>Mikroskop kapak camı</li>
	<li>Hassas görev silmeleri</li>
	<li>Pipetatörler ve uçlar</li>
</ol>
Tahlil Spesifik Reaktifler
<ol başlat="14">
	<li>Yapışık hücreler (birincil hücreler veya hücre hatları); burada, CD1d ile transfekte edilmiş fare fibroblastları kullanıldı (LCD1).</li>
	<li>Hücresel hedefleri tespit etmek için birincil antikorlar; burada, sıçan anti-fare CD107a (LAMP-1) ve fare anti-fare CD1d kullanıldı.</li>
	<li>Primer antikor izotiplerine özgü florofor konjuge sekonje sekonder antikorlar; burada Alexafluor 488'e konjuge anti-sıçan IgG ve Alexafluor 647'ye konjuge anti-fare IgG kullanıldı.</li>
</ol>
2. Protokol
Antikor Boyaması için Hazırlık
Hücreleri tohumlama
<ol>
	<li>Büyüme ortamındaki ilgili hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	<li>Daha sonra, 500 μL hücre süspansiyonu / kuyu başına 4 oyuklu bir odacıklı slaytın kuyularına tohumlayın. (Burada, LCD1 hücreleri, 500 μL büyüme ortamında 2.5x105 hücre / odacıkta ekildi. Tohumlama yoğunluğu hücre hatları arasında değişebilir).</li>
	<li>Hücrelerin cama yapışmasını sağlamak için hazne slaytını gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, ortamı her bir oyuktan aspire edin ve ardından hücreleri 1X 500 μL PBS ile yıkayın.</li>
</ol>
Sabitleme
<ol başlat="5">
	<li>Hücreleri sabitlemek için, her bir oyuğa 500 μL% 1 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, paraformaldehiti uygun bir tehlikeli sıvı atık kabına toplayın.</li>
	<li>Ardından, fiksatifin kalıntılarını gidermek için hücreleri 500 μL PBS ile 3 kez yıkayın.</li>
</ol>
Geçirgenlik
<ol başlat="8">
	<li>Oda sıcaklığında 500 μL geçirgenleştirme tamponu/kuyusu ile 15 dakika inkübe ederek hücreleri geçirgen hale getirir.</li>
	<li>Daha sonra hücreleri 500 μL PBS ile 3 kez kısa bir süre yıkayın.</li>
</ol>
Engelleme
<ol başlat="10">
	<li>Spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için her bir oyuktaki hücreleri 500 μL bloke edici tampon ile 4 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
</ol>
Primer Antikor İnkübasyonu
<ol başlat="11">
	<li>Engelleme tamponunu kayar odalardan aspire edin.</li>
	<li>Daha sonra, hücrelere 500 μL seyreltilmiş primer antikor çözeltisi ekleyin. (Burada, anti-CD107a (LAMP-1) 1:500 oranında seyreltilmiş ve anti-CD1d seyreltilmemiş olarak kullanılmıştır (1H6 monoklonal antikoru Dr. Randy Brutkiewicz tarafından sağlanmıştır)).</li>
	<li>Slaytları gece boyunca 4°C'de inkübe edin.</li>
</ol>
Not: Birden fazla hedef için araştırma yapıyorsanız, birincil antikorların farklı izotipler olduğundan emin olun. Önerilen antikor konsantrasyonları üreticiler arasında farklılık gösterir ve kullanımdan önce titre edilmelidir.
İkincil Antikor İnkübasyonu
<ol başlat="14">
	<li>Kuyucuklardan birincil antikor çözeltisini aspire edin.</li>
	<li>Kuyu odalarını 500 μL PBS ile 4 kez yıkayın.</li>
	<li>Daha sonra, her bir oyuğa 500 μL seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisi ekleyin. (Burada, hem ikincil antikorlar - anti-fare IgG Alexafluor 647 hem de anti-sıçan IgG Alexafluor 488, bloke edici tamponda 1:2000 oranında seyreltildi).</li>
	<li>Karanlıkta 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, ikincil antikor çözeltisini aspire edin.</li>
	<li>Bağlanmamış ikincil antikoru çıkarmak için odaları 500 μL PBS ile 4 kez yıkayın.</li>
</ol>
Not: Önerilen antikor konsantrasyonları üreticiler arasında farklılık gösterir ve kullanımdan önce titre edilmelidir. Birden fazla hedef için araştırma yapılıyorsa, ikincil antikorlar, benzersiz uyarma / emisyon spektrumlarına sahip farklı floroforlara konjuge edilmelidir. Ayrıca floroforları seçerken nükleer karşı lekenin (yani DAPI) uyarılmasını/emisyonunu da aklınızda bulundurun. Florofor seçimi, kullanılan konfokal mikroskobun lazer konfigürasyonundan etkilenebilir. Makinenin lazer konfigürasyonu, deney için hangi floroforların uygun olduğunu belirleyecektir.
3. Lamellerin Montajı
<ol>
	<li>İlk olarak, odaları slayttan dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Ardından, slaytı hassas bir görev mendilinin üzerinde açılı olarak tutun ve hücrelere dokunmadan sıvıyı kenarlardan çıkarın.</li>
	<li>Hücrelerin her bir bölümüne nükleer leke DAPI içeren 1 damla antifade montaj ortamı ekleyin.</li>
	<li>Ardından, 20 mm x 60 mm'lik bir lamel parmak uçlarınızı kullanarak kenarlarından tutarak sürgünün üzerine yerleştirin. (Görüntülemeyi engelledikleri için hücreler üzerinde kabarcık oluşumundan kaçının).</li>
	<li>Yanlardaki ekstra montaj malzemelerini hassas bir çalışma mendiliyle silin ve slaytları karanlıkta oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklayın.</li>
</ol>
4. Konfokal Görüntüleme
Konfokal lazer tarama mikroskobunda görüntü örnekleri. Şekil 2'de gösterilen veriler için Nikon Eclipse Ti A1R, NIS Elements Advanced Research yazılımı ile kullanılmıştır. Aşağıdaki bölüm, yukarıda belirtilen yazılımı kullanarak görüntü yakalama prosedürünü detaylandırmaktadır.
<ol>
	<li>Hücreleri görüntülemeye başlamak için, 'NIS yazılımı simgesine' tıklayarak 'NIS Elements Advanced Research yazılımı'nı açın.</li>
	<li>Ardından, kontrol penceresinde 'TiPad' sekmesine tıklayın ve görüntüleme için istediğiniz hedefi seçin. (Burada ilk 40x objektif kullanılmıştır).</li>
	<li>Hücreleri olan slaytı sahne alanına yükleyin ve merceğin altında ortalayın.</li>
	<li>Şimdi, 'A1plus Compact GUI' sekmesinde, kullanılan floroforlara uygun lazerleri ayarlayın. Boya ve spektral ayarlar menüsünü açmak için dişli sembolüne tıklayın ve gereken kanalları seçin ve her kanal için lazeri ayarlayın.</li>
	<li>Ardından, ilk dikroik aynanın altındaki açılır menüden uygun emisyonları seçin.</li>
	<li>Ardından, 'A1plus Kompakt GUI' penceresi altında, kullanılan lazerlerin numune üzerinde aynı anda mı yoksa sırayla mı ateşleneceğini ayarlayan hat kanalı serisini ayarlamak için 'Ch. Serisi'ne tıklayın. (Burada, kanal 1 ile başlayan, ardından kanal 2 ve ardından 4 ile devam eden sıralı geçişler seçildi).</li>
	<li>Bundan sonra, üst kısımdaki 'Ok ucu' simgesine tıklayarak taramaya başlayın. Bu noktada, görüntüleme canlıyken, 'A1plus Kompakt GUI' penceresi altında, kayan ölçeğe tıklayın ve odak dışı ışığın sınırlandırılmasını sağlamak için iğne deliği boyutunu değiştirin. (Burada, mevcut en düşük ayar (0.5) kullanılmıştır).</li>
	<li>Ardından, olası arka plan lekelenmesini sınırlarken belirli lekelenmenin algılanmasını sağlamak için kayan ölçekleri kullanarak her lazerin altındaki 'yüksek voltaj' ve 'ofset' ayarlarını uygun seviyelere ayarlayın. Pozitif boyama örneği mevcutsa, lazer ayarlarının optimum sinyal-gürültü oranları sağladığından emin olmak için bu örneği her kanal için görüntüleyerek başlayın. 
	Dikkat: Uzun süre yüksek lazer yoğunluğu fotobleaching'e neden olabilir.</li>
	<li>Her lazer için en uygun HV ve ofset değerlerini ayarladıktan sonra, 'ND Alımı sekmesine' tıklayın ve ardından z serisi için parametreleri ayarlamak için 'Z' simgesini seçin. Ardından, numunenin canlı bir görüntüsünü alırken, önce görüntünün altını bularak ve 'alt' düğmesine tıklayarak alt kısmı ayarlayın, ardından numunenin en üst konumunu bulun ve 'üst' düğmesine tıklayın. Her adım için tercih edilen adım boyutunu μm cinsinden özel olarak yazarak veya toplam kaç adım gerektiğini belirterek adım boyutunu ayarlayın.</li>
	<li>Z serisi parametreleri ayarlandıktan sonra, görüntünün istenen boyut/piksel çözünürlüğünü seçin. Bunu yapmak için, 'A1plus Compact GUI' penceresine tıklayın ve 'boyut' simgesinin altında istediğiniz çözünürlüğü seçin. Görüntünün gürültüsünü azaltmak için, seçilen görüntü sayısının ortalamasını almak için 'ø' sembolünün yanındaki açılır menüyü seçebilirsiniz.</li>
	<li>Şimdi, örneği görüntülemeye başlamak için 'ND Edinme menüsündeki' 'Şimdi çalıştır' sekmesine tıklayın.</li>
	<li>Görüntüleme tamamlandıktan sonra, 'Dosya'ya ve ardından 'Farklı Kaydet'e tıklayarak görüntüyü kaydedin, bu da görüntü dosyasını '.nd2' uzantılı olarak dışa aktaracaktır. Son olarak, diğer örneklerin her biri için işlemi tekrarlayın.</li>
</ol>

Konfokal floresan boyama, geleneksel floresan mikroskobuna benzer şekilde hazırlanan numunelerin son derece yüksek kaliteli görüntüleriyle sonuçlanan nispeten basit bir prosedürdür. Kısaca numuneler sabitlenir, geçirgenleştirilir ve ardından bloke edilir. İlgilenilen bir proteine veya proteinlere karşı birincil antikorların bağlanmasına izin verilir, daha sonra boyamayı görselleştirmek için florofor konjuge ikincil antikorlar kullanılır. Konfokal floresan mikroskobunun birçok araştırma alanında uygulamaları vardır. Örneğ...

konfokal floresan mikroskobu: fare fibroblastlarında proteinlerin lokalizasyonunu belirlemek İçin bir teknik

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

Kaynak: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1 
1 Maryland Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Marlene ve Stewart Greenebaum Kapsamlı Kanser Merkezi, Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Anabilim Dalı, Baltimore, Maryland 21201 
2 Maryland Üniversitesi Tıp Fakültesi, Biyomedikal Mühendisliği ve Teknolojisi Merkezi, Baltimore, Maryland 21201
Konfokal floresan mikroskobu, geleneksel "geniş alanlı" epifloresan mikroskobuna kıyasla daha yüksek optik çözünürlük sağlayan bir görüntüleme tekniğidir. Konfokal mikroskoplar, tipik olarak bir seferde numunenin her pikseline lazer aydınlatmayı yönlendiren bir dizi voltaj kontrollü ayna (galvanometre veya "galvo" aynalar) olan "lazer tarama" yoluyla gelişmiş xy optik çözünürlük elde edebilir. Daha da önemlisi, konfokal mikroskoplar, taranan z-düzleminde olmayan konumlardan kaynaklanan odak dışı ışığı çıkarmak için bir iğne deliği kullanarak üstün z-eksenel çözünürlük elde eder, böylece dedektörün belirli bir z-düzleminden veri toplamasını sağlar. Konfokal mikroskopide elde edilebilen yüksek z çözünürlüğü nedeniyle, bir dizi z-düzleminden (z-yığını olarak da adlandırılır) görüntü toplamak ve yazılım aracılığıyla bir 3D görüntü oluşturmak mümkündür. 
Konfokal bir mikroskobun mekanizmasını tartışmadan önce, bir numunenin ışıkla nasıl etkileşime girdiğini düşünmek önemlidir. Işık, fotonlardan, elektromanyetik enerji paketlerinden oluşur. Biyolojik bir numuneye çarpan bir foton, numuneyi oluşturan moleküllerle dört yoldan biriyle etkileşime girebilir: 1) foton etkileşime girmez ve numuneden geçer; 2) foton yansıtılır/saçılır; 3) foton bir molekül tarafından emilir ve emilen enerji, topluca ışınımsız bozunma olarak bilinen süreçler yoluyla ısı olarak salınır; ve 4) foton emilir ve enerji daha sonra floresan olarak bilinen süreçle ikincil bir foton olarak hızla yeniden yayılır. Yapısı floresan emisyonuna izin veren bir moleküle florofor denir. Biyolojik örneklerin çoğu ihmal edilebilir endojen floroforlar içerir; bu nedenle, numunedeki ilgili özellikleri vurgulamak için eksojen floroforlar kullanılmalıdır. Floresan mikroskobu sırasında numune, florofor tarafından emilim için uygun dalga boyunda ışıkla aydınlatılır. Bir foton emildikten sonra, bir floroforun "uyarılmış" olduğu söylenir ve absorpsiyon süreci "uyarma" olarak adlandırılır. Bir florofor bir foton şeklinde enerji verdiğinde, süreç "emisyon" olarak bilinir ve yayılan fotona floresan denir. 
Bir floroforu uyarmak için kullanılan ışık huzmesi, bir mikroskobun objektif merceği tarafından odaklanır ve maksimum olarak odaklandığı bir "odak noktasında" birleşir. Odak noktasının ötesinde ışık tekrar birbirinden uzaklaşıyor. Giren ve çıkan ışınlar, odak noktasına dokunan bir çift koni olarak görselleştirilebilir (bkz. Şekil 1, sol panel). Kırınım olgusu, bir ışık huzmesinin ne kadar sıkı odaklanabileceğine bir sınır getirir - ışın aslında sonlu büyüklükte bir noktaya odaklanır. Odak noktasının boyutunu iki faktör belirler: 1) ışığın dalga boyu ve 2) sayısal açıklığı (NA) ile karakterize edilen objektif merceğin ışık toplama yeteneği. Odak "noktası" sadece x-y düzleminde değil, aynı zamanda z yönünde de uzanır ve gerçekte bir odak hacmidir. Bu odak hacminin boyutları, optik görüntüleme ile elde edilebilecek maksimum çözünürlüğü tanımlar. Fotonların sayısı odak hacmi içinde en fazla olmasına rağmen, odağın üstündeki ve altındaki konik ışık yolları da daha düşük bir foton yoğunluğu içerir. Işık yolundaki herhangi bir florofor bu şekilde uyarılabilir. Konvansiyonel (geniş alanlı) epifloresan mikroskobunda, odak düzleminin üstündeki ve altındaki floroforlardan gelen emisyon, Şekil 1'de gösterildiği gibi görüntü çözünürlüğünü ve kontrastı azaltan odak dışı floresansa ("puslu bir arka plan") katkıda bulunur ve kırmızı küp, odak düzleminin (kırmızı yıldız) üzerindeki florofor emisyonunu temsil eder ve bu da odak dışı floresan ile sonuçlanır (sağ üst). Bu sorun, bir iğne deliği kullanılması nedeniyle konfokal mikroskopide iyileştirilir. (Şekil 2, sağ altta). Şekil 3'te gösterildiği gibi, iğne deliği, odak yerinden kaynaklanan emisyonların dedektöre ulaşmasına izin verirken (solda), odak dışı floresansın (sağda) dedektöre ulaşmasını engeller, böylece hem çözünürlüğü hem de kontrastı iyileştirir. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig1.jpg"> 
Şekil 1. Epifloresansın konfokal mikroskopiye karşı optik çözünürlüğü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. </a>
Bir floroforu uyarmak için kullanılan ışık huzmesi, bir mikroskobun objektif merceği tarafından odaklanır ve bir odak hacminde birleşir ve sonra birbirinden ayrılır (solda). Kırmızı yıldız, görüntülenen bir numunenin odak düzlemini temsil ederken, kırmızı kare, odak düzleminin üzerindeki florofor emisyonunu temsil eder. Epifloresan mikroskop kullanarak bu örneğin bir görüntüsünü yakalarken, odak dışı kırmızı kareden gelen emisyon görünür olacak ve "puslu bir arka plana" (sağ üst) katkıda bulunacaktır. Konfokal mikroskoplar, odak düzleminin dışında yayılan ışığın algılanmasını önleyen ve "puslu arka planı" (sağ altta) ortadan kaldıran bir iğne deliğine sahiptir. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig2.jpg"> 
Şekil 2. Konfokal mikroskopide iğne deliği etkisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. </a>
Uyarma ışığının en yüksek yoğunluğu merceğin odak noktasında (sol, kırmızı oval) olmasına rağmen, numunenin odak noktasında olmayan diğer kısımları (sağ, kırmızı yıldız) ışık ve floresan alacaktır. Bu odak dışı bölgelerden yayılan ışığın dedektöre ulaşmasını önlemek için dedektörün önünde iğne deliği olan bir ekran bulunur. Yalnızca odak düzleminden yayılan odak içi ışık (solda) iğne deliğinden geçerek dedektöre ulaşabilir. Odak dışı ışık (sağda) iğne deliği ile engellenir ve dedektöre ulaşamaz. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig3.jpg"> 
Şekil 3. Konfokal lazer tarama mikroskobunun temel bileşenleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10501/10501fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. </a>
Basitlik adına, konfokal bir mikroskobun mekanik tanımı Nikon Eclipse Ti A1R'ninkiyle sınırlı olacaktır. Farklı konfokal mikroskoplar arasında küçük teknik farklılıklar olsa da, A1R, konfokal mikroskop işlevini tanımlamak için iyi bir model olarak hizmet eder. Bir dizi diyot lazer tarafından üretilen uyarma ışık huzmesi, birincil dikroik ayna tarafından objektife yansıtılır ve bu da ışığı görüntülenen örneğe odaklar. Birincil dikroik ayna, diğer dalga boylarındaki ışığın geçmesine izin verirken, uyarma ışığını seçici olarak yansıtır. Işık daha sonra, ışık huzmesini numune boyunca x-y şeklinde süpüren ve her seferinde tek bir (x,y) pikseli aydınlatan tarama aynalarıyla karşılaşır. Aydınlatılan pikselde floroforlar tarafından yayılan floresan, objektif lens tarafından toplanır ve bir dizi fotoçoğaltıcı tüpe (PMT'ler) ulaşmak için birincil dikroik aynadan geçer. İkincil dikroik aynalar, emisyon ışığını uygun PMT'ye yönlendirir. Numune tarafından objektife geri saçılan uyarma ışığı, birincil dikroik ayna tarafından numuneye geri yansıtılır ve böylece algılama ışık yoluna girmesi ve PMT'lere ulaşması önlenir (bkz. Şekil 3). Bu, nispeten zayıf floresansın, tipik olarak floresanstan çok daha yoğun olan uyarma ışık huzmesinden saçılan ışıkla kirlenmeden ölçülmesine izin verir. İğne deliği odak hacminin dışından gelen ışığı engellediğinden, dedektöre gelen ışık dar, seçilmiş bir z düzleminden gelir. Bu nedenle, görüntüler bir dizi bitişik z-düzleminden toplanabilir; Bu görüntü dizisi genellikle 'Z-Yığını' olarak adlandırılır. Uygun yazılım kullanılarak, numunenin 3D görüntüsünü oluşturmak için bir z yığını işlenebilir. Konfokal mikroskopinin özel bir avantajı, boyamanın hücre altı lokalizasyonunu ayırt etme yeteneğidir. Örneğin, konvansiyonel epifloresan mikroskobu ile çok zor olan membran boyaması ile hücre içi boyama arasındaki ayrım (1, 2, 3). 
Numune hazırlama, konfokal görüntülemenin önemli bir yönüdür. Optik mikroskopi tekniklerinin güçlü bir gücü, canlı veya sabit hücreleri görüntüleme esnekliğidir. 3D görüntüler üretmeye çalışırken, bir z-yığını için elde edilmesi gereken görüntü sayısı, hücre sağlığını korumanın zorluğu ve canlı hücrelerin ve organellerinin hareketi nedeniyle, sabit hücrelerin kullanılması tipiktir. Konfokal floresan için hücrelerin sabitlenmesi ve boyanması prosedürü, geleneksel olarak immünofloresanda kullanılana benzer. Hazne slaytlarında veya lamellerde kültürden sonra, hücreler hücresel morfolojiyi korumak için paraformaldehit kullanılarak sabitlenir. Spesifik olmayan antikor bağlanması, sığır serum albümini, süt veya normal serum kullanılarak bloke edilir. İkincil antikorların özgüllüğünü korumak için, kullanılan çözelti, birincil antikorların üretildiği aynı türden kaynaklanmamalıdır. Hücreler, ilgilenilen antijeni bağlayan primer antikorlarla inkübe edilir. Birkaç hücresel hedefi etiketlerken, birincil antikorların her biri farklı bir türden türetilmelidir. Bir antijeni etiketleyen antikorlar daha sonra florofor konjuge ikincil antikorlar tarafından bağlanır. Floroforla konjuge ikincil antikorlar, konfokal mikroskopta bulunan lazer uyarma dalga boyları ile uyumlu olacak şekilde seçilmelidir. Birden fazla antijeni görselleştirirken, floroforların uyarma/emisyon spektrumları, sinyallerinin mikroskobik analizle ayırt edilebilmesi için yeterince farklı olmalıdır. Lekeli numune daha sonra görüntüleme için bir lam üzerine monte edilir. Foto ağartma ve numune dehidrasyonunu önlemek için bir montaj ortamı kullanılır. İstenirse, nükleer bir karşı leke (örneğin DAPI veya Hoechst) içeren bir montaj ortamı kullanılabilir (4). 
Aşağıdaki protokolde, CD1d'yi (LCD1) eksprese etmek için transfekte edilen fare fibroblastları, CD1d ve CD107a'yı (LAMP-1) tanıyan antikorlarla boyandı. CD1d, lipid antijenlerini sunan antijen sunan hücrelerin yüzeyinde bulunan majör histouyumluluk kompleksi 1 (MHC 1) benzeri bir reseptördür. LAMP-1 (lizozomal ilişkili membran proteini-1), esas olarak lizozomal membranlarda bulunan bir transmembran proteinidir. Uygun antijen sunumu için, CD1d düşük pH'lı lizozomal bölmeden geçirilir, bu nedenle LAMP-1, bu protokol için lizozomal bölmenin bir belirteci olarak kullanılır. Farklı türlerde üretilen anti-CD1d ve anti-LAMP-1 ile LCD1 hücrelerinin araştırılmasıyla, hücredeki her bir proteinin lokalizasyonunu ve CD1d'nin LAMP-1 pozitif lizozomal bölmelerde bulunup bulunmadığını belirlemek için benzersiz floroforlara sahip ikincil antikorlar kullanılabilir.

Bu deneyde, yüzey glikoprotein geni CD1d'yi eksprese eden fare fibroblastları sabitlendi, immün immün boyalandı ve konfokal mikroskopta görüntülendi. Yukarıdaki protokol kullanılarak elde edilen temsili bir görüntü Şekil 4'te gösterilmiştir. A'nın üst panelinde, her bir hedefin boyama modelini gösteren tek kanallı görüntüler sunulmaktadır. Bu görüntüler, yakalanan z yığınının tek bir bölümünü (dilimini) oluşturur. Sağ panel, hücrelerin çekirdeklerinin DAPI boyamasını gösterir. Orta panell...

Konfokal Floresan Mikroskobu: Fare Fibroblastlarında Proteinlerin Lokalizasyonunu Belirlemek İçin Bir Teknik

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine ...

Konfokal floresan mikroskobu, antijeni antikor konjuge floresan boya ile etiketleyerek ve floresan sinyalini tespit ederek bir hücre veya doku örneğinde ilgilenilen bir proteinin veya antijenin lokalizasyonu için özel bir görüntüleme tekniğidir. Objektif merceğin odak düzlemlerine yerleştirilmiş iki iğne deliği yardımıyla geniş alanlı floresan mikroskobundan daha yüksek uzamsal çözünürlük sunar ve ona konfokal adını verir. Kullanıcıların, yüzey zarı boyaması ile hücre içi boyama arasındaki ayrım gibi hücre altı düzeyde lekelenmeyi görselleştirmelerini sağlar. Konfokal mikroskop, klasik bir floresan mikroskobu ile benzer bir temel prensibi takip eder. Bir ışık kaynağından, genellikle konfokal için bir lazerden gelen ışın, dikroik bir ayna tarafından yansıtılır ve numune üzerinde objektif bir mercek tarafından odaklanır. Bu ışık, floroforları, objektif mercek ve dikroik aynadan bir kameraya veya merceğe geri dönen farklı bir dalga boyu yaymak için uyarır. Konfokal bir mikroskobun gelişmiş çözünürlüğü, esas olarak, ışığın uyarma ve emisyon ışık yollarından geçmesi için çok küçük delikler olan iki iğne deliğinin varlığından kaynaklanmaktadır. İğne delikleri, objektif merceğin odak düzlemine stratejik olarak yerleştirilmiştir. Şimdi, ışık yolunu gözden geçirmek için mikroskop düzenlemesinin yandan görünüm şemasına geçelim. Uyarma iğne deliğinden geçtikten sonra, uyarma ışık huzmesi, bir odak noktasından kaynaklanma etkisine sahiptir, bu da objektif merceğin ışığı daha sonra numune üzerindeki bir noktaya odaklamasını sağlar. Bu odak noktasından gelen emisyon ışını, içinden geçmesine izin veren emisyon iğne deliğinde birleşir. Şimdi uyarma sırasında, ışık yolu içindeki, odak noktasının üstündeki ve altındaki floroforlar da hafifçe uyarılır. Odak noktasından kaynaklanan emisyon ışığı iğne deliğinden geçerken, odak dışı noktalardan gelen emisyonlar, emisyon iğne deliğinden önce veya sonra birleşir ve bu nedenle bloke edilir, bu da arka plan floresansının azalmasına neden olur. Uyarma-emisyon algılama döngüsünün, ilgilenilen bölgedeki her görüntüleme noktası için tekrarlanması gerekir ve bu birkaç farklı şekilde yapılabilir. Örneğin, lazer taramalı konfokal, uyarma ışığını farklı açılarda saptıran galvanometre tarama aynalarını kullanır. Bu nedenle, ışık huzmesini XY düzlemindeki numune boyunca süpürmek. Eğirme diski konfokal, iğne deliklerinin düzenini kaydırmak için dönen bir dizi iğne deliğine sahip bir disk kullanır. Bu, kullanıcıların her seferinde numunedeki birden fazla küçük görüntüleme noktasını aydınlatmasına olanak tanır ve disk döndükçe tüm alanı kademeli olarak kaplar. İğne deliklerinin bir sonucu olarak, dedektördeki XY görüntüsü dar bir Z düzlemini temsil eder. Bu nedenle, görüntüler, genellikle Z yığını olarak adlandırılan bir dizi ardışık Z düzleminden toplanabilir. Bu görüntülerden, uygun bir yazılım, numunedeki floresan sinyal modelinin 3 boyutlu bir tasvirini oluşturabilir. Bu protokolde, fare fibroblastlarının immün boyamalarını gözlemleyecek, ardından bir hücre yüzey proteinini ve bir lizozomal proteini diferansiyel olarak görselleştirmek için konfokal mikroskopta görüntüleme yapacaksınız. Başlamak için, steril teknikler kullanarak, ilgilenilen hücreleri oyuk başına 500 mikrolitre büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve daha sonra bunları dört oyuklu bir odacıklı slaytın kuyularına tohumlayın. Burada, antijen sunan molekül olan CD1d'yi eksprese etmek için transfekte edilmiş fare fibroblastlarını kullanıyoruz. Hücrelerin cama yapışmasını sağlamak için, hazne sürgüsünü 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatöre yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin. Sabahları, ortamı her bir oyuktan aspire edin ve ardından hücreleri birkaç saniye boyunca 500 mikrolitre PBS ile yıkayın. Hücreleri sabitlemek için, her oyuğa 500 mikrolitre% 1 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, paraformaldehiti uygun bir tehlikeli sıvı atık kabına toplayın ve ardından hücreleri birkaç saniye boyunca PBS ile üç kez yıkayarak fiksatifin kalıntılarını çıkarın. Antikorun hücrelere nüfuz etmesine izin vermek için, her oyuğa 500 mikrolitre geçirgenlik tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tezgahta inkübe edin. Geçirgenlikten sonra, hücreleri 500 mikrolitre PBS ile üç kez kısa bir süre yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa 500 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için dört santigrat derecede bir saat inkübe edin. Primer antikorları, anti-CD1d ve anti-LAMP-1'i uygun çalışma konsantrasyonlarında hazırlayın. Daha sonra, tamponu kuyucuklardan aspire edin ve her bir oyuktaki hücreleri 500 mikrolitre seyreltilmiş primer antikor çözeltisi ile örtün ve ardından slaydı gece boyunca dört santigrat derecede düz bir yüzeyde inkübe edin. Ertesi sabah, ikincil antikorları, bu durumda farklı floresan etiketlere sahip bir anti-fare ve anti-sıçan antikoru, tamponu uygun çalışma konsantrasyonlarına bloke ederek seyreltin. Daha sonra, birincil antikor çözeltisini kuyucuklardan aspire edin ve ardından hücreleri 500 mikrolitre PBS ile dört kez yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa 500 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve karanlıkta bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ikincil antikor çözeltisini aspire edin ve bağlanmamış ikincil antikoru çıkarmak için kuyucukları 500 mikrolitre PBS ile dört kez yıkayın. Numuneleri son yıkamadan sonra monte etmek için, hazneleri slayttan dikkatlice ayırın ve çıkarın. Kalan PBS'yi çıkarmak için, slaydı hassas bir görev mendilinin üzerinde belirli bir açıyla tutun ve hücrelere dokunmadan sıvıyı kenarlardan çıkarın. Fazla PBS çıkarıldıktan sonra, hücrelerin her bir bölümüne nükleer leke DAPI içeren bir damla antifade montaj ortamı ekleyin. Ardından, 20 x 60 milimetrelik bir lamel alın ve sadece parmak uçlarınızı kullanarak, hücreler üzerinde kabarcık oluşumunu önlemeye dikkat ederek lamel her iki kenarda yavaşça indirmeye başlayın. Slaytlardaki ekstra montaj ortamlarını hassas bir görev mendiliyle silin ve slaytları karanlıkta oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklayın. Hücreleri görüntülemeye başlamak için önce masaüstündeki NIS yazılım simgesine tıklayın. Kontrol penceresine girdikten sonra, üst kısımdaki TiPad sekmesine tıklayın ve görüntüleme için istediğiniz hedefi seçin. Ardından, hücrelerle birlikte slaydı sahne alanına yükleyin ve merceğin altında ortalayın. Ardından, TiPad sekmesinin yanındaki A1plus Compact GUI sekmesinde, kullanılan floroforlara uygun lazerleri ayarlayın. Boya ve spektral ayarlar menüsünü açmak için dişli sembolüne tıklayın. Boya ve spektral ayarlar menüsü açıldıktan sonra, gerekli kanalları seçin ve her kanal için lazeri ayarlayın. Ardından, ilk dikroik aynanın altındaki açılır menüden uygun emisyonları seçin. Ardından, A1plus Kompakt GUI penceresi altında, kullanılan lazerlerin numune üzerinde aynı anda mı yoksa sırayla mı ateşleneceğini ayarlayan hat kanalı serisini ayarlamak için Ch.Series'e tıklayın. Bundan sonra, üstteki ok ucu simgesine tıklayarak taramaya başlayın. Bu noktada, görüntüleme canlıyken, A1plus Compact GUI penceresi altında, kayan ölçeğe tıklayın ve odak dışı ışığın sınırlandırılmasını sağlamak için iğne deliği boyutunu değiştirin. Ardından, olası arka plan lekelenmesini sınırlarken belirli lekelenmenin algılanmasını sağlamak için kayan ölçekleri kullanarak her lazerin altındaki yüksek voltaj ve ofset ayarlarını uygun seviyelere ayarlayın. Pozitif bir boyama örneği mevcutsa, lazer ayarlarının optimum sinyal-gürültü oranları sağladığından emin olmak için bu örneği her kanal için görüntüleyerek başlayın. Her lazer için en uygun HV ve ofset değerlerini ayarladıktan sonra, ND Alımı sekmesine tıklayın ve ardından z serisi için parametreleri ayarlamak için Z simgesini seçin. Ardından, örneğin canlı bir görüntüsünü alırken, önce görüntünün altını bularak ve alt düğmeye tıklayarak alt kısmı ayarlayın. Ardından, numunenin en üst konumunu bulun ve üst düğmeye tıklayın. Her adım için tercih edilen adım boyutunu mikron cinsinden özel olarak yazarak veya toplam kaç adım gerektiğini belirterek adım boyutunu ayarlayın. Görüntünün istenen boyutunu/piksel çözünürlüğünü seçmek için Aiplus Compact GUI penceresine tıklayın ve boyut simgesinin altında istediğiniz çözünürlüğü seçin. Görüntünün gürültüsünü azaltmak için, seçilen görüntü sayısının ortalamasını almak için teta sembolünün yanındaki açılır menüyü seçebilirsiniz. Bundan sonra, örneği görüntülemeye başlamak için ND Alımı menüsündeki Şimdi Çalıştır sekmesine tıklayın. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, dosyaya tıklayarak görüntüyü kaydedin, ardından farklı kaydet, bu görüntü dosyasını dot-nd2 uzantılı olarak dışa aktaracaktır. Son olarak, diğer örneklerin her biri için işlemi tekrarlayın. Bu deneyde, yüzey glikoprotein geni CD1d'yi eksprese eden fare fibroblastları sabitlendi, immün immün boyalandı ve konfokal bir mikroskopta görüntülendi. Bu görüntü, CD1d'nin kırmızıyla boyandığı 40X büyütmede bir Z yığınının tek bir bölümünü göstermektedir. Numune, yeşil renkte bir lizozomal belirteç olan LAMP-1 ile boyandı. Hücrelerin çekirdeklerini göstermek için nükleer leke DAPI kullanıldı. Üç farklı kanalın birleştirildiği bileşik bir görüntüde, sarı renk görünümü kırmızı ve yeşil kanalların üst üste binmesinden kaynaklanır ve CD1d ve LAMP-1'in lizozomlarda birlikte lokalize olduğu bir alanı gösterir. Sadece bir rengin mevcut olduğu alanlar, birlikte lokalizasyon olmadan CD1d veya LAMP-1'in varlığını gösterir. Bu görüntü, z-yığınında yakalanan görüntülerden oluşturulan hücrelerin 3B görüntüsünü gösterir ve bu yöntem, bu hücre grubunun yandan görünümünün oluşturulmasını sağlar. Aşağıdaki resim, 100X büyütmede z-yığınından bir kesiti göstermekte ve bu iki proteinin ekspresyon modellerini daha ayrıntılı olarak göstermektedir. Görüntünün sağ tarafındaki pembe çerçeveli kutu, görüntüdeki pembe çizgiyle belirlenen x koordinatının kesitini gösterir ve bu, pembe çizginin yandan görünümünü temsil eder. Benzer şekilde, görüntünün altındaki mavi çerçeveli kutu, görüntüdeki mavi çizgiyle belirlenen ve mavi çizgideki ön görünümü temsil eden y koordinatının enine kesitini gösterir. Z yığını görüntüsünün 3B görüntüsü, kullanıcıların görüntüyü 3B olarak görüntülemesine ve tüm x, y ve z düzlemlerini görselleştirmesine olanak tanır. Bu, hücre içindeki farklı bölgelerdeki farklı lekelerin birlikte lokalizasyonunu incelemek için kullanılabilir.

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

İleri Biyoloji

Immunology

İmmünoloji

confocal microscopy for protein localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell.

The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a molecule that can fluoresce. Because most biological samples have very little natural fluorescence, researchers usually add fluorescent labels to highlight the structures they want to study.

A confocal microscope focuses light into a small focal volume, not just a single point in the x-y plane. The size of that volume depends on the wavelength of light and the numerical aperture, or NA, of the objective lens. Light above and below the focal plane can still excite fluorophores, but the pinhole removes most of the unwanted emission before it reaches the detector.

Compared with conventional epifluorescence microscopy, this design reduces the hazy background caused by out-of-focus fluorescence. The result is sharper images and better contrast. Confocal microscopy also allows collection of images from a series of z-planes, called a z-stack, which can be processed into a 3D image with software.

The microscope described in the protocol uses diode lasers, a primary dichroic mirror, scanning mirrors, and photomultiplier tubes, or PMTs. The dichroic mirror reflects the excitation light into the objective while letting other wavelengths pass through. The scanning mirrors move the beam across the sample one pixel at a time, and the PMTs detect the emitted fluorescence. The pinhole and optical path also help keep scattered excitation light out of the detector so the weaker fluorescence signal can be measured more clearly.

One major advantage of confocal imaging is that it can separate membrane staining from intracellular staining more clearly than wide-field methods. This is useful when studying where a protein is found inside a cell. It is especially helpful when a 3D view is needed from a z-stack.

Preparing the sample is an important part of the process. For 3D imaging, fixed cells are often used because live cells can move and are harder to keep healthy while many z-planes are collected. Cells are grown on chamber slides or coverslips, fixed with paraformaldehyde, and blocked with bovine serum albumin, milk, or normal serum to reduce nonspecific antibody binding. The blocking solution should not come from the same species used to make the primary antibodies.

Next, the cells are stained with primary antibodies that bind the target antigen. If several targets are being labeled, each primary antibody must come from a different species. Fluorophore-conjugated secondary antibodies then bind the primary antibodies. Their excitation and emission properties must match the lasers on the confocal microscope, and the fluorophores should be different enough that the signals can be separated. A mounting medium is used to protect the sample from photobleaching and drying, and it may include a nuclear counterstain such as DAPI or Hoechst.

In the protocol shown here, mouse fibroblasts were made to express CD1d and were stained for CD1d and CD107a, also called LAMP-1. CD1d is a major histocompatibility complex 1, or MHC 1, like receptor that presents lipid antigens on antigen-presenting cells. LAMP-1 is a transmembrane protein found mainly in lysosomal membranes and serves as a marker for the lysosomal compartment. Because CD1d must travel through this low-pH compartment for proper antigen presentation, confocal imaging can show whether CD1d is present in LAMP-1-positive lysosomes.

Confocal Microscopy for Protein Localization

confocal-microscopy-for-protein-localization

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

Bu koleksiyon, bağışıklık hücrelerinin etiketlenmesi ve sınıflandırılması da dahil olmak üzere immünoloji laboratuvarlarında kullanılan birçok temel tekniğini kapsar. Ayrıca, bağışıklık hücreleri ve antikorlar için proliferasyon yöntemlerinin yanı sıra ELISA da dahil olmak üzere bağışıklık aktivitesi konusundaki yaygın testleri içerir. Son olarak, immün doku ve hücre örneklerinin boyanmasını ve görüntülenmesini anlatır.

See how confocal fluorescence microscopy uses lasers, a pinhole, and z-stacks to reveal protein location in mouse fibroblasts and other cells.

Confocal Microscopy for Protein Localization

Description

Transcript

Tags