Hücreler stellat Yedi Adımda

Özet

Burada fare karaciğer hepatik stellat hücrelerin izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Stellat hücre saflaştırma için, fare ciğeri sindirilir In situ Ve In vitro Yoğunluk gradiyenti santrifüj önce pronase kollajenaz tedavi. Bu teknik son derece saf hepatik stellat hücreler elde edilir.

Özet

Karaciğer yıldız gibi morfoloji stellat hücreleri, karaciğer yerleşik hücreleri ve karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ve ^{hepatositlerde} 1,2 arasında Disse bir boşluk bulunmaktadır . Stellat hücreler, kemik iliği öncüleri türetilen ve toplam vücut A ^{vitamini 1,} 2% 80 kadar mağaza vardır . Stellat hücrelerin aktivasyonu üzerine, böylece karaciğer fibrozu ³ katkıda miyofibroblastlar içine ekstraselüler matriks üretmek için ayırt. Sözleşme yeteneklerini dayanarak, miyofibroblastik stellat hücreleri, portal ^{hipertansiyon} 4 ile ilişkili vasküler tonunu ayarlayabilir . Son zamanlarda, hepatik stellat hücreler güçlü antijen sunan hücreler ve NKT hücrelerinin yanı sıra, geleneksel T lenfositleri ⁵ etkinleştirebilirsiniz gösterdi.

Burada, fare karaciğer hepatik stellat hücrelerinin etkin bir şekilde hazırlanması için bir yöntem mevcut. Perisinüzoidal yerelleştirme nedeniyle, hepatik stellat hücreler izolasyonu çok adımlı bir süreçtir. Stellat hücreler Disse uzay izolasyon erişilebilir kılmak için, fare ciğeri, sindirim enzimleri Pronase E ve kollajenaz P. ardından perfüzyon ile in situ perfüze olan, karaciğer doku Pronase E ve kollajenaz P ile ek enzimatik muameleye tabi tutulur in vitro. Daha sonra, bu yöntem büyük miktarda A vitamini depolama hepatik stellat hücreler lipid damlacıkları yararlanır. Bu özellik,% 8 Nycodenz degrade santrifüj diğer karaciğer hücre tipleri stellat hücrelerin ayrılmasını sağlar. Burada açıklanan protokol stellat hücreler son derece saf ve homojen bir nüfus verir. Hazırlıkları Saflık floresan mikroskobu veya flow sitometri analizi öncesinde marker molekül glial fibriller asidik protein (GFAP), boyama ile tespit edilebilir. Ayrıca, ışık mikroskobu, yüksek miktarda lipid damlacıklarının limanı yıldız şeklinde hepatik stellat hücreler benzersiz bir görünüm ortaya koymaktadır.

Birlikte ele alındığında, biz temsilcisi morfolojik görünüm görüntüleri ve stellat hücre varlık tanımlamak için yardımcı GFAP ifade de dahil olmak üzere hepatik stellat hücreler, verimli izolasyonu için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Protokol

C57BL / 6 fareler ~ 20 hafta veya daha büyük yaş kullanılmalıdır. 25-30g ağırlığındaki erkek farelerin kullanılması tavsiye edilir. Stellat hücrelerin hücre izolasyonu stellat önce 2 ay süreyle fareler A vitamini ile zenginleştirilmiş diyet beslenme verim artırılabilir. Balb / c farelerinde stellat hücreler verimi oldukça yüksek iken, yaklaşık 2x10 ⁵ hepatik stellat hücreler, bir C57BL / 6 fare karaciğer arınmış olabilir. Aşağıdaki protokolü 5 farelere ayarlanır. Hayvan bakım ve deney onaylanan Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu protokolleri uyarınca yapıldı.

1. fare ciğeri in situ perfüzyon sindirim enzimleri

1. 37 ° C su banyosunda SC1 tampon ve enzim perfüzyon çözümleri ısıtın.
2. Kanatlı bir infüzyon peristaltik bir pompa silikon tüp üzerine monte edin.
3. PBS ile pompa karaciğer in situ perfüzyon için kullanılacak olan akış hızı 6.5ml/min, laminer akış elde etmek için kalibre edin. SC1 çözümü ile silikon tüp dengelenmesi.
4. Ketamin (90 mg / kg) ve Xylazine çözümü ve derin bir uyuşturma sağlamak için reflekslerin kaybı için test (10 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi.
5. Uygun bir kaide üzerinde yatar pozisyonda fare sabitleyin.
6. Karın deride uzunlamasına bir kesi yapmak ve periton maruz makas ve forseps kullanın.
7. Periton dikkatlice açın ve portal ven göstermek için karın boşluğunun sol tarafında hayvan bağırsaklarında dışına taşımak.
8. Portal ven içine infüzyon kanülü takın. Bu adım için, bir stereomikroskopta kullanılması tavsiye edilir.
9. 30ml SC1 çözümü ile karaciğer perfüzyon başlayın. Vena kava inferiyor akışını başlatmak hemen sonra açın. Başarılı kızarma karaciğer, karaciğer doku renk kaybı ile gösterilir.
10. 30ml Pronase E çözümü ile karaciğer serpmek. Başarılı sindirim üzerine, karaciğer loblar şişmeye ve lobülleri kapsül ile farklı görünecektir.
11. 30ml kollajenaz P çözümü ile karaciğer serpmek. Bu noktada karaciğer şeklini kaybetmiş ve atonik ve şekilsiz görünüyor.
12. Diyafram ve çevre organların dikkatle karaciğer ayrı ve 70ml SC2 çözüm buz üzerinde saklayın.
13. Ek fareler için prosedürü tekrarlayın.

2. Fare ciğeri in vitro sindirim

Ilave bütün adımlar bir laminer akış kaputu steril koşullar altında yapılmalıdır.

1. Ciğeri keskin bir makas kullanarak yaklaşık 2x2x2mm ³ parçalar halinde kesin.
2. Pronase E-kollajenaz P çözüm 50ml ile karaciğer parçaları dahil olmak üzere 70ml SC2 askıya birleştirin ve DNaz I çözüm 1ml eklemek.
3. 37 20dk için ciğeri Digest ° C karıştırma.

3. Yoğunluk gradient santrifüj

1. 6 50ml Falcon tüpler içine 70μm hücre süzgeçler ile hücre süspansiyonu Filtre ve SC2 tampon ile 50ml kadar ekleyin. 600g ve 4 ° C de 10 dakika süreyle Santrifüj
2. Süpernatantı dikkatlice 40ml aspirat, daha sonra her tüpe 150μl DNaz I çözümü eklemek ve hücreleri tekrar süspansiyon.
3. 4 50ml Falcon tüpler içine Havuzu hücre süspansiyonları ve GBSS-B, santrifüj, 600g ve 4 10 dakika süreyle yıkayın ° C
4. Pelet ve her tüp eklemek 150μl DNaz I çözüm rahatsız etmeden dikkatlice aspire kadar mümkün olduğunca süpernatant. 10ml tüp başına GBSS-B hücre pelet yeniden süspanse edin.
5. Havuz 2 50ml Falcon tüpler içine hücre ve tüp başına 36ml toplam hacmi GBSS-B. Her bir tüp 14ml Nycodenz çözümü ekleyin ve iyice karıştırın.
6. Toplam 10 tüp sonuçlanan hücre süspansiyonu, 10ml 12ml degrade santrifüj tüpü içine aktarın. 1.5ml GBSS-B için tüp yavaşça hücre süspansiyonu kaplaması.
7. 1500g ve 4 15dk için gradyanlar Santrifüj ° C frensiz. Daha sonra ise stellat hücreleri, beyaz bir halka olarak interfaz bulunan, hepatositler tüpün alt kısmında pelet olacaktır.
8. Stellat hücreler içeren interfaz dikkatlice hasat ve GBSS-B ile yıkayın; 600g ve 4 santrifüj 10dk ° C
9. Süpernatantı aspire ve% 10 ısı inaktive FBS,% 1 Penisilin / Streptomisin, 2mm L-Glutamine, 1mm sodyum piruvat ve 10mM Hepes ile desteklenmiş 20ml DMEM hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin. 2x10 ⁴ hücre / cm ² 'lik bir konsantrasyon hücrelerin doku kültürü şişeler içine aktarın. 37 ° C ve% 5 CO ₂ hücreleri inkübe edin.
10. Medya hepatik stellat hücreleri kısa bir süre (yaklaşık 2 saatlik hazırlıktan sonra) yapışık ölü hücreleri ve hücre artıkları yıkayın olarak değiştirin.
11. Ertesi gün, stellat hücres perinükleer A vitamini depolama lipid veziküller ile karakteristik yıldız şeklinde morfoloji geliştirmelidir.
12. Sonraki deneyler için, hepatik stellat hücreler Accutase, örneğin hafif bir enzimatik çözümlerini kullanarak kaplı olmayan plastik yüzeylere kolayca ayrılabilir

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Sağlanan protokolü kullanılarak hepatik stellat hücreler hazırlanmasını takiben, izole nüfusun saflık glial fibriller asidik protein yıldıza benzer şekil, perinükleer lipid damlacıkları ve anlatım (GFAP gibi bu hücre tipi üç temel özellikleri göz önüne alınarak test edilebilir .) Hücre izolasyonunu takiben hepatik stellat hücreler 2s karakteristik bir görünüm yanı sıra, in vitro kültüründe 1 ve 3 gün Temsilcisi resimler Şekil 1'de tasvir edilmektedir . Şekil 2, hepatik stellat hücreler, hücre izolasyonu takiben 3 gün süreyle kültüre GFAP için bir temsilci immünofloresan boyama gösterir. Hepatik stellat hücreler in vitro kültür sırasında miyofibroblastik hücrelerine ayırt . Bu aktive stellat hücrelerin karakteristik damgasını alfa düz kas aktin (αSMA) ifadesidir. Şekil 3 in vitro kültüründe gün 7 stellat hücreleri aktive ASMA ve miyozin IIA immünofloresan boyama gösterir .

Şekil 1 hepatik stellat hücreler karakteristik morfolojisi. Stellat hücreleri kullanarak fare ciğeri sağlanan protokol izole edildi. Görüntüleri stellat hücreler hücre izolasyonu sonra 2s (a, b) yanı sıra, günde 1 (c) ve 3 (d) in vitro kültüründe gün betimliyor . Hepatik stellat hücreler yüksek miktarda lipid veziküllerin perinükleer sitelerinde sergilerler ve in vitro kültüründe ilk gün (Büyütme 200x) sırasında kendi ayırt edici astral gibi morfoloji kazanmak .

Şekil 2 Karaciğer stellat hücreler, özellikle karaciğer GFAP ifade . Stellat hücreler, in vitro kültüründe gün 3 izole ve immunofluorescently GFAP (kırmızı) için boyandı. Hücre çekirdekleri mavi (leke Hoechst) tasvir edilmektedir.

Şekil 3. Karaciğer stellat hücreler miyofibroblastlar farklılaşırlar. 7 gün boyunca C57BL / 6 farelerinde izole hepatik stellat hücreler kültüre edildi. Daha sonra, odasına slaytlara aktarılır ve ASMA (kırmızı ile gösterilen) ve miyozin IIA (yeşil tasvir) için boyandı. Hücre çekirdekleri Hoechst (mavi) ile zıt.

SC1 Tampon
EGTA	190mg
Glikoz	900mg
Hepes	10 ml 1M stok solüsyonu
KCl	400mg
Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O	151mg
NaCl	8g
NaH 2 PO 4 x H 2 O	78mg
NaHCO 3	350mg
Fenol Kırmızı	6mg/dl
dH 2 O	1l için doldurmak
SC2 Tampon
CaCl 2 x 2H 2 O	560mg
Hepes	1M stok solüsyonu, 10ml
KCl	400mg
Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O	151mg
NaCl	8g
NaH 2 PO 4 x H 2 O	78mg
NaHCO 3	350mg
Fenol Kırmızı	6mg/dl
dH 2 O	1l için doldurmak
GBSS-A Tampon
KCl	370mg
CaCl 2 x 2H 2 O	225mg
Glikoz	991mg
KH 2 PO 4	30mg
MgCl 2 x 6 H 2 O	210mg
MgSO 4 x 7 H 2 O	70mg
Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O	75mg
NaHCO 3	227mg
Fenol Kırmızı	6mg/dl
dH 2 O	1l için doldurmak
GBSS-B Tampon
CaCl 2 x 2H 2 O	225mg
Glikoz	991mg
KCl	370mg
KH 2 PO 4	30mg
MgCl 2 x 6 H 2 O	210mg
MgSO 4 x 7 H 2 O	70mg
Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O	75mg
NaCl	8g
NaHCO 3	227mg
Fenol Kırmızı	6mg/dl
dH 2 O	1l için doldurmak
Pronase E Perfüzyon Çözüm
Pronase D	100mg (4000 PU / mg dak.)
SC2 Tampon	200ml
Kollajenaz P Perfüzyon Çözüm
Kollajenaz P	85mg (1.78 U / mg LYO)
SC2 Tampon	200ml
Pronase E-kollajenaz P Çözüm
Pronase D	50mg (4000 PU / mg dak.)
Kollajenaz P	85mg (1.78 U / mg LYO)
SC2 Tampon	50ml
DNaz I Çözümü
DNaz I	6 mg (yaklaşık 2000U/mg)
GBSS-B	3ml
Nycodenz Çözüm
Nycodenz	8g
GBSS-A	28ml

Tablo 1. Tamponlar ve hepatik stellat hücrelerin izolasyonu için gerekli enzim çözümleri. Tüm tamponları pH 7,3-7,4 ayarlanmış olmalıdır. Ayrıca, tüm tamponlar steril filtrasyon tavsiye edilir. Verilen enzimatik aktivite göre kullanılan enzim miktarı uyum önemlidir.

Tartışma

Karaciğer stellat hücreler karaciğer temel fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri düzenler. Ayrıca, stellat hücreler karaciğer bağışıklık yanıtının önemli bir bileşeni render, antijen sunan özelliklere sahip. Hepatik stellat hücreler karaciğer toplam hücre sayısı% 10-15 oluşturan rağmen, bu hücrelerin izolasyonu Disse perisinüzoidal uzayda lokalizasyonuna nedeniyle zordur.

Burada yerinde sindirim ve sonraki gradient santrifüj fare ciğeri hepatik stellat hücreler izole etmek için bas...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog No.
70μm Hücre Süzgeç	BD	352350
CaCl 2 x 2H 2 O	Sigma-Aldrich	C3306
Kollajenaz P	Roche	11249002001
DMEM	Gibco	11960
DNaz I	Roche	10104159001
DPBS	Cellgro	21-031-cv
EGTA	Fluka	3777
Fetal sığır serumu	Gibco	16000
Glikoz	Sigma-Aldrich	G7528
Gradient Santrifüj Tüpleri	Greiner Bio-One	163160
Hepes	Gibco	15630
KCL	Sigma-Aldrich	P9541
KH 2 PO 4	Sigma-Aldrich	P9791
L-Glutamine	Gibco	25030
MgCl 2 x 6H 2 O	Fluka	63068
MgSO 4 x 2 O 7H	Sigma-Aldrich	M2773
Na 2 HPO 4 x 2H 2 O	Fluka	71643
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaH 2 PO 4 x H 2 O	Fluka	71507
NaHCO 3	Fluka	71628
Nycodenz	Accudenz AG	AN7050/BLK
Penisilin / Streptomisin	Gibco	15140
Peristaltik Pompa	Cole Parmer	HV-7523-70
Fenol Kırmızı	Sigma-Aldrich	P4633
Pronase D	Calbiochem	7433-2
Silikon Tüp	Masterflex	HV-96.440-14
Sodyum Piruvat	Gibco	11360
Doku kültürü şişesi (25cm 2)	BD	353108
Kanatlı İnfüzyon Seti	Terumo	1SV27EL