Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

Özet

Anofel stephensi sivrisinekler, sıtma yaşayan Hindistan ve Asya'da vektörleri. Bu video bu türün sivrisinek sıtma karşı direnç kazandırırlar transgenlerin microinjections gerçekleştirmek için teknik göstermektedir. Bu video gösterdi metodoloji diğer sivrisinek türlerinin mikroenjeksiyon teknikleri uygulanabilir.

Özet

Sivrisinek genomların ekzojen genlerin giriş, özel ilgi türü için hazırlanmış mikroenjeksiyon teknikleri gerektirir. Bu video protokol dönüştürülmüş sivrisineklerin nesil için Anofel stephensi embriyolar DNA yapıları microinject James laboratuvar tarafından kullanılan bir yöntem gösteriyor. Teknikleri, mikroenjeksiyon iğneler hazırlanması, toplanması ve hazırlanması embriyolar ve mikroenjeksiyon işlemi için gösterilmiştir.

Protokol

Mikroenjeksiyon, önceden hazırlanması:

1. Kan linki sivrisinek: Pazartesi - Çarşamba önceki Cuma günü linki kadın enjeksiyon için. Aynı hafta Pazartesi, Perşembe ve Cuma günleri, yem kadın enjekte etmek.
   
   
2. Kuvars iğne programı 2 ve izotonik tampon (Malzeme) kullanarak hazırlayın.
   
   
3. Embriyolar "tüp Döşeme" düzenli Drosophila kültür flakon. Kapsayan filtre kağıdı ıslak bir disk ile alt Islak pamuk.
   
   
4. Bir ucunda çift taraflı bant yapıştırma, plastik kapak kayma hazırlayın. Trim kaset kapağı için, kapak kayma kenarında biter, böylece kayma.
   
   
5. Kuruma petrol hazırlayın.
   
   
6. Petri kabı, kuluçka için embriyo transferine izotonik tamponu ile hazırlayın.

Zorla döşeme ayarlayın:

1. Toplayın ve bir aspiratör ile 6-10 kan beslenen kadınlarda, pamuk ve izotonik tampon ıslak filtre kağıdı ile Drosophila kültür flakon aktarabilirsiniz .
   
   
2. Sivrisinek sonra karanlıkta insectery koşullar içine geri koyun ve 1 saat ve 15 dakika için yumurtalarını bırakmak için izin.
   
   
3. Yetişkin kafes içine sinek ve embriyolar ile filtre kağıdı diski çıkarın.
   
   
4. Yumurta kadar satır için, diseksiyon kapsamında bunu. (Sable, No 0000) ince bir fırça ile yumurta demet toplayın ve hazırlanmış bir kare izotonik tampon ile ıslatılmış 3MM whatman kağıt transfer. Tüm zamanların ıslak kağıt tutun. Yumurta kurutulmuş almak izin vermeyin. Exochorion fırça ile kaldırın, daha iyi bant yumurta sopa yardımcı olur.
   
   
5. Ince forsepsle No 5 ya da ince bir fırça kullanarak, koyu gri embriyolar pick up ve izotonik tampon ile ıslak 3MM whatman kare doğrultusunda düzenlemek. 20-30 embriyolardan Hattı. Enjeksiyon arka kutupta yer gibi tüm embriyolar aynı yönde olmalıdır. Embriyoların ön arka biraz daha geniş. Sonra 3MM whatman kağıt şeritleri kullanarak, yumurta, yumurta hattının her iki tarafında sert basarak, yumurta dokunmadan dizilmiş filtre kurulayın.
   
   
6. Yumurta transfer etmek için, çift taraflı bant (Tıp) içeren slayt, invert ve yumurta karşı hafifçe basın. Yumurta arka ucunda çift taraflı bant kenarına çok yakın olması. Yapışmaz çok ıslak ise kağıt ıslaklık, bunun için kritik öneme sahiptir. 5-10 saniyelik embriyoların kuruma, ancak kuruma süresi mikroenjeksiyon oda nemli ve sıcaklık bağlıdır.
   
   
7. Biraz çok ve embriyolar yumurtadan olmaz: Kuruma yumurta için çok önemlidir. Kuruma DNA olmadan embriyo girecek değildir.
   
   
8. Kurutulmuş embriyolar daha fazla kuruma önlemek için Halokarbon yağ ile kaplayın.

Embriyoların Mikroenjeksiyon:

En önemli özelliği iyi bir enjeksiyon (Not bakınız) iğne kalitesidir.

1. Microloader (Eppendorf # 5242 956,003) kullanarak enjekte edilecek DNA çözümü ile bir iğne doldurun. Çok az enjeksiyon soliution, 1 - 2 ml gereklidir.
   
   
2. Iğne, enjeksiyon süresi ve basınç kontrolleri Eppendorf Transjector, yanı sıra backpressure bağlayın. Mikroenjeksiyon x 10 büyütme ve mikromanipülatör (Leica) hareketli bir sahne (Leica) bir mikroskop kullanılarak yapılır. Gerekirse, yükseltilmiş bir mikroskop aşamada 4-5 mikroskop lamı istifleme tarafından hazırlanmış olabilir. Yükseltilmiş sahneye taşıyan embriyolar kapak kayma yerleştirin. Embriyolar 150 ° açıyla enjekte edilir; penetrasyon arka kutupta olmalıdır. Enjeksiyon için iğne sabit tutmak ve mikroskop aşamasına taşımak. Iğne ucu kapalı ve genellikle ilk enjeksiyondan tatili. Ben her zaman, her enjeksiyon arasında DNA'nın küçük bir damla petrol sınırdışı için gerekli olan basınç çalışır.
   
   
3. Ben 0.2 enjeksiyon süresi 0.9 saniye ve 1000 hPa iğne yeni. Kadar küçük bir damlacık yağın içine iğne çıkan basınç ve zaman değişir. Backpressure yaklaşık 100 ayarlanması gerekir. Iğne ucu aşınmış alır gibi, enjeksiyon basıncı, enjeksiyon hacmi düşük tutmak için (yaklaşık 300 hPa) azaltılmalıdır. Bundan sonra, iğne ucu çok büyük ve embriyoların çoğu öldürüyor.
   
   
4. Enjeksiyondan sonra, kağıt mendil ile petrol çıkarmak ve embriyo ve izotonik tampon Petri kabında yer slayt kapağı. Insectory yemekleri yerleştirin ve embriyoların yumurtadan kadar orada bırakın. Bunlar 2-6 gün sonra yumurtadan çıkar başlar. Tutam toprak balık yemi ile distile su larva transferi.

Notlar

Enjeksiyon için DNA: enjeksiyon için Plazmid DNA çözüm EndoFree plazmid kiti kullanılarak izole edilmiştir.Plazmid Construct ve doğru konsantrasyon birlikte Yardımcısı plazmid karışımı, isopropanol hızlandırdı. Pelet enjeksiyon tampon resuspending önce% 70 etanol ile yıkandı. Enjeksiyon, önce Millex-GV sütun kullanarak temiz DNA.

Izotonic tampon:

1.68 M NaCl - 88.3 ml 1.68 M NaCl - 2.9 m 1 M -10.7 ml HEPES 1.12 M CaCl 2 - 2,2 ml dH 2 O - 896 ml

VEYA

5 M NaCl - 29,67 ml 1 M KCI - 4.87 ml 1 M HEPES - 10.7 ml 1.12 M CaCl 2 - 2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml

PH 7.2 'ye ayarlayın

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Enjeksiyon kuvars iğneleri		Sutter Instrument Co.		D.Ç.- 1.0 mm, İ.Ç.-0.70, 10 cm uzunluk; kılcal boruların bir mikropipet çekicisi ile yaklaşık 100-300 mm'lik bir gövde üzerinde 3-8 µm'lik ince bir uca çekilmesiyle hazırlanır.
Kuvars çekici	Araç	Sutter Instrument Co.	P-2000	Kurulum: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plazmit kiti		Qiagen
İzopropanol
Millex-GV kolonu			SLGV RO4 NL	DNA temizliği için
Konstrükt DNA				0.5 mg/ml
Yardımcı plazmit				0.3 mg/ml
Enjeksiyon solüsyonu	Tampon			1x solüsyon: 5mM KCl, 0.1mM sodyum fosfat, pH 6.8
İzotonik tampon				reçete için protokol bölümüne bakınız
Desikasyon yağı				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). İyice karıştırın. Mikroenjeksiyondan önce hazırlayın.
Kan				sivrisinekleri beslemek için
Anopheles stephensi	Hayvan			Sivrisinekler, erkek ve dişi.
Drosophila kültür tüpü				yumurtlama için
Petri kapları				izotonik tampon ile, embriyo çıkışı için
İnce resim fırçası				Sable # 0000
3MM Whatman kağıdı
Pens #5
çift taraflı bant
Mikro yükleyici		Eppendorf	5242 956.003
Transjektör		Eppendorf
Mikroskop		Leica Microsystems		hareketli tabla ve mikromanipülatör ile, 10x büyütmeye ayarlı