Name: chromium release assay for immune cell killing
Uploaded: 2023-04-30T07:09:15.000Z
Duration: 11 min 48 s
Channel: JoVE

Prosedüre Genel Bakış
Hücre ölümünü ölçmek için tipik 51Cr salınımlı test aşağıdaki adımları içerir:
<ol>
	<li>İlk olarak, hedef hücreler Na2 [51Cr] O4 ile etiketlenir. Bu, onları tahlildeki efektör hücrelerden ayırır.</li>
	<li>Hedef hücreler etiketlenirken, efektör hücreler toplanır ve seri seyreltme tekniği kullanılarak, efektör hücrelerin azalan bir titrasyonu, yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir tahlil plakasında oluşturulur.</li>
	<li>Hedef hücre etiketlemesinin sonunda, hücreler önce yıkanır ve daha sonra bir dizi efektör hücre seyreltmesi içeren tahlil plakasına sabit sayıda hücre eklenir.</li>
	<li>Daha sonra, hedef-efektör hücre karışımı, hücre lizizine aracılık etmek için hedef hücrelerle yeterli hücre etkileşimine izin vermek için belirli bir süre boyunca inkübe edilir.</li>
	<li>Son olarak, kültür süpernatantları hasat edilir ve tüplere toplanır. 51Cr miktarı, bir gama sayacı kullanılarak ölçülür.</li>
	<li>Sonunda, veriler toplanır ve hedef hücrelerin "yüzde spesifik hücre lizizini" hesaplamak için kullanılır.</li>
</ol>
1. Hedef Hücreleri 51Cr ile Etiketleme
<ol>
	<li>Başlamak için, hedef hücreleri (burada insan melanom hücre hattı WM793) tek hücreli bir süspansiyona hazırlayın.</li>
	<li>Bunu yapmak için, önce ortamı doku kültürü şişesinden çıkarın.</li>
	<li>Ardından, hücreleri 5 mL 1X PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Plakaya ~ 2 dakika boyunca 1 mL tripsin ekleyerek hücreleri tripsinize edin.</li>
	<li>Şişenin yüzeyindeki hücreleri gevşetmek için şişeye hafifçe vurun.</li>
	<li>Şişeye 5 mL RPMI ortamı ekleyin ve hücreleri ayırmak için ortamı yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe toplayın ve hücre süspansiyonunu 1200 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın.</li>
	<li>Peletin içine 10 mL besiyeri ekleyin ve hücreleri süspansiyona getirmek için besiyerini nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>Bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.</li>
	<li>1x106 hücreyi yeni bir 15 mL konik tüpe aktarın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 1200 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın.</li>
	<li>Hücre peletini geride kalan küçük hacimdeki ortamda yeniden süspanse etmek için tüpü kısaca girdaplayın.</li>
	<li>100 μCi 51Cr'yi doğrudan WM793 hedef hücre süspansiyonuna ekleyin. 
	Not: Belirli bir radyoaktivite için kurulmuş özel bir laboratuvar alanı olmalıdır. Ek olarak, tüm adımlar sırasında 51Cr'nin güvenli bir şekilde saklanması ve kullanılması için yeterli kurşun koruması ve 51Cr'li numunelerin nerede tutulduğunu gösteren uygun işaretler bulunmalıdır. Olası kontaminasyon alanını araştırmak için gözleme probu ile donatılmış bir Geiger sayacı da gereklidir.</li>
	<li>Tüpün artık radyoaktif olduğunu belirtmek için tüpe küçük bir parça radyoaktif bant ekleyin.</li>
	<li>Tüpü kurşun kalkanlı 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve 1 saat inkübe edin. Kromun hedef hücre alımını artırmak için tüpü her 15-20 dakikada bir hafifçe vurun.</li>
	<li>İnkübasyon süresinden sonra, fazla 51Cr'yi çıkarmak için hedef hücreleri 5 mL FBS ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 1200 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin. Radyoaktif FBS yıkamasını uygun atık kabına boşaltın.</li>
	<li>Peleti tekrar süspanse edin ve FBS ile ikinci kez yıkayın. Bir Geiger sayacı kullanarak peleti birleşik radyoaktivite açısından kontrol edin.</li>
	<li>Peletleri 10 mL tam ortamda yeniden süspanse ederek 105 hücre/mL. hücre konsantrasyonu elde edin
	Not: 51Cr etiketlemesinden sonraki hücre sayma adımı, büyük ölçüde güvenlik nedenleriyle burada atlanmıştır. WM793 hücre konsantrasyonunun, 51Cr etiketlemesinden öncekiyle aynı olduğu varsayılabilir.</li>
</ol>
2. Efektör Hücrelerin Hazırlanması
<ol>
	<li>İnsan veya fare T hücreleri ve NK hücreleri gibi çeşitli efektör hücreler kullanılabilir. Bu örnekte, standart yoğunluk gradyan santrifüjleme (5x106 konsantrasyona kadar) ile tam kandan izole edilen PBMC'ler kullanılmıştır.</li>
	<li>Başlamak için, 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakanın sıralarından birinin (burada satır A, Bkz. Tablo 1) her bir oyuğuna 100 μL doku kültürü ortamı ekleyin. Burada, hiçbir efektör hücre eklenmez ve hedef hücrelerden "minimum / spontan 51Cr salınımını" belirlemek için 'boş' olarak görev yaparlar.</li>
</ol>
<img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505table1.jpg"> 
Tablo 1: 51Cr serbest bırakma tahlil düzeni: Satır A- Yalnızca ortamla inkübe edilen hedef hücreler (104 hücre / 100 μL) ("minimum/spontan 51Cr salınımını" belirlemek için 'boş' oluşturur). Farklı efektör içeren B ila C kuyuları: 50:1 ile 1,5:1 arasında değişen hedef hücre (E:T) oranları. Sıra H- hedef hücreler (104 hücre / 100 μL)% 1 NP-40 ile inkübe edilmiştir (NP-40, hedef hücreleri parçalayarak "maksimum veya toplam 51Cr salınımı" üretir). Her E: T oranı, her deney koşulu için üç nüsha olarak test edilir. Sütun 1-3- uyarılmamış PBMC'ler ve sütun 4-6- CpG ile uyarılmış PBMC'ler.
<ol ba>
	<li>Daha sonra, 5x105 ila 15.625 hücre/100 μL ortam arasında değişen bir efektör hücre konsantrasyonu elde etmek için PBMC'lerin 2X seri hücre seyreltmesini (her deneysel koşul için üç kopya halinde) oluşturun (burada B ila G satırları). 
	Not: Bu örnekte, başlangıç efektörü: hedef hücre (E: T) oranı 50: 1'dir. Bununla birlikte, bu oran deneysel özelliklere bağlı olarak ayarlanabilir.</li>
	<li>Bu kuyucuklara herhangi bir efektör hücre eklemeyerek son satırı (burada H satırı) boş bırakın. (Bu satır, "toplam sayım/dk veya (c. p. m)" veya "maksimum 51Cr sürümü" oluşturmak için kullanılacaktır).</li>
	<li>Hedef hücreler eklenmeye hazır olana kadar plakayı 37 ° C inkübatöre yerleştirin.</li>
</ol>
3. Teste 51Cr etiketli WM793 hedef hücresi eklenmesi
<ol>
	<li>Kuluçka süresinden sonra, hedef hücreleri inkübatörden çıkarın ve fazla 51Cr'yi çıkarmak için 5 mL FBS ile yıkayın.</li>
	<li>Belirlenmiş bir santrifüj kullanarak hücreleri 1200 rpm'de 5 dakika</li> santrifüjleyin.
	<li>FBS yıkamasını (radyoaktif süpernatan) uygun bir atık kabına çıkarın.</li>
	<li>Peleti 5 mL'lik taze bir FBS içinde yeniden süspanse ederek yıkama adımını tekrarlayın.</li>
	<li>Hücreleri tekrar 1200 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Son olarak, peleti 10 mL tam ortamda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>51Cr etiketli WM793 hücre süspansiyonunu (105 hücre / mL) tek kullanımlık bir reaktif haznesine dökün.</li>
	<li>Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak 96 oyuklu efektör hücre plakasının her bir oyuğuna bu etiketli hedef hücrelerden 100 μL ekleyin.</li>
	<li>Daha sonra, herhangi bir efektör hücreden yoksun kuyucuk sırasına (burada H satırı) 100 μL% 1 NP-40 (su içinde) ekleyin. % 1 NP-40 hedef hücreleri parçalayacak ve böylece bu kuyucuklar "toplam sayım / dak veya (c. p. m)" veya maksimum 51Cr salınımını belirlemek için kontrol görevi görecektir.</li>
	<li>Plakanın her iki tarafına küçük bir parça gaz geçirgen bant ekleyerek kapağı plakaya sabitleyin ve 51Cr içerdiğini belirtmek için kapağın üzerine bir parça radyoaktif bant yerleştirin.</li>
	<li>Kısaca, plakayı 1200 rpm'de santrifüjleyin. Yalnızca bir deney plakası kullanılıyorsa, santrifüje bir denge plakası ekleyin. 
	Not: Radyoaktif numuneleri işlemek için işaretlenmiş bir santrifüj kullanmak önemlidir.</li>
	<li>Plakayı santrifüjden çıkarın.</li>
	<li>Ek güvenlik için plakayı 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve plakanın üzerinde küçük bir kurşun koruma parçası bulun. Hedef hücre lizizine izin vermek için 16 saat inkübe edin. 
	Not: Kuluçka süresi, kullanılan efektör hücrelere ve kullanılan potansiyel öldürme mekanizmasına bağlı olarak 4 ila 18 saat arasında değişebilir.</li>
</ol>
4. Süpernatanları Hasat Etmek
<ol>
	<li>Kuluçka süresinin sonunda, plakanın kenarındaki bandı dikkatlice çıkarın ve kapağı çıkarın.</li>
	<li>Ardından, hasat çerçevesini plakaya yerleştirin ve pamuk tapalarının her biri için küçük filtre disklerinin yerinde olduğundan emin olun. Bu, hücresiz bir süpernatantın toplanmasını sağlayacaktır.</li>
	<li>Şimdi, pamuk tapalarını yavaşça ve nazikçe kuyucuklara bastırın.</li>
	<li>Yaklaşık 10 saniye sonra, pamuk tapaları üzerindeki basıncı boşaltın ve ardından pamuk tapaları tüp şeritlerine aktarın.</li>
	<li>Bu tüplerin her birini ikincil bir FACS tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>Son olarak, FACS tüplerini gama sayacına yükleyin ve her koşulda salınan 51Cr miktarını ölçmek için numuneleri çalıştırın. Numuneler tipik olarak 1 dakika boyunca ölçülür ve bu da "sayım/dakika" nın kolay bir şekilde belirlenmesine olanak tanır.</li>
	<li>Dikkatlice, tüplerin tezgaha yüklenme sırasını kaydedin.</li>
</ol>
5. Veri Analizi
<ol>
	<li>Burada, ilk üç sütuna uyarılmamış PBMC'ler eklendi ve CpG ile uyarılan PBMC'ler (CpG ODN, (24 saat boyunca 1 μg/mL)) sütun 4-6'ya eklendi. Tablo 2'ye bakın.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="her zaman">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bir</td>
			<td>1251</td>
			<td>1157</td>
			<td>1086</td>
			<td>917</td>
			<td>1118</td>
			<td>1140</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>1832</td> ·
			<td>1986</td> Yılı
			<td>1971</td> Yılı
			<td>7629</td>
			<td>7913</td>
			<td>8180</td> numaralı telefondan temin edilmiştir.
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ç</td>
			<td>1677</td> Yılında
			<td>1739</td> Yılında
			<td>1428</td>
			<td>5454</td> sayılı Kanun Hükmünde Kararname
			<td>5055</td> Haber Kaynağı
			<td>5268</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>1638</td> Yılında
			<td>1552</td> Adet
			<td>1734</td> Yapımı
			<td>4239</td>
			<td>3582</td>
			<td>3786</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>1658</td> Yılında
			<td>1580</td> Adet
			<td>1339</td>
			<td>2818</td>
			<td>2623</td>
			<td>2750</td> adet
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>1579</td> Yılında
			<td>1472</td> Adet
			<td>1483</td>
			<td>2028</td> Yılı
			<td>1779</td> Yapımı
			<td>1769</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>1326</td>
			<td>1325</td> Adet
			<td>1184</td>
			<td>1801</td> Yapımı
			<td>1654</td> Yılı
			<td>1565</td> Adet
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>9220</td>
			<td>9367</td>
			<td>8067</td>
			<td>8774</td>
			<td>9647</td>
			<td>8236</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ben</td>
			<td colspan="2">A1,A2,A3 ortalaması -&gt;</td>
			<td>1164,67</td>
			<td>Spontan c.p.m</td>
			<td></td>
			<td>1058,33</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J</td>
			<td colspan="2">B1,B2,B3 ortalaması -&gt;</td>
			<td>1929,67</td>
			<td>%9,91</td>
			<td></td>
			<td>7907,33</td>
			<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol ba><li><li><li> <img src="/files/ftp_upload/10505/10505eq1.jpg"></li><li></ol>

Burada açıklanan tahlil, sorulan soruya bağlı olarak çeşitli efektör ve hedef hücreler kullanılabildiğinden, önemli ölçüde esnekliğe sahiptir. Örneğin, efektör hücre özgüllüğü, farklı hedef hücreler kullanılarak belirlenebilir veya efektör hücre öldürme mekanizması, spesifik proteinlerde eksik olan hücreler kullanılarak veya proteine özgü inhibitörler kullanılarak belirlenebilir. 51Cr salım testi ile ilgili önemli bir sorun, hedef hücreler tarafından yüksek spontan salım oranları potansiyelidir. Tek başına kül...

hücre Ölümü testi: sitotoksik yeteneğin krom salınım testi

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

Kaynak: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3 ve Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Mikrobiyoloji, İmmünoloji ve Kanser Biyolojisi Yüksek Lisans Programı, Minnesota Üniversitesi, Minneapolis, MN 55455 
2 İmmünoloji Merkezi, Minnesota Üniversitesi, Minneapolis, MN 55455 
3 Minnesota Üniversitesi, Üroloji Anabilim Dalı, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonik Kanser Merkezi, Minnesota Üniversitesi, Minneapolis, MN 55455
Bağışıklık sistemi hücrelerinin temel işlevlerinden biri, virüslerle enfekte olmuş veya bir tümör hücresine dönüşüm geçirmiş hedef hücreleri uzaklaştırmaktır. Bağışıklık hücrelerinin sitotoksik kapasitesini ölçmek için in vitro deneyler, uzun yıllardır laboratuvarlarda temel bir unsur olmuştur. Bu tahliller, T hücrelerinin, NK hücrelerinin veya başka herhangi bir bağışıklık hücresinin hedef hücreleri antijene özgü veya spesifik olmayan bir şekilde öldürme yeteneğini belirlemek için kullanılmıştır. Efektör hücreler tarafından eksprese edilen ölüm ligandları (ör., Fas ligandı veya TRAIL), sitokinler (ör.IFNg veya TNF) veya sitotoksik granüller (ör., perforin/granzim B), hedef hücre ölümünün indüklenebileceği bazı yollardır. Son yıllarda tümör immünoterapi araştırmalarındaki patlamayla birlikte, hasta sonuçlarını iyileştirmek için bağışıklık hücrelerinin sitotoksik aktivitesini artıracak ajanların bulunmasına artan bir ilgi vardır. Tersine, bazı hastalıklar, bağışıklık hücresi sitotoksik aktivitesinin aşırı coşkulu aktivitesi ile işaretlenir ve bu da bu yanıtları yumuşatmak için ajanları tanımlama çabalarına neden olur. Bu nedenle, kullanıcının herhangi bir sayıda farklı efektör hücreyi, hedef hücreleri ve/veya yanıt değiştiricileri deneysel tasarıma kolayca entegre edebileceği bir tahlilin olması, efektör hücrelerin sitotoksik kapasitesini ve/veya hedef hücrenin yanıt verebilirliğini hızlı bir şekilde değerlendirmek için değerli bir araç olarak hizmet edebilir. 
Bu in vitro tahliller, farklı hücre popülasyonlarının karıştırılmasının yanı sıra nispeten düşük sayıda hem efektör hem de hedef hücre kullanmayı içerir. Bu nedenle, tahlilin bir gerekliliği, hedef hücreleri kolayca tespit edilebilecek ve nicelleştirilebilecek bir şekilde etiketlemektir, bu da kullanıcının daha sonra efektör hücrelerin aracılık ettiği 'yüzde spesifik lizi' belirlemesine olanak tanır. Radyoaktivite - özellikle, Na251CrO4 formundaki krom 51 (51Cr), hedef hücrelerdeki hücresel proteinleri hızlı ve spesifik olmayan bir şekilde etiketlemenin ucuz bir yoludur (1). Kısa etiketleme ve toplam tahlil süreleri, hedef hücrelerin sayısında ve/veya fenotipinde testin sonucunu etkileyebilecek önemli değişiklikler potansiyelini azaltır. Efektör hücrelerin sitotoksik aktivitesinin bir sonucu olarak hedef hücrelerin membran bütünlüğünün kaybolması üzerine, hedef hücreler içindeki 51Cr işaretli hücresel proteinler, kültür süpernatanına salınır ve kantitasyon için uygun hale gelir. Bağışıklık hücrelerinin in vitro işlevini inceleyen herhangi bir tahlilde olduğu gibi, deneyin performansını iyileştirmeyi düşünmeniz gereken bir dizi önemli husus vardır. En kritik özelliklerden biri, sağlıklı efektör (maksimum sitotoksik aktivite için) ve hedef (maksimum yanıt verme ve minimal spontan ölüm için / 51Cr salınımı için) hücrelerin kullanılmasıdır. Efektör ve hedef hücre teması gereklidir (hücre-hücre temasını teşvik etmek için yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakaların yaygın kullanımına yol açar) (2). Son olarak, veri analizi, pozitif ve negatif kontrol hedef hücre popülasyonlarının dahil edilmesine bağlıdır. 
Aşağıdaki protokol, bir efektör hücre popülasyonunun sitotoksik yeteneğini ölçmek için standart bir 51Cr salım testi gerçekleştirme adımlarını ana hatlarıyla belirtecektir, ancak yakın zamanda Europium kullanan radyoaktif olmayan bir versiyon geliştirilmiştir. 51Cr güçlü bir γ radyasyonu yayıcıdır. Sonuç olarak, bu tahlilin kullanımı, uygun radyasyon güvenliği eğitimi, özel laboratuvar alanı, bir gama sayacı ve radyoaktif numunelerin atılmasını gerektirir. 
Bu tahlildeki genel olay sırası şunlardır: 1) 51Cr etiketli hedefler hazırlayın; 2) efektör hücreleri hazırlayın ve hedef hücreler etiketlenirken plakaya ekleyin; 3) etiketli hedefleri plakaya ekleyin; 4) inkübe plakası; 5) süper natanları hasat edin; ve 6) numuneleri sayaç üzerinde çalıştırdıktan sonra verileri analiz edin. Numuneler genellikle üç nüsha halinde hazırlanır ve daha sonra pipetleme ile ilgili küçük farkları hesaba katmak için ortalaması alınır. 
Bu test için uygun KKD önemlidir. Özellikle, kullanıcı bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giymelidir. Laboratuvar veya kuruma bağlı olarak koruyucu gözlük gerekebilir. Tüm adımlar sırasında 51Cr'nin güvenli bir şekilde saklanması ve kullanılması için yeterli kurşun koruması olmalıdır. Son olarak, 51Cr içeren numunelerin nerede tutulduğunu gösteren tüm uygun işaretler ve olası kontaminasyon için alanı araştırmak için gama probu ile donatılmış bir Geiger sayacı dahil olmak üzere 51Cr kullanmak için ayrılmış özel laboratuvar alanı ve ekipman olmalıdır. 
Bu laboratuvar çalışmasında, insan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler), (CpG ile uyarılmış ve uyarılmamış) melanom hücrelerini öldürme yeteneğini, model olarak insan melanom hücre hattı WM793'ü ve krom salınım testini kullanarak belirleyeceğiz.

Bu örnekte, CpG ile uyarılan efektör hücreler (Şekil 1, siyah daireler), efektör hücrelerin hedef hücrelere oranı arttıkça hedef hücreleri daha etkili bir şekilde öldürdü. Bu artış, uyarılmamış PBMC'lerde (beyaz daireler) gözlenmedi, bu da hedef hücre lizizinde gözlenen artış için CpG stimülasyonunun gerekli olduğunu gösteriyor. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10505/10505fig1.jpg"><b...

Hücre Ölümü Testi: Sitotoksik Yeteneğin Krom Salınım Testi

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Bu videoda, krom salınım testinin nasıl gerçekleştirileceğini gözlemleyecek ve efektör hücrelerin sitotoksik potansiyelinin nasıl belirleneceğini göreceksiniz. Bağışıklık hücreleri, bağışıklık tepkisinin ayrılmaz bir parçası olan kanser veya virüsle enfekte olmuş hücreler gibi potansiyel olarak zararlı hücrelerin vücuttan tanımlanmasından ve uzaklaştırılmasından sorumludur. T hücreleri ve NK hücreleri gibi çeşitli bağışıklık hücreleri, hedef hücreleri tanımlama ve bu hedef hücrelerin protein bozulmasına, parçalanmasına ve ölümüne neden olan proteinleri salgılama yeteneği olan sitotoksik potansiyel olarak bilinen bir özelliğe sahiptir. Sitotoksik potansiyelin ölçülmesi, bağışıklık hücresi aktivasyonunu ve gücünü ölçmek için kritik öneme sahiptir ve krom salınım testi bu amaç için yaygın olarak kullanılır. Bu yöntem, kullanıcıların farklı koşullar altında belirli bağışıklık hücresi türleri tarafından indüklenen sitoksisiteyi karşılaştırmasını sağlar, bu da kanser immünoterapisi ve bağışıklıkla ilgili hastalıkları incelemek için değerlidir. Başlamak için, hedef hücreler, kanser hücreleri gibi, hücreler tarafından alınan radyoaktif bir izotop olan krom 51 ile inkübe edilir. Daha sonra, bu radyo etiketli hücreler, iki hücre tipi arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak için yuvarlak tabanlı, 96 oyuklu bir plaka içinde, efektör hücreler olarak da adlandırılan izole edilmiş bağışıklık hücreleri ile birlikte kültürlenir. Testin genel kurulumu, uygun kontrollerle birlikte farklı bağışıklık hücresi konsantrasyonları ile belirli sayıda hedef hücrenin inkübe edilmesini içerir. Ko-kültür, efektör hücrelerin hedef hücrelerde apoptoz ve lizisi indüklemesine izin verir, bu da hücre içi krom 51'in süpernatana salınmasına neden olur. Daha sonra, önceden optimize edilmiş bir zaman noktasında, salınan kromu içeren süpernatant tüm kuyucuklardan hasat edilir. Radyoaktif olan krom 51, gama radyasyonu yaymak için kendiliğinden radyoaktif bozunmaya uğrar. Tahlil plakasındaki tüm kuyucuklardan gelen süpernatantlardaki gama radyasyon seviyeleri, hedef hücrelerin parçalanmasının ölçülebilir bir çıktısını temsil eder. Bu, daha sonra bağışıklık hücrelerinin sitotoksik potansiyelini belirlemek için kullanılan bir gama sayacı kullanılarak ölçülür. Başlamak için, hedef hücreler, bu örnekte insan melanom hücre hattı WM793, tek hücreli bir süspansiyon halinde hazırlanır. Bunu yapmak için, önce ortamı doku kültürü şişesinden çıkarın ve hücreleri beş mililitre 1X PBS ile yıkayın. PBS'yi boşaltın ve ardından yaklaşık iki dakika boyunca plakaya bir mililitre tripsin ekleyin. Şişenin yüzeyindeki hücreleri gevşetmek için şişeye hafifçe vurun ve ardından şişeye beş mililitre RPMI ortamı ekleyin. Hücreleri toplamak için ortamı yukarı ve aşağı pipetleyin ve bu süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe ekleyin. Tüpü 1200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüje yerleştirin. Sonraki, hücre peletini bozmamaya dikkat ederek ortamı tüpten çıkarın. Hücre peletini bozmak için tüpün altını hafifçe vurun ve tüpe 10 mililitre ortam ekleyin. Ardından, hücreleri süspansiyon haline getirmek için ortamı nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin ve orijinal hücre süspansiyonunun iki mililitresini yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Tüpü bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri beş dakika boyunca 12 yüz RPM'de peletleyin. Santrifüjlemeden sonra, fazla ortamı tüpten bir atık kabına dökün. Hücre peletini geride kalan küçük hacimdeki ortamda yeniden süspanse etmek için tüpü kısaca girdaplayın. Ardından, bu özel radyoaktivite için ayrılmış bir laboratuvar alanına geçerek Chromium 51'i kullanmaya hazırlanın. Tüm adımlar sırasında Chromium 51'in güvenli bir şekilde saklanması ve kullanılması için yeterli kurşun korumanın yanı sıra Chromium 51 içeren numunelerin nerede tutulduğunu gösteren uygun işaretler bulunmalıdır. Olası kontaminasyon için alanda hizmet vermek için gözleme probu ile donatılmış bir Geiger sayacı da gereklidir. Radyoaktivitenin uygun kullanımı için ayarlandıktan sonra, doğrudan hedef hücre süspansiyonuna 100 mikroküri Krom 51 ekleyin. Ardından, numunenin ve tüpün artık radyoaktif olduğunu belirtmek için tüpe küçük bir parça radyoaktif bant ekleyin. Tüpü kurşun kalkanlı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve tüpü her 15 ila 20 dakikada bir fiske vurarak bir saat inkübe edin. Hedef hücreler etiketlenirken, efektör hücrelerin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlayın. Bu örnekte, insan periferik kan mono nükleer hücreleri veya PDMC'ler, standart yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile 5 kez 10 ila 6'lık bir konsantrasyona kadar tam kandan izole edildi. Bu efektör hücre süspansiyonunu tek kullanımlık bir reaktif rezervuarına aktarın ve ardından bu süspansiyondan 200 mikrolitreyi 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakada B sırasının her bir oyuğuna ekleyin. Daha sonra, plakanın C'den G'ye kadar olan satırındaki her bir oyuğa 100 mikrolitre RPMI ekleyin. Şimdi, önce B satırındaki kuyucuklardaki hücrelerin 100 mikrolitresini çıkararak ve bunu C satırına ekleyerek, bir dizi efektör hücre numarasına sahip olmak için PBMC'lerin seri seyreltmelerini gerçekleştirmeye başlayın. Ardından, 100 mikrolitre hücreyi C satırından D satırına aktararak efektör hücreleri daha da seyreltin. Seri seyreltmeye devam edin. G sırasına ulaşıldığında, o sıradaki her bir kuyucukta 100 mikrolitrelik bir son hacim bırakmak için kuyulardan 100 mikrolitre hareket ettirin. Daha sonra, Krom 51'in hedef hücrelerden kendiliğinden salınması için bir kontrol görevi görmek üzere A sırasındaki kuyucuklara 100 mikrolitre doku kültürü ortamı ekleyin, çünkü bu sıraya hiçbir efektör hücre eklenmemelidir. Ardından, hedef hücreler eklenmeye hazır olana kadar 37 santigrat derecelik bir inkübatöre bir plaka yerleştirin. Kuluçka süresinden sonra, hedef hücreleri inkübatörden çıkarın ve fazla Chromium 51'i çıkarmak için 5 mililitre FBS ile yıkayın. Ardından, tüpü belirlenmiş bir santrifüje yerleştirin ve 5 dakika boyunca 1200 rpm'de döndürün. Radyoaktif FBS yıkamasını uygun bir atık kabına çıkarın ve peleti taze 5 mililitre FBS içinde yeniden süspanse ederek yıkama adımını tekrarlayın. Tüpü belirlenmiş bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri 5 dakika boyunca 1200 rpm'de tekrar döndürün. İkinci yıkamayı çıkarın ve bir Geiger sayacı kullanarak peletin dahil radyoaktivite olup olmadığını kontrol edin. Son olarak, peleti 10 mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin ve Chromium 51 etiketli, hedef hücre süspansiyonunu tek kullanımlık bir reaktif rezervuarına dökün. Ardından, bu etiketli hedef hücrelerden 100 mikrolitreyi 96 oyuklu efektör hücre plakasının her bir oyuğuna ekleyin. Daha sonra, her sıradaki tüm hedef hücreleri parçalamak için H sırasındaki kuyucuklara 100 mikrolitre% 1 NP-40 su ekleyin. Bu kuyular, dakika başına toplam sayımları veya cpm'yi belirlemek için bir kontrol olarak kullanılacaktır. Artık plaka hazırlandığına göre, plakanın her iki tarafına küçük bir parça bant ekleyerek kapağı sabitleyin ve krom 51 içerdiğini belirtmek için kapağın üzerine bir parça radyoaktif bant yerleştirin. Ardından, plakayı radyoaktif numuneleri işlemek için işaretlenmiş bir santrifüje yerleştirin. Yalnızca bir deney plakası kullanılıyorsa, santrifüje bir denge plakası ekleyin. Santrifüjü 1200 rpm'ye ayarlayın ve plakayı hızlandırın. Hıza ulaştığınızda makineyi durdurun. Plakayı santrifüjden çıkarın. Ardından, ek güvenlik için plakayı 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin ve plakanın üzerinde küçük bir kurşun koruma parçası bulun. Hedef hücrelerin parçalanmasına izin vermek için 16 saat inkübe edin. Kuluçka süresinin sonunda, plakanın kenarındaki bandı dikkatlice çıkarın ve kapağı çıkarın. Ardından, pamuk tapalarının her biri için küçük filtre disklerinin yerinde olduğundan emin olarak hasat çerçevesini plakaya yerleştirin. Şimdi, pamuk tapalarını yavaşça ve nazikçe kuyucuklara bastırın. Yaklaşık on saniye sonra, pamuk tapaları üzerindeki basıncı boşaltın ve ardından pamuk tapaları tüp şeritlerine aktarın. Bu tüplerin her birini ikincil bir FACS tüpüne yerleştirin. Son olarak, FACS tüplerini bir gama sayacına yükleyin ve her koşulda salınan krom 51 miktarını ölçmek için numuneleri çalıştırın. Tüplerin tezgaha yüklenme sırasını dikkatlice kaydedin. Burada, uyarılmamış PBMC'ler ilk 3 şeride eklendi ve CPG ile uyarılmış PMBC'ler 4 ila 6 numaralı şeritlere eklendi. Bu örnekte, dakikadaki sayımlar, numunelerin orijinal plakaya yerleştirildiği şekilde bir elektronik tablonun hücrelerine girildi ve üçlülerin ortalamaları hesaplandı. Örneğin, ilk koşul için, A1, A2 ve A3 hücrelerinin I3 hücresinde ortalaması alındı. Ortalamalar belirlendikten sonra, her bir koşul için spesifik lizis yüzdesi bu formül kullanılarak hesaplanabilir. Örneğin, hedef hücrelere 50'ye 1 efektör hücre oranına sahip olan uyarılmamış hücreler için spesifik lizis yüzdesini hesaplamak için, bu örnekte 1164.67 olan spontan CPM, deneysel CPM, 1129'dan çıkarıldı. 67. Bu sayı daha sonra maksimum BGBM ile spontan BGBM arasındaki farka bölünebilir ve ardından yüzde spesifik lizisi vermek için 100 ile çarpılabilir. Bu daha sonra her koşul için hesaplanır. Bu veriler daha sonra hem uyarılmamış PBMC'ler hem de CPG ile uyarılmış PBMC'ler için E-T oranının yüzde spesifik lizis ile karşılaştırılmasını göstermek için grafiklendirilebilir. Bu örnekte, CPG ile uyarılan efektör hücreler, efektör hücrelerin hedef hücrelere oranı arttıkça hedef hücreleri daha etkili bir şekilde öldürdü. Bu artış, uyarılmamış PBMC'lerde gözlenmedi, bu da hedef hücre lizizinde gözlenen artış için CPG stimülasyonunun gerekli olduğunu gösteriyor.

assay-for-cell-death-chromium-release-assay-of-cytotoxic-ability

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

İleri Biyoloji

Immunology

İmmünoloji

chromium release assay for immune cell killing

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells.

This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant and can be measured.

Researchers use this setup to study antigen-specific and nonspecific killing. It is also useful in tumor immunotherapy research, where scientists may look for agents that boost immune cell killing. In other cases, the assay can help test ways to reduce overly strong immune cytotoxic activity.

Several practical points matter for a good result. Healthy effector cells give stronger killing, and healthy target cells help keep spontaneous death and background chromium release low. Because cell-to-cell contact is needed, round-bottom 96-well plates are often used. Proper data analysis also requires positive and negative control target cell groups.

The standard protocol includes preparing 51Cr-labeled targets, preparing effector cells, adding both cell groups to the plate, incubating, harvesting supernatants, and then analyzing the samples on a counter. Samples are often run in triplicate and averaged to reduce the effect of small pipetting differences. A nonradioactive Europium-based version is also available.

Because 51Cr is a powerful gamma radiation emitter, the assay requires radiation safety training, dedicated lab space, a gamma counter, and proper waste disposal. Users should wear a lab coat and gloves, and safety glasses may also be required. Lead shielding, clear signage, and a Geiger counter with a gamma probe are important for safe handling and contamination checks. In this lab exercise, human peripheral blood mononuclear cells, or PBMCs, are tested as CpG-stimulated or unstimulated effector cells against WM793 human melanoma cells.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

chromium-release-assay-for-immune-cell-killing

flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting (facs): isolation of splenic b lymphocytes

flow-cytometry-fluorescence-activated-cell-sorting-facs-isolation

Sorting B Cells from Spleen with FACS

Flow cytometry and FACS can be used to separate B lymphocytes from a mixed spleen cell sample. The immune system protects the body from infectious organisms and other invaders. White blood cells, also called leukocytes, are the main cells involved in this defense. Leukocytes can be grouped into subpopulations such as myeloid cells, lymphocytes, and dendritic cells. These groups can be distinguished by biological, physical, and functional features. Cell size, granularity, and secretion are...

magnetic activated cell sorting (macs): isolation of thymic t lymphocytes

magnetic-activated-cell-sorting-macs-isolation-of-thymic-t-lymphocytes

Enriching Thymic T Cells with Magnetic Sorting

Thymic T cell enrichment with magnetic sorting helps isolate a targeted immune cell group from a mixed sample. The immune system relies on many cell types, and lymphocytes are a major part of adaptive immunity. B cells usually respond to extracellular infections, such as bacterial infections, while T cells usually respond to intracellular infections, such as viral infections. Magnetic sorting enriches selected cells by using magnetic beads and antibodies against cell surface proteins. First,...

elisa assays: indirect, sandwich, and competitive

elisa-assays-indirect-sandwich-and-competitive

ELISA Methods for Detecting Antigens

ELISA methods detect antigens, antibodies, proteins, hormones, peptides, and other biomolecules in biological samples. Enzyme-linked immunosorbent assay is highly sensitive because it can detect very low antigen levels. It works by using an antigen-antibody interaction, then an enzyme-linked antibody turns a colorless substrate into a colored or fluorescent signal that a plate reader can measure. Different ELISA formats are used for different sample types and antibody setups. Indirect ELISA is...

elispot assay: detection of ifn-&#947; secreting splenocytes

elispot-assay-detection-of-ifn-secreting-splenocytes

ELISPOT Assay for Single-Cell Immune Detection

ELISPOT is a sensitive assay for detecting immune cells that release a specific protein. It is based on an ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, but it shows single-cell responses as visible spots. The method was first described in 1983 by Czerkinsky to count B cell hybridomas that produce antigen-specific immunoglobulins. The assay was later adapted to measure cytokine-producing T lymphocytes. Because of that, ELISPOT is now a gold standard for measuring antigen-specific T cell...

immunohistochemistry and immunocytochemistry: tissue imaging via light microscopy

immunohistochemistry-immunocytochemistry-tissue-imaging-via-light

Antibody Staining of Tissue and Cells

Antibody staining of tissue and cells lets scientists see where a specific antigen is located. Immunohistochemistry, or IHC, uses thin tissue sections. Immunocytochemistry, or ICC, uses isolated cells or cells grown in culture. Both methods rely on antibodies that carry a chemical or fluorescent tag, such as peroxidase or rhodamine, so the target antigen can be detected under a light microscope. IHC keeps the structure of the whole tissue in place while the sample is stained. That makes it...

antibody generation: producing monoclonal antibodies using hybridomas

antibody-generation-producing-monoclonal-antibodies-using-hybridomas

Hybridoma Cell Culture for Monoclonal Antibodies

Hybridoma cell culture is used to produce monoclonal antibodies, or mAbs, with a known antigen specificity. Monoclonal antibodies come from a single clone of cells, so they recognize one target more precisely than polyclonal antibodies, which are a mixed group of antibodies against different antigenic determinants. That difference matters when similar molecules share epitopes, or antigen sites, that can confuse an antibody test. Polyclonal antisera can react with more than one related antigen.

immunofluorescence microscopy: immunofluorescence staining of paraffin-embedded tissue sections

immunofluorescence-microscopy-immunofluorescence-staining-paraffin

Fluorescent Antibody Staining of Tissue Slides

Fluorescent antibody staining lets scientists see specific proteins in thin tissue sections on glass slides. It is used to study normal tissue structure and to better understand how disease works. In many cases, the tissue comes from patient biopsies or from experimental in vivo models. The tissue is usually fixed in formalin or paraformaldehyde and embedded in paraffin wax before it is cut. This preservation method supports long-term storage and makes sectioning possible. A microtome is used...

confocal fluorescence microscopy: a technique to determine the localization of proteins in mouse fibroblasts

confocal-fluorescence-microscopy-technique-to-determine-localization

Confocal Microscopy for Protein Localization

Confocal fluorescence microscopy is used to show where proteins are located inside cells with better detail than wide-field epifluorescence microscopy. It improves image clarity by scanning the sample with lasers and using a pinhole to block out-of-focus light. This makes it easier to see whether a signal comes from the cell surface or from inside the cell. The method relies on fluorescence, which happens when a molecule absorbs light and then gives off a new photon. A fluorophore is a...

immunoprecipitation-based techniques: purification of endogenous proteins using agarose beads

immunoprecipitation-based-techniques-purification-endogenous-proteins

Protein Pull-Down with Antibodies and Beads

Immunoprecipitation uses antibodies and Protein A/G agarose beads to isolate a specific protein from a cell lysate. It is also called a pull-down assay. The term "immuno" refers to the antibody, and "precipitation" means pulling a substance out of solution. The target protein can be endogenous or recombinant. Recombinant proteins often carry epitope tags such as myc or flag, which makes purification easier because antibodies against these tags are usually strong and effective. Antibodies...

cell cycle analysis: assessing cd4 and cd8 t cell proliferation after stimulation using cfse staining and flow cytometry

cell-cycle-analysis-assessing-cd4-cd8-t-cell-proliferation-after

Tracking T Cell Division with CFSE and Flow Cytometry

Tracking T cell division with CFSE and flow cytometry shows how immune cells respond after stimulation. The cell cycle is a normal process of life. During it, a cell changes step by step and divides into two daughter cells. This happens throughout life when the body needs new cells for growth and repair. Cells that are not cycling are in the G0 phase, which means they are quiet. Once a cell enters the cycle, it moves through G1, S, G2, and M phases. G1 is a checkpoint for the resources needed...

adoptive cell transfer: introducing donor mouse splenocytes to a host mouse and assessing success via facs

adoptive-cell-transfer-introducing-donor-mouse-splenocytes-to-host

Tracking Transferred Mouse Splenocytes by FACS

Adoptive cell transfer is a method for moving cells into a host animal to study biology or help treat disease. Researchers can use it to follow cell movement and distribution, or to test how transferred cells behave in a mouse model. Tracking systems such as cell surface markers and CFSE staining can help show where the cells go after transfer. This approach has several uses in mouse studies. It can support cancer research by transferring specific cell populations as an experimental treatment...

assay for cell death: chromium release assay of cytotoxic ability

The chromium release assay measures how well immune cells kill target cells in the lab. It is used to test the cytotoxic ability of T cells, NK cells, and other effector cells against infected cells or tumor cells. This assay works by labeling target cells with chromium-51, a radioactive tracer called Na2 51CrO4. The label quickly marks cellular proteins inside the target cells. When effector cells damage the target-cell membrane, the labeled proteins are released into the culture supernatant...

immunology

Bu koleksiyon, bağışıklık hücrelerinin etiketlenmesi ve sınıflandırılması da dahil olmak üzere immünoloji laboratuvarlarında kullanılan birçok temel tekniğini kapsar. Ayrıca, bağışıklık hücreleri ve antikorlar için proliferasyon yöntemlerinin yanı sıra ELISA da dahil olmak üzere bağışıklık aktivitesi konusundaki yaygın testleri içerir. Son olarak, immün doku ve hücre örneklerinin boyanmasını ve görüntülenmesini anlatır.

Measure immune cell killing with the chromium release assay. Learn how 51Cr-labeled target cells, PBMCs, and melanoma cells are used to assess cytotoxicity.

Chromium Release Assay for Immune Cell Killing

Description

Transcript

Tags