Tek-geçişli transmembran etki oligomerization eğilimi (TMDS) değerlendirmek için etkili bir prosedür açıklanmıştır. E. coli muhabiri zorlanma ToxR için erimiş TMD oluşan Kimerik proteinleri ifade edilir. TMD-kaynaklı oligomerization ToxR, transkripsiyon ve muhabir protein üretimi,-galaktosidaz aktivasyonu dimerization neden olur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi
Bu makalede
Özet
Özet
Çürütülmüştür beri protein transmembran etki basitleştirilmiş görünüm olarak sadece fosfolipid bilayers çapa uzun. Birçok durumda membran kapsayan proteinler eylem oldukça sofistike mekanizmaları gelişmiştir. Membran proteinleri, yapıları ve işlevleri modüle 1-3 hangi bir yolu yapılandırılmış transmembran oligomerler oluşturan, hidrofobik heliksler ve özel direkt temas 4,5 Kadar son tercihen sulu çözelti ve sürücü protein dernek. 6,7 Bununla birlikte, transmembran proteinlerinin etki moleküler tanıma çalışmaları hala gerisinde kalıyor bu farklı moleküller arası kuvvetler karşılaştırma membran ortamda bulunan amino asitlerin dağıtım odaklandı suda çözünen bölgeler. Büyük bir engel kalır: transmembran oligomerization elde edebilirsiniz olağanüstü spesifite ve afinite rağmen, kendi dernek 8 doğrudan ölçümü zordur. Integral membran proteini fonksiyon çalışmaya uygulanan geleneksel metodolojiler inceleme altında dizilerinin doğasında çıkılmazlık engel olabilir. Transmembran etki alanlarını temsil eden sentetik peptidlerin inceleyerek elde Biyofiziksel anlayışlar yararlı yapısal içgörü sağlayabilir. Ancak, deterjan misel veya hücre zarının taklit etmek için bu çalışmalarda kullanılan lipozom sistemleri biyolojik önemi sık sık sorgulanmaktadır; peptidler, bu koşullar altında anadili gibi bir yapı benimsiyor ve bunların fonksiyonel davranış, gerçekten yerli bir membran içinde eylem türü yansıtıyor mu ? Transmembran dizilerinin doğal fosfolipid bilayers etkileşimleri incelemek üzere, Langosch laboratuar ToxR transkripsiyonel muhabiri deneyleri geliştirdi. 9 transmembran ilgi alanı periplasm ve ToxR konumu, maltoz bağlayıcı protein ile bir kimerik protein olarak ifade edilir bir rapor sunmak oligomerization düzeyi (Şekil 1).
Son on yıl içinde, diğer bazı gruplar (örneğin Engelman, DeGrado, Shai) daha da optimize ve bu ToxR muhabiri tahlil uygulanan 10-13 çeşitli ToxR deneyleri, hücre zarlarında protein-protein etkileşimleri test etmek için bir altın standart haline gelmiştir . Biz burada öncelikle Langosch tarafından geliştirilen protokoller aşağıdaki laboratuvarda yapılan tipik bir deneysel çalışma göstermektedir. Bu genellikle uygulanan yöntem E. transmembran alan öz-dernek analizi için yararlı coli, β-galaktosidaz üretim TMD oligomerization eğilimi değerlendirmek için kullanılır. TMD indüklenen dimerization üzerine, ToxR β-galaktosidaz LacZ gen up-regülasyonu neden ctx organizatörü bağlar. Kolorimetrik okuma kazandaki süreçlerin hücreleri ONPG eklenmesi ile elde edilir. Işık emici türleri o nitrophenolate (ONP) (Şekil 2) üretimini β-galaktosidaz sonuçları ONPG hidrolitik bölünme.
Protokol
1. Klonlama Hususlar
- Ticari olarak hazırlanan oligonükleotidler NheI ve BamHI kısıtlama siteleri ve 5'-fosforile ile çevrili ilgi TMD temsil pTox7 (BamHI kısıtlama sitesi 14 doğrudan sonra tek bir baz çifti ekleme laboratuvarımızda güncellenmiştir) (Şekil 3) sırayla sindirilir içine bağlandı . BamHI ve NheI. Bir örnek oligonükleotid, aşağıda gösterilmiştir:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
3 'gTMDSEQUENCEcctag5'
TMD sıra 12-24 kalıntıları (kısa dizileri muhtemelen vektör kodlanmış hidrofobik artıkları uzun olacak) olmalıdır. Sıralı kalıntı eklemeler ve ToxR TMD göreli dönme birlikte kalıntı silmeler. 15,16....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
ToxR transkripsiyonel muhabiri tahlil oligomerize potansiyeline sahip transmembran dizileri tanımlamak için uyduruk bir yoludur. Bakteriyel iç zarı içinde meydana gelen etkileşimler olduğundan, bu testte membran-mimetik ortamlarda eğitim sistemlerinin geçerliliği ile ilgili konular circumvents. Paralel olarak tek bir plazmid birden çok TMDS klonlama kolayca yapılabilir ve tüm testi 96-plaka biçiminde yapılabilir göz önüne alındığında, bu testte yüksek verimlilik analizi için çok sayıda protein dizileri kullanılan bir
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz, Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R21CA138373 teşekkür ediyor ve bu çalışmanın finansal destek Kanseri (SU2C) Stand Up. HY, Amerikan Kanser Araştırma, Sidney Kimmel Vakfı Kimmel Scholar Ödülü Derneği, 2009 Elion Ödülü için minnettar Kanser Araştırma (SKF-08-101) ve Ulusal Bilim Vakfı Fakültesi Erken Kariyer Ödülü (NSF0954819).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifin Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| BamHI restriksiyon enzimi | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzimler alternatif tedarikçiler daha verimli olduğu tespit edildi |
| NheI restriksiyon enzimi | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzimler alternatif tedarikçiler daha verimli olduğu tespit edildi |
| 15 ml kültür tüpleri | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC medya | Teknova | S0225 | Uygun hacmi kadar yapılan ve otoklav ile sterilize. |
| LB medya | Sigma-Aldrich | L7275 | Uygun hacmi kadar yapılan ve otoklav ile sterilize. |
| Kloramfenikol | Sigma-Aldrich | CO 3 78 | Dondurucuda saklanan etanol içinde 30 mg / mL stok çözelti |
| Arabinoz | Fluka | 10839 | Dondurucuda saklanan su,% 2,5 (w / v) stok solüsyonu |
| Na 2 HPO 4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH 2 PO 4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Kimyasallar | 6858-06 | |
| MgSO 4 .7 H 2 O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodyum dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-nitrofenil β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na 2 HPO 4 5.5g NaH 2 PO 4 0.75g KCl 0.246g MgSO 4 1 lt, pH 7.0 Makyaj | ||
| Z-buffer/chloroform | 200 ml β-mercaptoethanol, 2 mL kloroform, Z-buffer ile 20 ml kadar yapmak. 800 rpm'de 1 dakika için 1 dakika, santrifüj Vortex. Her plaka için taze olun. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS 10 ml Z-tampon içinde çözünmüş | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg 10 ml Z-tampon ONPG. Her plaka için taze olun | ||
| ß-mercaptoethanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoklonal antikor (HRP konjuge) | NEB | E8038S | |
| Maltoz ile Minimal medya | 1 x M9 tuzlar,% 0.4 maltoz, 1 mg / ml tiamin, 2 mM MgSO 4 | ||
| 96-düz alt plakası | Sarstedt | 83.1835.300 | |
| Levha okuyucu | Beckman Coulter | DTX880 Multimode Dedektörü | |
| Su banyosu | VWRI | 89032-204 | |
| Inkübatör Çalkalamalı | FormaScientific |
Kaynaklar
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
