Mikotoksin Algılama ELIME (Enzim İmmüno Manyetik Elektrokimyasal Bağlantılı) Yöntem

Summary

Trichothecenes (insan sağlığı için endişe mikotoksinler) rekabetçi bir immünokimyasal yöntemi ve bir final elektrokimyasal algılama dayalı yeni geliştirilen bir tarama yöntemi kullanılarak tespit etmek için bir protokol olduğunu göstermiştir.

Abstract

Immunoassay daha pahalı ve zaman alıcı kantitatif HPLC veya GC ^{1 2 yöntem,} gıda malları tehlikeli mikotoksinler tarama algılama için geçerli bir alternatif. Bu protokolde algılama platformu olarak immünokimyasal zinciri ³ ve serigrafi elektrotlar için sağlam bir destek olarak manyetik boncuk kullanımı dayalı bağlantılı immunomagnetic tahlil imal ve rekabetçi bir elektrokimyasal Enzim sorguya nasıl göstermektedir.

Bizim yöntemi HT-2 ve T-2 toksinleri trichothecenes aile ve insan sağlığı ⁴ için büyük bir endişe ait toplam tutarı, mikotoksinler belirlenmesi amaçlanmıştır. % 100 HT-2 ve T-2 doğru bir çapraz reaksiyon ile bir antikor klon benzer hassasiyet ⁵ ile aynı anda iki toksinler tespit etmek için sağlar .

Testinin ilk adım, biz yüzey üzerinde manyetik boncuk HT2-KLH konjuge toksin hareketsiz kaplama adımdır. Immobilize HT-2 ve HT-2 ya da T-2 örnek ücretsiz mevcut veya standart bir çözüm çözünmüş arasındaki rekabet, non-spesifik emme önlemek için gerekli engelleyici bir adım sonra, monoklonal antikor Ayrıca sağlar.

Rekabet adım sonunda, monoklonal antikor miktarı ile bağlantılı HT-2 örnek çözüm toksin miktarı ile ters orantılı olacaktır immobilize.

Alkalen fosfataz (AP) ile etiketlenmiş ikincil bir antikor spesifik antikor ve hareketsiz HT-2 arasındaki bağlayıcı ortaya çıkarmak için kullanılır. Son ölçüm adım ekran baskılı bir çalışma elektrot yüzeyinde belirli bir örnek / standart bir çözüm karşılık, manyetik boncuk süspansiyonu bir kısım bırakarak yapılır; altında tam olarak yerleştirilen bir mıknatıs sayesinde manyetik boncuk immobilize ve konsantre ekran basılmış elektrot. Manyetik boncuk ve AP için bir substrat arasında kuluçka iki dakika sonra, enzimatik ürün birkaç saniye bir süre içinde otomatik olarak sekiz ölçümler başlatmak için ayrıca taşınabilir bir enstrüman (PalmSens) kullanarak Diferansiyel Puls Voltametri (DPV) tarafından algılanır.

Protocol

1) Engelleme kaplı Manyetik Boncuk:

Kaplı Manyetik boncuk engellemek için takip devam edin:

1. 2 ml Eppendorf tüpleri bir dizi hazırlamak;
2. (Vorteks sıkıyorlar ama) örnek dönen mikser ile kaplı manyetik bilye (kaplı manyetik boncuk hazırlanması için eke bakınız) homojenize
3. Homojenizasyon hemen sonra, her biri ayrı Eppendorf tüp içine kaplı manyetik bilye pipet 10 ul;
4. Kümesinin her Eppendorf tüp içine çözümü engelleme yağsız süt 1 ml ekleyin;
5. Dönen örnek karıştırıcı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe manyetik boncuk edelim;
6. Çözümü engelleme kaldır: 2 dk (tüp lateral duvara yapışan manyet....

Discussion

Biyomoleküler tanıma prob olarak antikorların kullanımı yaygın bir algılama teknolojileri kullanımı gördü; ELISA'larla ve MEIAs immünokimyasal algılama yöntemleri, en çok kullanılan ve uygulanan birçok laboratuvarda ⁷ platformlar arasında, günümüzde,.

Bu yaklaşımların son yıllarda olağanüstü bir duyarlılık ve özgüllük, birçok araştırma grubu birincil hedefi elde ederken, kendi performansları ve iyileştirme ve optimizasyon olmuştur.

Bu protokolde mi.......

Materials

Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Potasyum klorür	Sigma	P9333
Potasyum dihidrojen fosfat	Sigma	P9791
Disodyum hidrojen fosfat	Sigma	S3264
Sodyum klorür	Sigma	S3014
MgCl 2 susuz	Sigma	M8266
DEA (% 99.5)	Sigma	31589
HCl 37%	Sigma	320331
H 3 BO 3	Sigma	B6768
Tris [hidroksimetil] aminomethane	Sigma	252859
BSA (sığır serum albumin)	Sigma	A4503
NaOH	Sigma	S5881
TWEEN 20	Sigma	P9416
NaN 3	Aldrich	71290
1-naftil fosfat disodyum tuzu	Fluka	N7255
Yağsız süt engelleme çözümü olmayan yağlı süt kuru maddesi	Bio-Rad	170-6404
KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok solüsyonu (PBS 1 mg / ml) ile HT-2 konjuge:	Biopure	004050	HT-2-KLH konjugatı HT-2 toksin pozisyon 3 ve 4 serbest OH grupları N, N'-carbonyldiimidazole (CDI) ve aktif HT-2 toksin tarafından aktive edilmiştir CDI yöntemi ile elde edildi protein (KLH) aminogroups ile istikrarlı bir carbammate bağ oluşturmak için tepki sağlar.
İkincil etiketli antikor atı anti-fare IgG (H + L) ile konjuge Alkalen Fosfataz, konsantrasyonu 1 mg / ml.	Vektör Laboratuvarları	AP-2000
HT-2 toksin	Biopure
Manyetik boncuk: Dynabeads ®	Dynal	M-280 Tosylactivated	Konsantrasyon 2 x 10 9 boncuk / ml.

Reaktifin Adı	Hazırlık	Yorumlar (isteğe bağlı)
Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4	900 ml su, 0.20 g, potasyum klorür, potasyum dihidrojen fosfat 0.20 g, 1.16 g disodyum hidrojen fosfat ve 8.00 g sodyum klorür çözülür
Diethanolamine tampon, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH 9.8	MgCl 2 susuz ve su ~ 300 ml KCl 7.3.59 g 0.0476g çözülür. Dağılmasından sonra 51 ml (% 99.5), DEA ekleyin. HCl (6 M) ile pH 9,8 'e ayarlayın. 500 ml su ile seyreltilir.
Borat tamponu, 0.1 M, pH 9.5	3.09 g H 3 BO 3 ~ 300 ml distile su içinde çözülür, NaOH ve / veya HCl (6 M veya düşük konsantrasyonlarda) ile 9.5 pH ayarlamak. 500 ml saf su ile seyreltilir.
TRIS tampon, 0.2 M, pH 8.5	3.85 g Tris [hidroksimetil] 100 ml su-aminomethane çözülür. NaOH ve / veya HCl (6 M veya düşük konsantrasyonlarda) ile pH 8.5 'e ayarlayın. 200 ml su ile seyreltilir.
TRIS tamponu + BSA solüsyonu (% 0.1), pH 8.4	TRIS tampon pH 8,4 50 ml BSA 0.050 g eritin.	Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır.
PBS + TWEEN ® 0.05%	Önceden hazırlanmış PBS, pH 7.4 500 ml 0.250 g TWEEN 20 çözülür
PBS + BSA çözüm% 0.1	PBS, pH 7,3 - 50 ml BSA 0.050 g eritin.	Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır.
PBS + BSA% 0.1 + NaN 3 0.02%	PBS, pH 7,3 - 50 ml BSA g 0.050 ve 0.010 NaN 3, eritin .	Depolama solution
Enzimatik substrat	DEA tampon pH 9.8 100 ml, 0.010 g 1-naftil fosfat sodyum tuzu eritin. Sıkı şişeyi alüminyum folyo ile sarın.	Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır.
Yağsız süt bloke çözüm	Sınıf Engelleyicisi Non-Fat Kuru Süt (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) Blot PBS pH 7.3 200 ml 0,20 g ekleyin.	Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır.
HT-2 stok solüsyonu	10 ml vermek asetonitril, trikotesen HT-2 toksin flakon 10 mg çözülür 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ile bir çözüm.	30 ml tek kullanımlık alikotları bu çözüm Split ve -30 ° C'den daha az saklayın
HT-2 standart çözüm Çalışma	Pipet 20 ml HT-2 toksin stok solüsyonu 2 ml ölçülü balona kalibre ve 10 mg / trikotesenler toksin ml içeren bir HT-2 çözüm elde etmek için asetonitril ile seyreltilmiş.	Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmalıdır.
HT-2 Çalışma kalibrant çözümler	Kalibrant çözeltisi 100 ng / ml hazırlamak için HT-2 standart solüsyonu (10 mg / ml) sulandırınız. Sulandırınız HT-2 kalibrant çözeltisi çalışan 100 ng / ml aşağıdaki konsantrasyonları 0 (boş), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml kalibratörü çözümler çalışmaya hazırlamak için.	Bu çözümler, kullanım gün taze olarak hazırlanması gerekir.
HT-2 KLH ile konjuge	350 ul tek kullanımlık alikotları KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok solüsyonu (PBS 1 mg / ml) ile HT-2 konjuge Böl.	-30 ° C'de saklayın alikot
Spesifik Monoklonal Antikor	Rekabet adımda kullanmak için PBS monoklonal antikor stok konsantrasyonu (1,383 mg / ml): 1:350 (v v) sulandırınız	Bu çözüm, kullanım an taze hazırlanmış olmalıdır. Son bir hacim 3,5 ml PBS 10 ml antikor stok solüsyonu, 17 standartları ve / veya numune analiz etmek yeterli değildir.
İkincil Etiketli Antikor	PBS içinde rekabet adımda kullanmak için: Alkalen Fosfataz ile konjuge anti-fare IgG (H + L) 1:100 (v v) seyreltilir.	Son hacim 10 ml PBS 100 ul antikor stok solüsyonu, 25 standartlara ve / veya numune analiz için yeterli. Bu çözüm, kullanım an taze hazırlanmış olmalıdır.

Reaktifin Adı	Şirket	Yorumlar (isteğe bağlı)
Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı: MPC ®-S	Dynal
PalmSens enstrüman	PalmSens	Seri kablo bağlantı PC dizüstü bilgisayar ve Mux seçenekleri yazılım PalmSens Lite, ile birlikte verilen
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Sekiz kanal Mux elektrik kontağı	el yapımı
Sekiz serigrafi elektrotlar (SPES) ile sıyırın	el yapımı
Elektrotlar şerit için özel olarak tasarlanmış destek	el yapımı	SPE her çalışma elektrot yüzeyinin altında yerleştirilmiş, her biri 8 neodim mıknatıslar
Kalibreli mikrolitrelik pipetler	Gilson
Manyetik karıştırıcı ve heyecan bar.
Cam bardak (100, 50, 20 ml).
Volumetrik şişeler (2 ml).
0.2 ve 2 ml Eppendorf tüpleri.	Eppendorf
5ml, 15ml Falcon ™ tüpleri.	Şahin
Laboratuvar Vorteks Karıştırıcı		Proteic parçalarının denatüre önlemek için HT2-KLH ile kaplanmış veya bağlantılı manyetik boncuk immünolojik zinciri ile tekrar süspansiyon vorteks mikser kullanmayın
Laboratuvar fırın veya mostatlı oda		37 ± 3 ° C lik bir sıcaklık tutmak için bir fırın seçin