Rekombinant Çözünür GM-CSF Reseptör kullanarak GM-CSF Antikor Nötralizasyon Kapasitesi tahmin Hücre Testi Sistemi

Özet

Hücre reseptör bağlayıcı tahlil reseptörlerine granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) bağlama tahmin etmek için tasarlanmıştır. Bu mükemmel tekrarlanabilirlik ile GM-CSF otoantikor çözünen GM-CSF reseptör alfa bağlayıcı biotinlenmiş GM-CSF yarışmalı inhibisyonu değerlendirmek için bize sağlar.

Özet

ZEMİN: Daha önce, biz bu nötralize kapasitesi gösterdi ama GM-CSF otoantikor konsantrasyonu otoimmün pulmoner alveoler proteinozis (PAP) ^1-3 olan hastalarda hastalığın şiddeti ile korelasyon. Akciğer GM-CSF biyoaktivite kaldırılması ^4,5 otoimmün PAP için olası nedeni olarak, PAP ile her hastada hastalık şiddeti değerlendirmek için, GM-CSF otoantikorların nötralize kapasitesini ölçmek için umut verici .

Şimdiye kadar, GM-CSF otoantikorların nötralize kapasitesi, insan kemik iliği hücreleri ya da ^GM-CSF 6-8 ile uyarılan TF-1 hücreleri büyüme inhibisyonu değerlendirerek değerlendirilmiştir. Biyoassay sisteminde, ancak sabit bir durum hücrelerin korunmasında teknik zorluklar nedeniyle farklı laboratuvarlarda verileri karşılaştırmak için güvenilir verilerin yanı sıra, elde etmek için çoğu zaman sorunlu.

AMAÇ: GM-CSF hücre reseptör-bağlayıcı-assay kullanarak hücre yüzeyinde GM-CSF reseptör bağlayıcı taklit etmek için.

YÖNTEM: Transgenik ipekböceği teknolojisi, yüksek ^saflıkta 9-13 rekombinant çözünür, GM-CSF reseptör alfa (sGMRα) için büyük miktarda elde etmek için uygulandı. Rekombinant sGMRα ipek proteinleri erimiş olmadan ipek ipler hidrofilik serizin katmanlarda yer aldığını ve böylece, biz nötr sulu çözeltileri ^14,15 ile kolayca iyi saflık koza elde edebilirsiniz. Neyse ki, GM-CSF ile bağlama için kritik olan oligosakkarit yapılar, diğer böcekler ya da mayalar tarafından üretilen dışında insan sGMRα yapılarını daha benzer.

Bulgular: sGMRα kullanarak hücre test sistemi, yüksek plastisite ve güvenilirliği ile veri vermiştir. SGMRα için bağlayıcı GM-CSF sGMRα kullanarak yeni hücre ücretsiz test sistemi nötralize aktivitesinin ölçümü için daha yararlı olduğunu belirterek, benzer bir şekilde TF-1 hücreleri kullanarak biyoassay poliklonal GM-CSF otoantikor tarafından inhibe doza bağımlı TF-1 hücre veya insan kemik iliği hücreleri kullanarak biyoassay sistemine göre GM-CSF otoantikorların.

Sonuç: GM-CSF otoantikor nötralize kapasitesi niceleme bir hücre ücretsiz tahlil kurdu.

Protokol

1. SGMRα üretimi ve saflaştırılması

1. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile insan plasenta cDNA kütüphanesi sGMRα, cDNA artırın.
2. His-tag 3 'başka bir PCR PCR Amplikon sonuna kadar 50 baz bakülovirüs polyhedrin sonu 5'-UTR dizisi ve 27 baz kodlama RGS ekleyin.
3. Çoğaltılan PCR ürününün bir plazmid pMSG1.1MG içine yerleştirin.
4. Ipekböceği PND-w1 suşu yumurta içine pHA3PIG yardımcı vektörü ile yapı psGMR/M1.1MG enjekte edilir.
5. 25 kelebekler Arka yumurtadan G0 larvaları ° C SGMRα geni taşıyan transgenik böceklerinin elde etmek için gözlerini MGFP ifade için kardeşler arasında ya da PND-w1 çiftleşme elde Ekran G1 embriyolar. <....

Tartışma

Hücre ücretsiz test GM-CSF otoantikorların mükemmel tekrarlanabilirlik ve hızla nötralize kapasitesi tahmin edilmektedir. GM-CSF otoantikorlar veya hastanın serum IgG kesirler bağlayıcı inhibisyon testi ile değerlendirildi. Veri hücre testinin bağlayıcı inhibisyonu ve TF-1 hücreleri, sırasıyla kullanarak biyoassay büyüme inhibisyonu arasında bir korelasyon gösterdi. Biyoassay yaygın olarak kullanılan, ancak farklı tesis ve biz bu yeni sistem kullanarak önleyebilirsiniz farklı zaman noktaları arasında veri karşılaştırara.......