Method Article

Edu Sinyal Amplifikasyon Bireysel Hücrelerde Mitokondriyal DNA replikasyonu Görselleştirme

DOI:

10.3791/2147

⸱

November 15th, 2010

 ,  , 
1Michigan Research Community, Undergraduate Research Opportunity Program, University of Michigan, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology, and Diabetes, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz mtDNA biyogenezi araştırmak için tek tek hücrelerin içinde yeni sentezlenmiş mitokondriyal DNA (mtDNA) etiket hassas bir teknik geliştirdi. Bu teknik, nöronların hücre içi bölmeleri içinde mtDNA çoğaltma görselleştirmek için bir tyramide sinyal amplifikasyon (TSA) protokolü ile birlikte, Edu ile birleşmesiyle birleştirir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, hücresel enerji ve mitokondriyal biyogenezi temel düzenleyiciler 1-3 sağlıklı hücrelerde mitokondri sayıları düzenleyen önemli bir bileşenidir . Mitokondriyal biyogenezi izlenmesi için bir yaklaşım, mitokondriyal DNA (mtDNA) çoğaltma 4 hızını ölçmek için . Biz tek tek hücrelerin içinde yeni sentezlenmiş mtDNA mtDNA biyogenezi çalışmak üzere etiketlemek için hassas bir teknik geliştirdi. Tekniği, nöronların hücre içi bölmeleri içinde mtDNA çoğaltma tyramide görselleştirmek için bir sinyal amplifikasyon (TSA) 8 protokol ile 5-7, 5-ethynyl-2'-dezoksiuridin (EDU) ile birleşmesiyle bir araya getiriyor. 5-7 etiket Edu ilk tıklama reaksiyon BrdU epitopu sergilemek için gerekli olan, sert asit tedavileri veya enzim digests gerektirmez, çünkü Edu 5-bromo-2-dezoksiuridin (BrdU) gibi diğer timidin analogları, üstün . Edu, hafif etiketleme diğer hücre işaretleyicileri 9-10 kuruluşunun doğrudan karşılaştırma sağlar. MtDNA biyogenezi görselleştirmek ve sayısal yeteneği mitokondriyal biyogenezi düzenlemek ve ilaç zehirlenmesi, yaşlanma, kanser, nörodejeneratif hastalıklar ile ilişkili patogenezinde içgörü sağlayacak mekanizmaları araştırmak için gerekli bir araç sağlar. Bizim teknik duyumsal nöronları gibi diğer hücre türleri için geçerli. MtDNA biyogenezi ölçmek için bu tekniğin kullanımı, her ikisi de normal hücresel fizyoloji yanı sıra engelli hastalık durumlarında anlayışı sürdürmek önemli etkileri vardır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nöronların hazırlanması

  1. Dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar 24 kuyu kültür plaka steril (otoklavlanmış) 12 mm cam lamelleri yetiştirilmektedir.
  2. EDU 10 mM stok (DMSO tıklayın-iT edu Mikroplaka Assay Kit) tipik olarak (örneğin 30 10X Edu çözüm (100 mcM) yapmak için kültür ortamı 1:100 seyreltilir ve sonra kültür kuyulara 01:10 seyreltilmiş toplam 300 mcL bir kültür ortamı içine 10X Edu çözüm) mcL. DRG nöronlar 37 10 mcM Edu son bir konsantrasyon ile inkübe ° C ve% 5 CO 2 2-24 saatleri arasında. Süresinin uzunluğu tedaviler mtDNA sentez hızı nasıl etkilediğini bağlıdır.
  3. 1 aya kadar 4 davlumbaz, DRG nöronlar, oda sıcaklığında 10-15 dakika süreyle% 2 paraformaldehid sabit Her yıkamadan 1X PBS 2-5 dakika içinde iki kez yıkanmış ve taze 1X PBS içinde saklanan ° C
  4. Lameller ince uçlu forseps ile hazırlanmış bir nemli odasına aktarılır (Corning kontrast siyah papered alt Biyoassay çanak, ışığa duyarlı bileşenleri ve su doymuş Kimwipes ile nemlendirilmelidir korumak için alüminyum folyo ile sarılmış) ve bir Parafilm M kağıda yerleştirilir sağladığı lamel çözümler sınırlandırmak için hidrofobik bir yüzey. Aşağıdaki protokol 28 lamelleri için tasarlanmıştır ve çözümleri 32 lamelleri (% 14 ekstra hacim hakkında) için hazırlanmıştır. Pahalı veya sınırlı bileşenleri ile çözümler 75-80 mcL her lamel kullanılır böylece yapılır. Aksi takdirde, 200-300 mcL Önceki çözümler iyice yıkayın, yıkama ve blok çözümler için kullanılır.
  5. 1X PBS (200-300 mcL) her lamel yüzeyinde kapsayacak şekilde yeniden uygulayın. Click-iT tahlil ve aşağıda üreticinin talimatlarına açıklanan tyramide sinyal amplifikasyon kitleri hazırlayın.

-IT Edu Mikroplaka Testi Seti Hazırlanması

Click-iT Edu Mikroplaka Assay Kit bileşenleri gelen önceden yapılmış ve 4 saklanır ° C [tıklayın 2x-iT Reaksiyon Tamponu (10x Bileşen E), CuSO4 (100 mM, Bileşen F), Click-iT Edu fiksatif ( Bileşen D) ve Engelleme Buffer (2x Bileşen H)]. Zaman içinde sarı-kahverengi dönmesini önlemek için tıklayın-iT Edu Tampon Katkı (10x Bileşen G) -20 ° C'de saklanır. Bu bileşen, tekrarlanan donma-çözülme döngüleri göz yumuyor.

Oregon Yeşil 488 azid (B Bileşeni), küçük alikotları (10-20 mcL), donma-çözülme çevrimleri en aza indirmek için bölünmüş ve -20 ° C'de saklanan olmalıdır

Anti-Oregon Green HRP konjuge (Bileşen) stok solüsyonu hazırlamak için, flakon Milli Q dH 2 O 75 mcL ekleyin. Köpük önlemek ve 4 mağaza ° C'ye kadar nazik pipetleme veya tersine çevirerek karıştırın Girdap değil.

TSA Seti Hazırlanması HRP keçi anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 488 Tyramide Kiti ile # 12,

Tyramide stok solüsyonu hazırlamak için, DMSO (Komponent B) 150 mcL (Alexa Fluor 488 tyramide, Komponent A) katı madde çözülür. Flakonun tarafı çözmek için herhangi bir tyramide kaplama flakon birkaç kez ters çevirin. ≤ -20 küçük alikotları Mağaza stok solüsyonu (10-20 mcL) ° C, kurutulmuş ve ışıktan korunmalıdır.

2. Click-5-ethynyl-2-dezoksiuridin (EDU) Etiketleme

NOT: Tüm çözümler olmadan sıvı kaybetme hücreleri hafifçe kaldırmak için sonuna kadar yapıştırılmış 200 mcL ucu ile bir ampul transfer pipet yardımıyla kaldırılır. , Genellikle çok güçlü bir şekilde çözümler kaldırmak bir vakum hattı, kullanmaktan kaçının. Bir ampul pipet yavaşça önceki çözüm iyice yıkayın, yıkama çözümleri 200-300 mcL ile lamelleri sel kullanılır.

  1. Hücreler% 0.1 'lik bir kapalı nemli odasında oda sıcaklığında 10 dakika için 1X PBS çözüm Triton X-100 ile permeabilize. % 1 Triton X-100 stok solüsyonları kullanın.
    • 2700μL 1X PBS Triton-X-100 stok 300 mcL% 1 ekleyerek% 0.1 Triton X-100 3000 mcL olun.
    • Lamel ortalama 75-80 mcL kullanın.
  2. Triton X-100 çözümü çıkarın ve 1X PBS ile iki kez yıkayın.
  3. Endojen peroksidaz aktivitesi% 1 H 2 O 2 oda sıcaklığında 30 dakika için 1X PBS çözüm söndürülür. 1X PBS ile% 30 H 2 O 2 çözeltinin. Bu çözüm, taze yapılmalıdır ancak yukarıdaki 10 dakika permeabilization adım (adım 3.1) sırasında yapılabilir.
    • 2900 mcL 1X PBS 100 mcL% 30 H 2 O 2 ekleyerek% 1 H 2 O 2 3000 mcL olun.
    • Lamel ortalama 75-80 mcL kullanın.
    • Peroksidaz çözümü çıkarın ve 1X PBS ile iki kez yıkayın.
  4. Click-iT Edu Reaksiyon
    • 32 lamelleri (32 x 80 mcL =2560 mcL) toplam 2560 mcL bir ihtiyaç vardır. 2x tepki, reaksiyon toplam hacminin yarısı 1280 mcL yapılır.
    • Taze 5 dakika sonrası düzeltme (Adım 3.5) başlamadan önce Click-iT Reaksiyon Kokteyl hazırlamak.
    • Yukarı ve aşağı pipetleme kokteyl karıştırın. Bu reaksiyon verirken vorteks etmeyin.
      2 x Reaksiyon Kokteyl
      Bileşenler tıklayın iT Edu Mikroplaka Assay Kit             		Yarım Cilt: 1280 mcL
      Milli Q dH 2 O 1132,8 mcL
      2x tıklayın iT Reaksiyon Tamponu (10x Bileşen D) 100,3 mcL
      Click-iT Edu Tampon Katkı (10x Bileşen G) 25.6 mcL
      CuSO 4 (100 mM, Bileşen F) 25.6 mcL
      Oregon Yeşil Azid (A Bileşeni) 6.4 mcL
      Toplam 1290,7 mcL

      NOT: Yukarıda kullanılan birimleri tıklayın-iT Edu Mikroplaka Assay kiti yönde listelenen hacimleri ile doğru orantılıdır. Reaksiyon Kokteyli son hacmi 1280 mcL biraz daha.
    • 2X tıklayın-iT reaksiyon tıklayın iT eşit hacmi Edu fiksatif (Bileşen D) kullanmadan önce seyreltilir. Karıştırma bu arada tüm lamelleri için tek tip bir reaksiyon çözüm haline getirir.
    • 1290,7 mcL tepki kokteyl 1290,7 mcL tıklayın iT Edu fiksatif (Bileşen D) ekleyin. Lamel ortalama 75-80 mcL kullanın.
  5. -IT oda sıcaklığında 5 dakika Edu fiksatif (Bileşen D) ile nöronların post-düzeltin.
  6. Kaldır düzeltmek ve (adım 3.4) Yukarıdaki reaksiyon kokteyl eklemek. Işıktan korumak ve oda sıcaklığında 25 dakika inkübe örtün. Reaksiyon Kokteyl yavaşça çıkarın. Seyreltilmiş 1X Engelleme Buffer (2X Bileşen H) ile iki kez yıkayın.
    • 2600 mcL Engelleme Buffer (2x Bileşen H) MilliQ d H 2 O (2600 mcL) eşit hacmi ile seyreltilmesi ile 1X Engelleme Tampon 5200 mcL olun. Lamel ortalama 75-80 mcL kullanın.
  7. Epi-floresan mikroskop altında, mitotik aktif kontrol hücrelerinin çekirdekleri Oregon Yeşil boyama kontrol edin.

3. Edu Sinyal Tyramide Sinyal Amplifikasyon (TSA)

  1. Her lamel,% 1 TSA blok çözüm ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
    • TSA Engelleme Reaktif (TSA kit # 12, Bileşen D) 0.06 g ağırlığında ve 6000 mcL 1X PBS ekleyerek% 1 TSA blok çözüm 6000 mcL olun. Karıştırmak için Vortex. % 5 keçi serumu% 1 TSA blok çözüm eklenmesi genellikle non-spesifik bağlama azaltmaya yardımcı olacaktır.
  2. Kısaca anti-Oregon Yeşil horseradish peroksidaz konjuge antikor stok (Bileşen tıklayın-iT Edu Mikroplaka Testi), TSA önceden hazırlanan 2-24 saat dönerler. % 1 TSA engelleme çözümü birincil antikor 1:300 seyreltilir ve ters ya da karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetle. HRP-konjuge antikor bozmamak için vorteks etmeyin. % 1 TSA blok çözüm çıkarın her lamel 75 mcL ekleyin ve 4 gece inkübe ° C
    • Antikor örneğin 1:150 olarak daha yoğun olabilir, ancak sınırlı miktarda verilir, bu yüzden idareli kullanmak. Yine,% 5 keçi serumu% 1 TSA blok çözüm ek genellikle anti-Oregon Yeşil horseradish peroksidaz konjuge antikor non-spesifik bağlanma azaltmaya yardımcı olacaktır.
    • 1:300 antikor çözüm stok Tavşan, anti-Oregon Yeşil-HRP (8.53 mcL ekleyerek 2560 mcL olun tıklayın-iT 2560 mcL% 1 TSA Engelleme Edu Mikroplaka Testi). Nazik pipetleme veya tersine çevirerek karıştırın.
  3. Ertesi gün, antikor çözüm kaldırmak ve 1X PBS ile üç kez yıkayın. Lamelleri için son yıkama bağlanmamış primer antikor kaldırılmış olduğundan emin olmak için ek bir oda sıcaklığında 30-60 dakika inkübe edin.
  4. 2560 mcL (32 lamelleri x 80 mcL) Tyramide reaksiyon hazırlayın.
    • 398 mcL Amplifikasyon Buffer (TSA kiti # 12, Bileşen E)% 30 H 2 O 2 (TSA kiti # 12, Bileşen F) 2 mcL ekleyerek% 0,15 H 2 O 2 çözeltisi (100X) 400 mcL olun . Bu hak etmeden önce gereken yapılmalıdır.
    • 2560 mcL son bir birim için bir araya getirir:
      • 25.6 mcL Tyramide-488 (TSA kiti A Bileşeni)
      • 2508,8 mcL Amplifikasyon Buffer (TSA kiti Bileşen D)
      • 25.6 mcL% 0.15 H 2 O 2 (nihai 0.0015% H 2 O 2 için yukarıdaki)
      • 1X PBS ve Tyramide reaksiyonu ile oda sıcaklığında 15 dakika inkübe çıkarın.
  5. Tyramide tepki çıkartın ve oda sıcaklığında 30-60 dakika önce olduğu gibi son yıkama kuluçka, 1X PBS ile üç kez yıkayın.
  6. MtDNA etiketlenmesi için bir epi-floresan mikroskop altında kontrol edin.
    • Gibi bir antifade montaj orta, cam mikroskop slaytlar Mount lamelleri DAPI Altın uzatır. Alternatif olarak, Edu etiketleme ve amplifikasyon, diğer hücresel belirteçleri etiket standart floresan immünsitokimya tarafından takip edilebilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar: Mitokondrial DNA replikasyonu Görselleştirme Mitokondrial Biyogenez için Marker

Biz duyusal nöronları (Şekil 1) mitokondri sayısını düzenleyen nasıl ilgilendi. Bu protokol, yeni mitokondrinin ölçme bir yolu olarak floresan işaretleyici ile yeni sentezlenmiş mtDNA etiket. Oregon Yeşil-azid ve takip eden yeşil flüoresan bir sinyal (Şekil 2) ile mtDNA etiketleme Alexa Fluor 488 tyramide sonuçları ile amplifikasyon tıklayarak kimya takip sentetik nükleotid Edu dahil. Eğer doğru yapılırsa, güçlendirilmiş yeşil sinyal yeterince eşiğe (hücresel otofloresans veya HRP-TSA reaksiyonun bir yan etkisi olarak) daha yüksektir.

Bu teknik, nöron (Şekil 3) sar bölmeleri içinde mtDNA biyogenezi görselleştirmek ve ölçmek için yeni çoğaltılmış mtDNA etiketlemek için tasarlanmıştır. Edu etiketleme nörofilaman (Şekil 3 boyutlu) gibi diğer hücresel belirteçleri etiket sonraki floresan immünsitokimya sağlar.

TSA tepki Alexa Fluor 594-tyramide gibi diğer floresan Alexa Fluor tyramides ile de yapılabilir. Bu sonuçlar bir yeşil floresan nükleer sinyal çekirdeğinde Oregon Yeşil-azid tıklama tepki ama, önce TSA belirlenemeyen mtDNA, herhangi bir yeşil sinyal. Alexa Fluor 594-tyramide amplifikasyon nükleer etiket yoğunlaştırır ve bir kırmızı floresan sinyal (Şekil 4) ile mtDNA dahil Edu ortaya koymaktadır. Benzer bir büyütme işlemi, yeni sentezlenmiş mtDNA (Şekil 5) içine BrdU birleştirmek görselleştirmek için kullanılır, ancak, bu yöntem ek bir adım Edu için gerekli değildir ya da sert bir asit (HCl) veya enzim sindirimi, BrdU epitopu kurtarmak için gerekli etiketleme.

figure-protocol-1
Şekil 1. Temsilcisi diferansiyel girişim kontrast (DIC) embriyonik bir görüntü (sol) ve yetişkin (sağda) genellikle analizi. Barlar = 10 mm için kullanılan dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar.

figure-protocol-2
Şekil 2. Yeşil floresan sinyali ile mtDNA Edu etiketleme prosedürü temsil eden şematik diyagramı. Şematik bir yeşil floresan sinyali ile mtDNA Edu etiketlenmesi için üç adımlı bir protokol temsil eder . Mitotik F11 nöroblastoma hücreleri aktif bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir ve nükleer ve mitokondriyal DNA kurulmuştur Edu etiketleme desen göstermektedir. Ilk adım (P1), Edu varlığı hücrelerin kuluçka, yeni sentezlenmiş mtDNA bir timidin analog dahil etmektir. İkinci adım (P2), Oregon Yeşil-azid dahil Edu etiketlemek için tıklayın kimya dayanmaktadır. Yeşil sinyal nükleer DNA çoğaltılan hücrelerin çekirdekleri görünür. Oregon Gr yükseltmek için son adım (P3)Oregon Yeşil karşı HRP-konjuge tavşan antikoru ile inkübe een azid sinyal Alexa Fluor mtDNA yeşil sinyal görselleştirmek için hidrojen peroksit varlığında 488 etiketli tyramide (H 2 O 2) ile inkübasyon izledi.

figure-protocol-3
Şekil 3. Dorsal kök ganglion mtDNA Edu etiketleme (DRG) nöronlar. Nöronlar edu ile inkübe edilir ve sinyal daha sonra dahil Edu mtDNA olduğunu ortaya çıkarmak için yükseltilir . Amplifiye Edu (EDU-OG-TSA, yeşil), embriyonik (A) ve yetişkin (BD) DRG nöronlar hem yeni sentezlenmiş mtDNA içine yeşil noktalı sinyalleri gösteren iletilen ışık kaplamış Temsilcisi floresan görüntüler. Edu etiketleme prosedürü nörofilaman (D, αNF, kırmızı) gibi nöronal belirteçlerin sonraki immünofloresan boyama sağlar. Ölçek bar = 10 mm.

figure-protocol-4
Şekil 4. Kırmızı floresan sinyali ile mtDNA Edu etiketleme prosedürü temsil eden şematik diyagramı. Şematik kırmızı floresan sinyali ile mtDNA Edu etiketlenmesi için üç adımlı bir protokol temsil eder . Mitotik F11 nöroblastoma hücreleri aktif bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir ve nükleer ve mitokondriyal DNA kurulmuştur Edu etiketleme desen göstermektedir. Ilk adım (P1), Edu varlığı hücrelerin kuluçka, yeni sentezlenmiş mtDNA bir timidin analog dahil etmektir. İkinci adım (P2), Oregon Yeşil-azid dahil Edu etiketlemek için tıklayın kimya dayanmaktadır. Yeşil sinyal nükleer DNA çoğaltılan hücrelerin çekirdekleri görünür. Oregon Yeşil karşı HRP-konjuge tavşan antikoru ile inkübe Oregon Yeşil-azid sinyali yükseltmek için son adım (P3) Alexa Fluor görselleştirmek için hidrojen peroksit varlığında 594 etiketli tyramide (H 2 O 2) ile kuluçka mtDNA kırmızı sinyal.

figure-protocol-5
Şekil 5. BrdU etiketleme ve mtDNA yeşil veya kırmızı floresan sinyal tyramide sinyal amplifikasyon. Şematik diyagramı ya da yeşil ya da kırmızı floresan sinyali ile yeni sentezlenmiş mtDNA BrdU etiketleme prosedürü temsil eder. Edu etiketleme için gerekli değildir ya da asit (HCl) veya enzim sindirimi, BrdU epitopu kurtarmak için bir ilk adım gereklidir. Bir sonraki adım, bir fare primer anti-BrdU antikor ile inkübe. Bu horseradish peroksidaz (HRP)-konjuge keçi anti-fare antikor ile inkübe tarafından takip edilmektedir. Son olarak, sinyal mtDNA sinyal görselleştirmek için hidrojen peroksit varlığında bir yeşil ya da kırmızı floresan etiketli tyramide (H 2 O 2) ile yükseltilir .

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz duyarlı bir tahlil Edu bir tyramide sinyal amplifikasyon kullanarak tek tek hücreleri yeni sentezlenmiş mtDNA etiket geliştirdi. Bu protokolün optimizasyonu sırasında en büyük sorunlarından biri lamelleri arasındaki tutarsız sonuçlar oldu. Değişiklikler bireysel lamelleri küçük birimler karıştırma ve ana çözümleri tüm lamelleri için kullanılacak önlemek için Invitrogen kiti protokolleri yapılmıştır. 75-80 mcL her 12 mm yuvarlak cam lamel için kullanılan örnekleri arasında tutarlı sonuçlar vermek için yeterli bir çözüm sağlarken tamamen yüzey alanı kapsayacak şekilde ideal bir hacim. Kuluçka süreleri ve reaktif konsantrasyonları optimize edilmiştir, ancak gelişmeler onlara ayarlamaları ile görülebilir.

Protokol, her süreç bir kez çalıştırmak için tasarlanmıştır. Ancak, bazı adımları, ilk denemeden sonra başarısız örnekleri kurtarmak için yeni çözümler ile tekrar edilmiştir. Özellikle, Edu tıklama reaksiyon adımları (3.4-3.6) eşiğe önemli bir artış olmadan tekrar edilmiştir. Anti-Oregon Yeşil-HRP antikor inkübasyon (4,1-4,3) ve tyramide amplifikasyon (4,4-4,5) adımları tekrar, ama daha çok zayıf bir sinyal gürültü oranı nedeniyle artan eşiğe sonuçları. Edilmiştir

En hassas reaktifler tıklayın-iT Edu Mikroplaka Assay kiti tıklayın-iT Edu Tampon Katkı (Bileşen G) ve tavşan anti-Oregon Yeşil-HRP antikor (Bileşen). 4 ° C ve 6-12 ay arasında oldukça koyulaştırır saklandığında tıklayın-iT Edu Tampon Katkı zamanla sarıya döner. -20 ° Click-iT Edu Tampon Katkı Depolama C bu sorunu hafifletmek olacak. Etiketleme ve tyramide amplifikasyon adımları tavşan anti-Oregon Yeşil-HRP antikor MilliQ dH 2 O yeniden oluşturmak 4-6 ay içinde kullanıldığı zaman en iyi çalışmalarınızı

MtDNA içinde Edu hafif etiketleme ile doğrudan karşılaştırmalar için ek hücre işaretleyicileri 9-11 sağlar ve sert bir tedavi kurtarmak için gerekli 5-bromo-2-dezoksiuridin (BrdU), gibi diğer timidin analogları üzerinde bu tekniğin yardımcı artırır DNA'da epitop. Laboratuvarımız 11-12 ve diğerleri 13-15 mtDNA etiket BrdU başarıyla kullanmıştır. BrdU etiketleme tekniği, Edu için kullanılan bir benzer fakat bazı önemli farklılıklar vardır (Şekil 5). Yukarıda listelenen permeabilization adım (3,1-3,2) sonra, BrdU epitopu denatürasyon bir adım geri (37 30 dakika için 2 N HCl ° C 1X PBS içinde üç yıkar). BrdU sonra BrdU karşı primer antikor ile etiketlenir (Vektör Laboratuvarları TSA kiti% 1 engelleme çözüm 01:50 seyreltilmiş ve 4 ° C'de bir gece inkübe). İkincil antikor adım önce BrdU sinyali (keçi anti-fare IgG% 1 engelleme çözüm 1:100 sulandırılmış TSA kitleri # 2 ve # 5, HRP konjuge ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe) yükseltmek için gerekli olan TSA adımları (yukarıda 4,3-4,5). Iki timidin analogları, Edu ve BrdU, etiket mtDNA mtDNA sırayla darbe etiketleme paradigmalar 11 etiketli olabilir çift etiket deneyler için avantajlı.

Laboratuvarımız, diyabetik nöropati, diyabetin sık rastlanan bir komplikasyonudur bağlamında mitokondriyal biyotekvinin düzenlemeyi incelemek için Edu ve mtDNA BrdU etiketleme kullanıyor. Biz başarıyla bireysel nöronlar 11-12 mtDNA biyogenezi değişiklikleri ölçmek için sinyal amplifikasyonu kullandık. Bu teknik diğer deneylerde mtDNA çoğaltma ve ciro veya mtDNA sentezini inhibe eden ilaçların belirlenmesi için mekanizmalarını keşfetmek için tasarlanmış yararlı olacaktır. Buna ek olarak, yükseltme Edu ve BrdU sinyalleri temel ilkelerini diğer çalışmalar uygulanabilir önlem DNA replikasyonu veya onarım.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık Grants NS-38.849 ve DK-076.160, Diyabet Komplikasyonları Çalışması Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı Merkezi tarafından desteklenen, Nöroloji Araştırma ve Keşif ve The A. Alfred Taubman Tıp Araştırma Enstitüsü Programı Michigan Üniversitesi. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü Sağlık Hibe 5P60 DK-20.572 tarafından finanse edilen Michigan Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi, Morfoloji ve Görüntü Analizi Core kullandı. Yazarlar onun değerli tavsiyeler Moleküler Problar / Invitrogen Scott T. Clarke teşekkür çeşitli tıklayın iT kitleri ve reaktiflerin cömert bağış Edu amplifikasyon tekniği ilk gelişimini desteklemek için etiketleme Edu.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm lamelFisher Scientific12-545-82
245 mm x 245 mm BioAssay KabıCorning431111
Parafilm MFisher ScientificPM-996
paraformaldehyeSigma-AldrichP6148
Triton X-100Sigma-AldrichT-8532
Fosfat tamponlu tuzlu su 10X çözeltisiFisher ScientificBP399
Transfer PipetiFisher Scientific13-711-7M
Hidrojen peroksit, suda %30Fisher ScientificBP2633
Click-iT EdU Mikroplaka Test KitiInvitrogenC10214
TSA Kiti # 12, HRP & # 8212 ile; keçi anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 488 tiramidInvitrogenT20922
TSA Kiti # 15, HRP & # 8211 ile; keçi anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 594 tiramidInvitrogenT20925
InvitrogenP-36931Poliklonal tavşan ile altın antifade reaktifi
Nörofilament antikorChemicon InternationalAB1981
Fare monoklonal anti-BrdU antikoruVektör LaboratuvarlarıVP-B209
TSA Kiti #2, HRP— ile; keçi anti-fare IgG ve Alexa Fluor 488 tiramidInvitrogenT20912
TSA Kiti # 5, HRP & # 8212 ile; keçi anti-fare IgG ve Alexa Fluor 594 tiramidInvitrogenT20915
ProLong DAPI

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).
  2. Dimmer, K. S., Scorrano, L. (De)constructing mitochondria: what for. Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).
  3. Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).
  4. Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number. J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).
  5. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  6. Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  7. Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations. J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).
  8. Heusden, J. V. an, Jong, P. de, Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels. J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).
  9. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, 626-636 (2008).
  10. Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea. Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).
  11. Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In. Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  12. Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  13. Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).
  14. Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells. Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).
  15. Amiri, M., Hollenbeck, P. J. Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons. Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial DNA ReplicationEdU LabelingTyramide Signal AmplificationMitochondrial BiogenesisNeuronal Subcellular CompartmentsClick ChemistryFluorescent ImagingMitochondrial DNA Copy NumberNeuronal Marker StainingMitochondrial DNA Visualization

Related Articles