Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon

Özet

Bu video nöronların genetik olarak tanımlanan gruplar aksonal yollar kullanarak embriyonik civciv omurilik görselleştirmek için nasıl gösterir Ovo Muhabiri genlerin kontrolü altında belirli artırıcı unsurların elektroporasyon.

Özet

Nöronlarda muhabiri genlerin ifade sürücü İstihdam artırıcı unsurları aksonal projeksiyon izlemek için yaygın olarak kullanılan bir paradigma. Omurgalılarda spinal internöronlar aksonal projeksiyon izleme, germ line-hedefli muhabiri genler bilateral simetrik etiketleme verim. Bu nedenle, IPSI ve kontra-yanal projelendirme aksonlar ayırt etmek zordur. Civciv nöral tüp tek taraflı elektroporasyon, merkezi sinir sisteminin bir tarafı bir muhabir gen ifadesini sınırlamak ve her iki tarafta aksonal projeksiyon takip etmek faydalı bir araç sağlar

Protokol

I. Elektroporasyon

Yumurta taşıma

1. Nemlendirilmiş bir inkübatör seti 37-38 ° C, tercih sallanan tepsileri bir kuluçka yumurtaları yerleştirin.
2. Hamburger ve Hamilton (HH) evre 18-20 ulaştığınızda Embriyo, kuluçka yaklaşık 66 saat sonra electroporated. Bu aşamada, baş, gövde (servikal eğme olarak adlandırılan durum) ve ön, arka, sağ ve sol vitellin venlerin görülmesi gereken ekstra embriyonik kan damarları, geniş bir dizi doğru açılarda yatıyor. Bu arttırıcı bağımlı spesifik ifade ^1,3,4 için optimal bir aşamasıdır. Uygulanabilir ve senkronize embriyolar elde etmek için, inkübatör sıcaklık ve nem izlemek için önemlidir.
3. Inkübasyon 66 saat sonra, yumurtalar inkübatör çıkarın. Yumurta yatay olarak yerleştirin. 5-10 dakika bekleyin. Embriyo artık yumurta üst kutbunda yer almaktadır.

Hazırlıklar

1. Hank çözümü penisilin / streptomisin (P / S) (1:100 dilüsyon) ile hazırlayın.
2. Microcapillary cam kılcal damarlar (0.5 mm çap) çekin.
3. Mikromanipülatör içine elektrotlar (tungsten) yerleştirin ve darbe jeneratörü (ECM 830) elektrotlar bağlamak.
4. - 3, darbe uzunluğu 50 ms voltaj 30v, bakliyat sayısı: Aşağıdaki parametreler ile darbe jeneratörü ayarlayın.
5. Ağız pipet, bir şırınga iğnesi ve bir kaset hazırlayın.
6. DNA (2-5μg/μl) istenen bir karışım hazırlayın ve Hızlı Yeşil boya ekleyin.

Pencereleme ve elektroporasyon

1. Bir şırınga kullanarak, her bir yumurta 5-6 ml albümin çıkarın.
2. Yumurtanın üst tarafında küçük bir makas bir oval pencere açıkken.
3. 0.5-1ml Hank + P / S çözümü ile Nemli embriyo.
4. Cam DNA karışımı ile microcapillary yüklemek için, bir ağız pipet kullanın.
5. Size doğru kuyruk ile embriyo yerleştirin. Bu aşamada, embriyo omurilik açıkça görülür. Bu nedenle, hiçbir karşıt teknikler gereklidir. Omurilik iki ucunda, baş ve kuyruk mühürlenmiş, ancak sizin microcapillary yeterince ince ise, küçük bir delik ponksiyon ve sığ bir açıyla nöral tüp nüfuz edecektir. Sağ çapı microcapillary DNA ile zarar vermeden tüpün içine nüfuz ve düzenli bir soluk verme ile DNA serbest kolayca yüklenmiş olması gerekir.
6. Ağız pipet kullanarak DNA enjekte edilir. Yeşil boya, gelişmekte olan beynin veziküller kuyruk ucu yaymak gerekir.
7. Tüp kendisi ve nabız dokunmadan mümkün olduğunca yakın, nöral tüp paralel elektrotlar yerleştirin. Darbe zamanda, elektrotlar elektriksel iletkenlik sağlayan sıvı ile kaplı olmalıdır. Genellikle, Hank yalvarıyor eklendi miktarı yeterlidir. Eğer değilse bir damla Hank darbe hemen önce ekleyin.
8. Elektrotlar dikkatlice çıkarın ve bir bant ile pencere mühür. Yumurta tamamen sızdırmazlık için aşağıdaki kuluçka dönemi sırasında embriyo kurumasını önlemek için önemlidir.
9. Inkübatör yumurta geri yerleştirin.

II. Omurilik açık-kitap hazırlanması

Embriyo omurilik Dekolmanı

1. Yumurta, E6, eletroporated embriyo çıkarın ve PBS içeren silikon kaplı bir Petri kabı yerleştirin.
2. Membranlar kesip ve ventral tarafta tutun pimleri kullanarak embriyo streç.
3. Keskin bir tungsten kullanma Beyin kuyruk aşağı, çatı levha boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak microcapillary.
4. Omurilik dorsal kök gangliyon (DRG) ayrılmakta, omuriliğin her iki tarafında ek bir iki uzunlamasına insizyonlar olun.
5. Omurilik zedelemeden, kuyruk Beyin başlayan doku taban plakası ile ayırın.
6. Ince makas kullanarak Beyin omurilik enine bir bölümünde kesin ve vücuttan ayrı.

Tespit

1. Silikon düz bir montaj hazırlık üreten kuyruk Beyin tutun pimleri kullanarak, PBS içeren ile kaplı yeni bir petri izole spinal kord sürün.
2. Çanak PBS dökün ve fosfat tamponlu salin içinde% 4 paraformaldehid ile değiştirin.
3. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.

İmmünohistokimya

1. Sabit omurilik PBS içinde primer antikor içeren bir şişeye aktarın.
2. 4 gece boyunca hafif ajitasyon ile inkübe ° C.
3. PBS ile antikor X5, süreleri, her yıkama nazik ajitasyon ile 1 saat yıkayın.
4. Sekonder antikor ekleyin ve 4 gece boyunca hafif ajitasyon ile inkübe ° C
5. Her antikor X5 kez PBS ile yıkayınnazik ajitasyon ile 1 saat süreyle yıkayın.

Görüntüleme için açık bir kitap Montaj

1. Smear gres veya silikon bir slayt üzerinde bir dikdörtgen şeklinde ve içinde PBS damla.
2. Cımbız ve Pasteur pipeti ile çevresinde sıvı çizmek kullanarak dikdörtgenin ortasında gergin omurilik yerleştirin.
3. Omurilik 1-2 damla montaj medya yerleştirin ve kapağı kayma ile kaplayın. Squash hava kabarcıklarını önlemek için.
4. 4 ° C'de karanlıkta slaytlar tutun
5. Konfokal mikroskopi kullanılarak omurilik inceleyin.

Tartışma

Civciv embriyo içine plazmid DNA Elektroporasyon in vivo ektopik ifade için güçlü bir teknik olarak gelişiyor. Özel arttırıcılar ve civciv elektroporasyon kombinasyonu nöronlar ^1,3,5 genetik olarak tanımlanan bir grup aksonal yollar deşifre için hızlı ve etkili bir araç sağlar . Cre / LoxP ve Gal4/UAS amplifikasyon sistemlerinin kullanılması ifade düzeyleri ve süresini arttırır. Ortaya çıkan resim interneuron alt popülasyonlar, kendi aksonal projeksiyonlar yönü ile tanımlanan kaynaklanmaktadır aksonal ipuçlar...