$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hücre hazırlık
- İnsan erythroleukemic K562 hücreleri 37 nemlendirilmiş bir% 5 CO 2 ortamında% 10 (v / v) fetal sığır serumu ve 20 mg / ml gentamisin ile desteklenmiş RPMI-1640 ortamı ° C yetiştirilen
- Boyamadan önce yaklaşık 18 saat, 37 taze medya ve karşılığında tekrar süspansiyon salin (PBS), tamponlu fosfat ile katlanarak büyüyor hücreleri (5 x 10 5 hücre / ml) optimum yıkama ° C,% 5 CO 2 .
- 5 dakika boyunca yaklaşık 1500 rpm'de santrifüj yoluyla hücreler iki kez PBS ile yıkayın ve taze medya içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
- Hücre sayımı ve hücre yoğunluğu yaklaşık 5 x 10 5 hücre / ml ayarlayabilirsiniz.
Hücreler otomatik bir yöntem (örneğin Sysmex veya 5 ila 20 mikron arasında filtre boyutu ile Coulter sayacı) veya trypan mavisiyle boyama metodu ve bir haemocytometer kullanarak ya sayılabilir. Aşırı hücre sayısı (> 800 hücre / cm 2), homojen olmayan boyama yol açabilir .
Işınlama ve immünofloresan boyama
- Sitospin klipleri, filtre kartları ve slaytlar uygun etiketleme ile birleştirin.
Montaj sitospin cihazları filtre kartı delik huni çakışacak şekilde sağlamak.
- Γ-radyasyon veya X-ışınları (bu örnekte 2Gy) hücreleri Açığa.
Işınlama sırasında odaklarının oluşumunu önlemek için, önce ve radyoterapi sırasında 5 ila 10 dakika buz üzerinde hücrelerin tutun.
Irradyasyonu takiben 37 hücreleri inkübe ° C,% 5 CO 2 için gereken zaman (pik γH2AX seviyeleri 30 dakikadan 1 saate kadar kadar; Bu örnekte 1 saat) .
- Soğuk PBS ile iki kez, taze PBS içinde santrifüj ve tekrar süspansiyon hücreleri yıkayın.
- 500 rpm'de 5 dakika boyunca her sitospin huni ve spin hücre süspansiyonu 100 ile 150 mcL dağıtın.
- Cytospins slaytlar ayrı ve hücreler yaklaşık 15 dakika orta derecede kuru hava sağlar.
Hücresel morfoloji parçalanır, hücreler tamamen kurumasını izin vermeyin.
- Hidrofobik bir kalem ile hücrelerin etrafında bir daire çizin.
- Hücreler az 5 dakika oda sıcaklığında (RT) için% 4 paraformaldehid ile sabitleyin.
Deneyimlerimiz, paraformaldehid ile tespit etanol veya metanol ile tespit üstündür. Uzun fiksasyon kez (15 ila 20 dakika) yapışık hücrelere Optimum sabitleme için gerekli olan ise süspansiyon hücrelere RT az 5 dakika fiksasyon gerektirir.
Biz bu boyama hemen genellikle yüksek eşiğe sonuçları -20 ° C sabit slaytlarını depolamak daha iyi sonuçlar veren bulabilirsiniz.
- Her biri için 5 dakika hücreler PBS ile iki kez yıkayın.
- % 0.1 5 dakika RT Triton-X 100 hücreleri Permeabilize.
Tween-80 ile karşılaştırıldığında genellikle Triton-X 100 ile permeabilize hücrelerin daha iyi sinyaller gözlemliyoruz. Hücre tipine bağlı olarak permeabilisation saatini değiştirmek için gerekli olabilir. Örneğin 15 dakikalık bir permeabilization yapışık hücrelere gerekli ise, K562 hücrelerinde permeabilization RT az 5 dakika yeterli.
- Her biri için 5 dakika hücreler PBS ile üç kez yıkayın.
- RT 30 dakika (3 x 10 dakika)% 1 BSA hücrelerin engelleyin.
Biz engelleme verimliliği serum (sekonder antikor olarak aynı türün türetilmiştir) ve PBS sığır serum albumin kullanılarak karşılaştırıldı. BSA serum göre sekonder antikor non-spesifik bağlanma en aza indirerek daha verimli oldu. Biz bir gecede 4 engelleme, farklı engelleme kez karşılaştırıldığında ° C 3 x 10 dakika ve 3 x 20 dakika oda sıcaklığında engelleme adımları ve 3 x 10 dakika süreyle bloke en uygun olduğu belirlenir.
- Her bir slayt: 50 mcL primer antikor (500% 1'lik BSA ile seyreltilmiş 1) ekleyin.
Bir gecelik inkübasyon kıyasla azaltılmış arka plan boyama 60 dakika sonuçlar için RT primer antikor ile Kuluçka 4 ° C
- Aynı anda farklı türleri (örneğin, bu örnekte, fare ve tavşan anti-γH2AX anti-metil H3K4) yükseltilmiş antikorları farklı belirleyicileri leke kullanın.
- 90 dakika için 250 rpm'de sallanan platform üzerinde RT primer antikorlar ile inkübe edin.
Tüm inkubasyon nemlendirilmiş bir boyama çukurda yapılır.
- Her biri için 5 dakika hücreler PBS ile üç kez yıkayın.
- 50 mcL ekleyin (1: 1000% 1'lik BSA ile seyreltilmiş) ikincil antikor her slayt.
D ile aynı slayt üzerinde farklı belirteçleri leke sekonder antikorlarifferent türlere göre (primer antikor göre) ve floresan emisyon dalga boyu (örneğin anti-fare Alexa 488 (yeşil) ve bu örnekte anti-tavşan Alexa-546 (kırmızı)).
- Hücreleri, 250 rpm'de sallanan platform üzerinde RT 60 dakika inkübe edin.
Solma ve ikincil antikor kurumasını önlemek için bir karanlık nemli odasında hücreleri inkübe tavsiye edilir.
- Her biri için 5 dakika hücreler PBS ile üç kez yıkayın.
- Her bir slayt (PBS içinde seyreltilmesi 1:500) TOPRO-3 50 mcL ekleyin.
- 3X 5 dakika PBS ile slaytlar yıkayın.
- Slaytlar aşırı neme kaldırın ve anti-solmaya çözüm ekleyin.
Bu hücreler tamamen anti-solmaya çözüm eklemeden önce kuruması için tavsiye edilir.
- Lamel, tırnak cilası mühür ve oda sıcaklığında karanlık bir gecede slayt terk.
Konfokal özel lamelleri # 1.5 (0,16-19 mikron kalınlığında) ve net oje kullanmanız tavsiye edilir.
Slayt lamel yerleştirerek, bakım, hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için alınmalıdır.
Görüntü elde etme
- A Zeiss LSM510 Meta Konfokal Mikroskop standart GFP (yeşil, 488 nm), PI (kırmızı 543 nm) ve çok kırmızı (mavi 633 nm) lazerler kullanarak görüntüleri elde etmek için kullanılır.
Görüntüler mekansal çözünürlükte daha iyi ortaya bir konfokal mikroskop kullanılarak elde etti.
ΓH2AX odaklarının boyutu 0.5 μicrons daha düşük olabilir, Z-ekseni boyunca en az bir 0.5 μicron adım boyutu ile görüntüler elde etmek için tavsiye edilir.
63 x immersiyon yağı objektif lens daha yüksek veya daha düşük bir büyütme göre tercih edilir. Sayma odakları için görüntüleme birçok hücre için bir tarama hızı ve 1024 x 1024 piksel görüntü boyutu 8 kullanmak için tercih edilir. 6 kişilik bir tarama hızı 2048 x 2048 piksel görüntü boyutu ile kullanılması tavsiye edilir farklı nükleer proteinler arasındaki mekansal ilişkiyi göstermek için.
Birden fazla kanal görüntüleme line-scan satın alma, bir çerçeve tarama göre tavsiye edilir. Bu beyazlatma önler ve daha iyi çözünürlük elde edilir. Sıralı tarama yoluyla kanallar arasında kanama önlemek için kullanılır.
Odaklar sayım
Görüntü analizi ve odaklar sayma, çeşitli yazılım paketleri (Metamorph, Resim-J ve Imaris inlcuding) kullanılarak yapılabilir. Metamorph kullanarak odakları sayma için prosedürü burada açıklanmıştır.
- Dosya menüsünde doğrudan veya yapı numarası yığınlarının seçeneğini kullanarak açın γH2AX görüntü yığınları.
- Süreç menüsüne gidin ve yığın aritmetik seçti.
- Maksimum projeksiyon seçti ve dahil edilecek uçakların seçin ve Tamam'ı tıklatın.
- ΓH2AX Tiff olarak ortaya çıkan görüntü kaydetme. TOPRO-3 (mavi), resim dosyası ve açın.
- Bölgelere gidin ve bir bölge çizim aracı seçin ve çekirdekleri etrafında bölgelerde çizin.
- ΓH2AX Tiff resmin üzerine tıklayın ve süreç menüsüne gidin ve morfolojik filtreler seçin.
- Top-Hat seçti ve kaynak görüntü olarak γH2AX görüntü seçin.
- Uygula Top-Hat filtresi ve sonuçta elde edilen görüntü odakları yoğunluğu daha az gürültü ve daha az varyasyon ile ikili bir görüntü olacak.
Top-Hat değerleri seçerken dikkatli olmalıdır. Optimal değerler filtreler uygulayarak önce ve sonra görüntüleri görsel karşılaştırılması ile elde edilebilir.
- Süreci menüsüne gidin ve eşik görüntü seçin.
- Dahil eşiği seçin ve alt ve üst eşik değerleri seçin.
Genellikle odakları sayısını etkiler eşik değerleri. Bu nedenle, eşik değerleri seçerken çok dikkat gereklidir. Bu en iyi 2 Gy γ-radyasyon daha düşük maruz kalan hücrelerde farklı eşik değerleri kullanarak sayma odaklar numarası elde etti ve daha sonra manuel sayma (göz) ile odaklar sayıları karşılaştırmak olabilir. Optimal eşik değeri, arka plan dahil en aza indirir ve odaklar dahil en üst düzeye çıkarır biridir.
- TOPRO-3 görüntü seçin ve bölgeler menüsüne gidin ve transfer bölgelerde seçeneğini seçin. TOPRPO-3 kaynağı olarak görüntü ve Top-Hat gibi bir hedef seçin ve Tamam düğmesini tıklatın.
- Bir kere nükleer bölgelerde önlem menüsüne gidin ve Entegre morfometrisi Analizi seçin Top-Hat görüntü aktarılır.
- Alana göre pop-up pencere seçeneğini seçin kaynak görüntü-Top-Hat ve ölçü.
- Bütün bölgeler ölçmek seçin ve önlem Top-Hat görüntü ilgili çekirdeğinin tüm odakları numarası almak için tıklayın.
- Her bölgede odaklar numaraları günlük veri seçeneğini kullanarak bir MS-Excel dosyası içine ihraç edilebilir.
3Dgörüntüleri yeniden
Metamorph kullanarak yığından bir 3D görüntü oluşturmak için:
- Yığını menüsüne gidin ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon seçin.
- Dönme açısı (örneğin 160 °, 320 °) seçin.
- 3D rekonstrüksiyon tip maksimum seçin.
- Dönme düzlemi (yatay veya dikey) seçti.
- Z-kalibrasyon mesafe seçti.
(Optimal 0,5 μicrons) Z mesafe belirtilen kullanıcı için tercih edilir.
- 3D yeniden oluşturmak için Tamam'ı seçin.
Hat tarama analizi
Metamorph kullanarak hat tarama analizi için:
- Tek bir düzlemde görüntü veya yığılmış bir dosya açın.
- Ölçmek araç çubukları komutu gidin ve line-scan analizi seçin.
- Hücre arasında bir çizgi çizin ve bu hattı, yol boyunca otomatik olarak her marker floresan ve mesafe ortaya koyacaktır.
Çeşitli kromatin belirteçlerin mekansal ilişki aydınlatmak için, örneğin, γH2AX odakları ve histon metilasyonu, bu belirteçler yoğun ve yoksul bölgelerde yayılan çizgiler çizmek için tercih edilir.
Temsilci Veri
Bu gösteri amaçla aktif ökromatin transkripsiyonu epigenetik belirleyici DSBs mekansal dağılımını değerlendirmek, γH2AX odakları ve H3K4me antikorlar kullanılır. 2Gy ile ışınlama aşağıdaki Şekil 1'de gösterildiği gibi, γH2AX odakları H3K4me hem boyama ve TOPRO-3 leke DNA (parlak boyanan DNA bölgeleri heterokromatin göstergesi) donuk olan bölgelerde ağırlıklı olarak kurdu.
Iyonlaştırıcı radyasyon yanıt ökromatin ağırlıklı olarak Şekil 1. γH2AX odakları formu. Insan erythroleukemic K562 hücrelerinde γH2AX odakları (yeşil) (A) İmmünofloresan görselleştirme, γ-ışınlama 1 saat sonra (2 Gy). γH2AX odakları aktif ökromatin (kırmızı) transkripsiyonu temsil eden, H3K4me ilgili gösterilmiştir. DNA TOPRO-3 (mavi) olarak etiketlenir. Birleştirilen görüntünün (mavi, kırmızı ve yeşil) heterokromatik bölgelerden dışlama γH2AX odakları göstermektedir. Line-scan analizi (floresan vs mesafe), tek bir düzlemde belirteçlerin göreceli bir dağılım gösterir. (B) Birleştirilen görüntünün 3 boyutlu rekonstrüksiyon farklı düzlemlerde Dilimleri yukarıda anlatılan.