Trichothecenes (insan sağlığı için endişe mikotoksinler) rekabetçi bir immünokimyasal yöntemi ve bir final elektrokimyasal algılama dayalı yeni geliştirilen bir tarama yöntemi kullanılarak tespit etmek için bir protokol olduğunu göstermiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mikotoksin Algılama ELIME (Enzim İmmüno Manyetik Elektrokimyasal Bağlantılı) Yöntem
Bu makalede
Özet
Özet
Immunoassay daha pahalı ve zaman alıcı kantitatif HPLC veya GC 1 2 yöntem, gıda malları tehlikeli mikotoksinler tarama algılama için geçerli bir alternatif. Bu protokolde algılama platformu olarak immünokimyasal zinciri 3 ve serigrafi elektrotlar için sağlam bir destek olarak manyetik boncuk kullanımı dayalı bağlantılı immunomagnetic tahlil imal ve rekabetçi bir elektrokimyasal Enzim sorguya nasıl göstermektedir.
Bizim yöntemi HT-2 ve T-2 toksinleri trichothecenes aile ve insan sağlığı 4 için büyük bir endişe ait toplam tutarı, mikotoksinler belirlenmesi amaçlanmıştır. % 100 HT-2 ve T-2 doğru bir çapraz reaksiyon ile bir antikor klon benzer hassasiyet 5 ile aynı anda iki toksinler tespit etmek için sağlar .
Testinin ilk adım, biz yüzey üzerinde manyetik boncuk HT2-KLH konjuge toksin hareketsiz kaplama adımdır. Immobilize HT-2 ve HT-2 ya da T-2 örnek ücretsiz mevcut veya standart bir çözüm çözünmüş arasındaki rekabet, non-spesifik emme önlemek için gerekli engelleyici bir adım sonra, monoklonal antikor Ayrıca sağlar.
Rekabet adım sonunda, monoklonal antikor miktarı ile bağlantılı HT-2 örnek çözüm toksin miktarı ile ters orantılı olacaktır immobilize.
Alkalen fosfataz (AP) ile etiketlenmiş ikincil bir antikor spesifik antikor ve hareketsiz HT-2 arasındaki bağlayıcı ortaya çıkarmak için kullanılır. Son ölçüm adım ekran baskılı bir çalışma elektrot yüzeyinde belirli bir örnek / standart bir çözüm karşılık, manyetik boncuk süspansiyonu bir kısım bırakarak yapılır; altında tam olarak yerleştirilen bir mıknatıs sayesinde manyetik boncuk immobilize ve konsantre ekran basılmış elektrot. Manyetik boncuk ve AP için bir substrat arasında kuluçka iki dakika sonra, enzimatik ürün birkaç saniye bir süre içinde otomatik olarak sekiz ölçümler başlatmak için ayrıca taşınabilir bir enstrüman (PalmSens) kullanarak Diferansiyel Puls Voltametri (DPV) tarafından algılanır.
Protokol
1) Engelleme kaplı Manyetik Boncuk:
Kaplı Manyetik boncuk engellemek için takip devam edin:
- 2 ml Eppendorf tüpleri bir dizi hazırlamak;
- (Vorteks sıkıyorlar ama) örnek dönen mikser ile kaplı manyetik bilye (kaplı manyetik boncuk hazırlanması için eke bakınız) homojenize
- Homojenizasyon hemen sonra, her biri ayrı Eppendorf tüp içine kaplı manyetik bilye pipet 10 ul;
- Kümesinin her Eppendorf tüp içine çözümü engelleme yağsız süt 1 ml ekleyin;
- Dönen örnek karıştırıcı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe manyetik boncuk edelim;
- Çözümü engelleme kaldır: 2 dk (tüp lateral duvara yapışan manyet....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biyomoleküler tanıma prob olarak antikorların kullanımı yaygın bir algılama teknolojileri kullanımı gördü; ELISA'larla ve MEIAs immünokimyasal algılama yöntemleri, en çok kullanılan ve uygulanan birçok laboratuvarda 7 platformlar arasında, günümüzde,.
Bu yaklaşımların son yıllarda olağanüstü bir duyarlılık ve özgüllük, birçok araştırma grubu birincil hedefi elde ederken, kendi performansları ve iyileştirme ve optimizasyon olmuştur.
Bu protokolde mi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Yazarlar, işbirliği ve lojistik destek için, Analitik Kimya, Roma Üniversitesi "Tor Vergata" laboratuvar Nancy Downer ve tüm üyelere teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, AB projesi "BioCop" tarafından desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Reaktifler
| Reaktifin Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| Potasyum klorür | Sigma | P9333 | |
| Potasyum dihidrojen fosfat | Sigma | P9791 | |
| Disodyum hidrojen fosfat | Sigma | S3264 | |
| Sodyum klorür | Sigma | S3014 | |
| MgCl 2 susuz | Sigma | M8266 | |
| DEA (% 99.5) | Sigma | 31589 | |
| HCl 37% | Sigma | 320331 | |
| H 3 BO 3 | Sigma | B6768 | |
| Tris [hidroksimetil] aminomethane | Sigma | 252859 | |
| BSA (sığır serum albumin) | Sigma | A4503 | |
| NaOH | Sigma | S5881 | |
| TWEEN 20 | Sigma | P9416 | |
| NaN 3 | Aldrich | 71290 | |
| 1-naftil fosfat disodyum tuzu | Fluka | N7255 | |
| Yağsız süt engelleme çözümü olmayan yağlı süt kuru maddesi | Bio-Rad | 170-6404 | |
| KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok solüsyonu (PBS 1 mg / ml) ile HT-2 konjuge: | Biopure | 004050 | HT-2-KLH konjugatı HT-2 toksin pozisyon 3 ve 4 serbest OH grupları N, N'-carbonyldiimidazole (CDI) ve aktif HT-2 toksin tarafından aktive edilmiştir CDI yöntemi ile elde edildi protein (KLH) aminogroups ile istikrarlı bir carbammate bağ oluşturmak için tepki sağlar. |
| İkincil etiketli antikor atı anti-fare IgG (H + L) ile konjuge Alkalen Fosfataz, konsantrasyonu 1 mg / ml. | Vektör Laboratuvarları | AP-2000 | |
| HT-2 toksin | Biopure | ||
| Manyetik boncuk: Dynabeads ® | Dynal | M-280 Tosylactivated | Konsantrasyon 2 x 10 9 boncuk / ml. |
Çözümler
| Reaktifin Adı | Hazırlık | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 | 900 ml su, 0.20 g, potasyum klorür, potasyum dihidrojen fosfat 0.20 g, 1.16 g disodyum hidrojen fosfat ve 8.00 g sodyum klorür çözülür | |
| Diethanolamine tampon, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 | MgCl 2 susuz ve su ~ 300 ml KCl 7.3.59 g 0.0476g çözülür. Dağılmasından sonra 51 ml (% 99.5), DEA ekleyin. HCl (6 M) ile pH 9,8 'e ayarlayın. 500 ml su ile seyreltilir. | |
| Borat tamponu, 0.1 M, pH 9.5 | 3.09 g H 3 BO 3 ~ 300 ml distile su içinde çözülür, NaOH ve / veya HCl (6 M veya düşük konsantrasyonlarda) ile 9.5 pH ayarlamak. 500 ml saf su ile seyreltilir. | |
| TRIS tampon, 0.2 M, pH 8.5 | 3.85 g Tris [hidroksimetil] 100 ml su-aminomethane çözülür. NaOH ve / veya HCl (6 M veya düşük konsantrasyonlarda) ile pH 8.5 'e ayarlayın. 200 ml su ile seyreltilir. | |
| TRIS tamponu + BSA solüsyonu (% 0.1), pH 8.4 | TRIS tampon pH 8,4 50 ml BSA 0.050 g eritin. | Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. |
| PBS + TWEEN ® 0.05% | Önceden hazırlanmış PBS, pH 7.4 500 ml 0.250 g TWEEN 20 çözülür | |
| PBS + BSA çözüm% 0.1 | PBS, pH 7,3 - 50 ml BSA 0.050 g eritin. | Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. |
| PBS + BSA% 0.1 + NaN 3 0.02% | PBS, pH 7,3 - 50 ml BSA g 0.050 ve 0.010 NaN 3, eritin . | Depolama solution |
| Enzimatik substrat | DEA tampon pH 9.8 100 ml, 0.010 g 1-naftil fosfat sodyum tuzu eritin. Sıkı şişeyi alüminyum folyo ile sarın. | Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. |
| Yağsız süt bloke çözüm | Sınıf Engelleyicisi Non-Fat Kuru Süt (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) Blot PBS pH 7.3 200 ml 0,20 g ekleyin. | Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmış olmalıdır. |
| HT-2 stok solüsyonu | 10 ml vermek asetonitril, trikotesen HT-2 toksin flakon 10 mg çözülür 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ile bir çözüm. | 30 ml tek kullanımlık alikotları bu çözüm Split ve -30 ° C'den daha az saklayın |
| HT-2 standart çözüm Çalışma | Pipet 20 ml HT-2 toksin stok solüsyonu 2 ml ölçülü balona kalibre ve 10 mg / trikotesenler toksin ml içeren bir HT-2 çözüm elde etmek için asetonitril ile seyreltilmiş. | Bu çözüm, kullanım gün taze hazırlanmalıdır. |
| HT-2 Çalışma kalibrant çözümler | Kalibrant çözeltisi 100 ng / ml hazırlamak için HT-2 standart solüsyonu (10 mg / ml) sulandırınız. Sulandırınız HT-2 kalibrant çözeltisi çalışan 100 ng / ml aşağıdaki konsantrasyonları 0 (boş), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng / ml kalibratörü çözümler çalışmaya hazırlamak için. | Bu çözümler, kullanım gün taze olarak hazırlanması gerekir. |
| HT-2 KLH ile konjuge | 350 ul tek kullanımlık alikotları KLH (Keyhole limpet hemosiyanin) stok solüsyonu (PBS 1 mg / ml) ile HT-2 konjuge Böl. | -30 ° C'de saklayın alikot |
| Spesifik Monoklonal Antikor | Rekabet adımda kullanmak için PBS monoklonal antikor stok konsantrasyonu (1,383 mg / ml): 1:350 (v v) sulandırınız | Bu çözüm, kullanım an taze hazırlanmış olmalıdır. Son bir hacim 3,5 ml PBS 10 ml antikor stok solüsyonu, 17 standartları ve / veya numune analiz etmek yeterli değildir. |
| İkincil Etiketli Antikor | PBS içinde rekabet adımda kullanmak için: Alkalen Fosfataz ile konjuge anti-fare IgG (H + L) 1:100 (v v) seyreltilir. | Son hacim 10 ml PBS 100 ul antikor stok solüsyonu, 25 standartlara ve / veya numune analiz için yeterli. Bu çözüm, kullanım an taze hazırlanmış olmalıdır. |
Cihaz
| Reaktifin Adı | Şirket | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı: MPC ®-S | Dynal | |
| PalmSens enstrüman | PalmSens | Seri kablo bağlantı PC dizüstü bilgisayar ve Mux seçenekleri yazılım PalmSens Lite, ile birlikte verilen |
| CH8 PalmSens Multiplexer | PalmSens | |
| Sekiz kanal Mux elektrik kontağı | el yapımı | |
| Sekiz serigrafi elektrotlar (SPES) ile sıyırın | el yapımı | |
| Elektrotlar şerit için özel olarak tasarlanmış destek | el yapımı | SPE her çalışma elektrot yüzeyinin altında yerleştirilmiş, her biri 8 neodim mıknatıslar |
| Kalibreli mikrolitrelik pipetler | Gilson | |
| Manyetik karıştırıcı ve heyecan bar. | ||
| Cam bardak (100, 50, 20 ml). | ||
| Volumetrik şişeler (2 ml). | ||
| 0.2 ve 2 ml Eppendorf tüpleri. | Eppendorf | |
| 5ml, 15ml Falcon ™ tüpleri. | Şahin | |
| Laboratuvar Vorteks Karıştırıcı | Proteic parçalarının denatüre önlemek için HT2-KLH ile kaplanmış veya bağlantılı manyetik boncuk immünolojik zinciri ile tekrar süspansiyon vorteks mikser kullanmayın | |
| Laboratuvar fırın veya mostatlı oda | 37 ± 3 ° C lik bir sıcaklık tutmak için bir fırın seçin |
Kaynaklar
- Koch, P. State of the art of trichothecenes analysis. Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).
- Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals. Fresenius J. Anal. Chem. 371
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
