$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Set-up
- Set-up cerrahi alanında Şek. 1A, A '. Set-up anahtar bileşenleri, iğne tutucu, Leica steromicroscope, fiber optik aydınlatma sistemi, elektrotlar ile ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistem, ısıtma yastığı ve isofluran anestetik bir buharlaştırıcı Narishige mikromanipülatör bir Eppendorf FemtoJet mikroenjektör içerir.
- Tüm aletleri, cerrahi aletler sonicating için Metriclean2 Düşük köpük çözüm kullanarak Bransonic Ultrasonik Temizleyici ile temizleyin. Otoklavlayarak araçları sterilize edin. Steril araçları sonra Germex tutulur.
- Şırınga ılık steril serum fizyolojik ve steril Laktatlı Ringer çözeltisi ile hazırlayın.
2. Anestezi
- Küçük (12cm x 20cm) anestezi kamara içinde Yeri hayvan. Buharlaştırıcı kullanarak, 1L/min (Şekil 1A, A ')% 5 isofluran anestetik ve oksijen sağlar. Özellikle, bir atma sistemi kullanarak izofluran egzoz toplamak için önemlidir.
- Hayvan solunum derin ve düzenli hale odasından çıkarın. , Burun pinching ve göz kırpma refleks testleri, tam bir anestezi sağlamak için kullanılır.
- Bir ısıtma yastığı (37 ° C) üst sırtını hamile fare yerleştirin. % 70 etanol ile silerek ilk ısıtma yastığı sterilize edilmiştir ve daha sonra steril lintless bir gazlı bez ile kaplıdır. Bir solunum tüpü ve maske (% 2.25) ameliyat sırasında izofluran sunmak aparat kullanın.
- Buprenorfin (0.1mg/kg vücut ağırlığı) subkütan boynun ense deri altına enjekte edilir.
- Derin ve düzenli nefes almayı için ameliyat boyunca hayvan izleyin. Hayvan, gasp, basık veya hızlı nefes olmamalıdır. Sığ, hızlı nefes alıp verme, hafif anestezi bir işareti olabilir, ve izofluran akışının artırılması gerekmektedir. Hayvan gasp başlarsa, izofluran akışını azaltır. Solunum durması durumunda, izofluran kapatın ve hayvan iyileşene kadar oksijen akışını artırmak. Daha düşük bir konsantrasyonda izofluran yeniden başlatın.
3. Cerrahi Hayvan Hazırlama
- Teyp, ısıtma yastığı hayvan ön ayakları ve künt forseps ile ayağın arka kısma bir retraksiyon yanıt için tekrar kontrol edin.
- Kullanarak, steril bir pamuk uçlu çubukla, karın üzerine tüy dökücü krem kalın bir tabaka (yani, Nair) yayıldı. Firma vuruş, underfur tamamen kaplanmış sağlar. Steril bir epilasyon için temiz bir bez ile aralıklı kontrol, ortalama üç dakika bekletin. Steril bir gazlı bez steril su ile ıslatın ve tüm izlerini gitmiş kadar karın silin. Su klorheksidin (yani, Stanhexidine) cildin daha temiz ve daha tekrarlayın. Karın, temiz, steril gazlı bez ile kurulayın.
- Kesi yeri, daha steril su ile takip bir klorheksidin (yani, Stanhexidine) ile sterilize edin. Karın, temiz, steril gazlı bez ile kurulayın. % 70 etanol ve temiz, steril bir pamuklu çubukla kullanarak bu adımı yineleyin.
- Steril bir gazlı bezle rahim boynuzları ameliyat sırasında çekilmiş olacak ortasında bir yarık ile karın üzerine yerleştirin.
4. İnsizyon ve Rahim Horns maruz kalması
- Rahim boynuzları göstermek için, ilk, orta hatta cilt altında soluk bir çizgi olarak linea alba bulun. Forseps kullanarak, karın duvarı uzak deri çekin ve cilt makas (yaklaşık 1 cm uzunluğunda) ile orta karın aşağıya doğru küçük, düz bir kesi kesmek.
- Kavisli bir forseps ve makas kullanarak, periton işlemi tekrarlayın.
- Üzerinde küçük bir kesi dikey yarık ile steril gazlı bez koyun ve ısınmış steril tuzlu su ile nemlendirin.
- Kesi forseps Slayt ve rahim bulun. Uterin boynuz çıkarırken forseps ile açık kesi tutun.
- Dikkatli bir şekilde birinci ve ikinci görünen embriyoları arasında rahim kavramak ve embriyolar gazlı bez üzerine çekin. Steril gazlı bez üzerine yerleştirerek uterus boynuzu her iki tarafını kaldırın ve herhangi bir rezorbsiyonlar ya da "sağlıksız" (örneğin daha küçük vücut büyüklüğü) embriyolar belirterek, embriyo sayısını. Serum fizyolojik ile rahim boynuzları Islak ve dikkatli bir rahim karın içine yarım dönüş.
5. Ventrikül içine DNA enjeksiyonu
- Cerrahi iğneler, kılcal damarları ile borosilikat mikropipetler kullanarak Sutter Flaming Mikropipet Çektirme hazırlanır (Program: ısı = 750, = 30 çekin, Vel = 90, Zaman = 150) . Iğne ucu steril bir neşter bıçak kullanarak, 45 derecelik bir açıyla yavaşça kazınıyor.
- Iğne yüklemek için, Pasteur pipetler bir alev altında dar bir çap çekti. % 0.01 metil yeşil karışık 3mg/ml endotoksin içermeyen DNA ~ 10 ul (metil yeşil boya DNA enjeksiyonları görüntülenebilmekte sağlar unutmayın). Ağızlık çizmek için yükleme pipet bağlı Dolu iğne daha sonra bir mikromanipülatör stand üzerine monte edilir ve enjektör FemtoJet'te bağlı.
- Yumurtalığa yakın embriyo ile başlayarak, dairesel forsepsenjeksiyonları bir rostral kaudal yönde gerçekleşmesini sağlayan, "yüzü ileri konumlandırılmış böylece hafifçe desidua içinde embriyo açmak için kullanılır. Aydınlatma için fiber optik ışık kaynağı, rostral bölgelerde büyük lateral ventriküller (Şekil 1B, B ') ile çevrili olan embriyonik beyin, orta hat görselleştirmek yardımcı olmak için kullanılır.
- Embriyo dairesel forseps kullanarak pozisyonda tutulur. Beyin girdiği açısı yaklaşık 45 derece olacak şekilde iğne rahim yukarıda konumlandırılmış. Mikromanipülatör, hızlı ve kararlı hareket kullanarak, iğne ucu rahim duvarına ve embriyonun lateral ventrikül içine sokulur. Enjeksiyonlar lateral ventriküller, 3. ventrikül veya sırasıyla telencephalon diensefalon ve retina, hedef subretinal alana doğru yönlendirilir. DNA lateral ventriküller içine enjekte 3. ventrikül içine akacaktır böyle erken embriyonik aşamada embriyonik beyin veziküller açık olduğunu unutmayın.
- Eppendorf FemtoJet mikroenjektör kullanarak endotoksin DNA (1-3 mcL) enjekte etmek için ayak pedalına basın. Başarılı bir enjeksiyon metil yeşil boya embriyonik beyin ventriküller boyunca yayarak kolayca görüntülenmiştir. Iğne kırılmaları önlemek için geri çekerek daha sonra yavaş yavaş kaldırılır.
6. Elektroporasyon
- Enjekte embriyonun rahim içinde (hala), annenin karın ve ısınmış tuzlu su ile iyice ıslak örten steril gazlı bez yerleştirilir. Lütfen dikkat ** membran yüzeyine tuzlu su yanı sıra verimli bir elektrik akımının geçmesine izin esastır.
- DNA enjeksiyonu takiben rahim kavrama GenePaddle elektrotlar kullanılır. 40-50V ve 50 ms beş kare elektrik darbeleri ECM8300 BTX elektroporasyon sistemi (Şekil 1C, C ') kullanarak saniyede bir darbe hızında teslim edilir.
- Enjekte / electroporated embriyo koruyucu ıslak bir gazlı bez ile örtün ve bir sonraki embriyo devam edin.
- İstenen tüm embriyoların enjeksiyon / elektroporasyon tamamlanmasından sonra dikkatli bir şekilde karın (Şekil 1D) rahim boynuzları geri itin.
- Diğer uterin horn dikkatlice çıkarın ve yumurtalık yakın embriyo yeniden başlar.
7. Sütür ve Zımbalama
- Tüm embriyolar geri rahim içinde, karın boşluğuna ~ 2-3 ml ılık tuzlu su ekleyin.
- Yarayı kapatmak için gazlı bez karın kaldırılması ve periton iki tespit başlar. Periton sütür örgülü siyah ipek satırını kullanarak başlayın. Bu genellikle zayıf ve ameliyat sonrası kanama ve enfeksiyona yol açabilir, bu işlem için sütür kullanmak için tavsiye edilmez. Sternumun en yakın periton hattı Çapa ve çapa uzak dikiş geçin. Tüm dikişler sıkı ve altta yatan organ veya cilt yanlışlıkla periton içine dikili olmuştur olun. Klip ve kalan dikiş hattı atın.
- Forseps ile dikiş hattı üzerinden çekin cilt kapalı. 9 mm Reflex ™ deri kapatma zımba, zımba dikiş hattı altında umurumda değil alarak, cilt üzerinde yara klip, ya da çok sıkı cilt çekin. Tercih edilen yöntem, forseps ile vücuttan deri ve uzak tutun ve zımba aracı ile 90 derecelik bir açıyla gelir. Yara kapanana kadar devam edin (yaklaşık üç zımba). Bittiği zaman, zımba yavaşça dikiş aracı (Şekil 1D) ile birlikte basarak sıkı olduğundan emin olun.
8. Post-cerrahi Bakımı
- Anestezik kurtarma izlemek için, kadın midesinin üzerine çevirin ve kapalı izofluran açmak. Solunum cihazı içindeki hayvanın yüz tutulması, anestezi kurtarma yardımcı olmak için% 3 oksijen açmak. Hayvan hipotermi önlemek için ısıtma yastığı üstüne temiz, kuru bir gazlı bez konulmalıdır.
- Hayvan sersemlemiş olsa da, hayvanın boynuna cilt altında subkutan 2 ml Ringer solüsyonu enjekte edilir.
- Hayvan canlandırmak amacıyla birkaç dakika ve ısınma gazlı bez için oksijen akışı altında hayvan tutarak devam edin. Normal bir solunum paterni döner hayvan hareketinin Kısa hamlelerle dikkat edilmelidir. Hayvan bilinçli ve uyanık görünene kadar birkaç dakika süreyle uyun.
- Kadın Gentamisin sprey ile karın Sprey ve hayvan steril bir gazlı bezle sarın.
- Hayvan otoklavlanmış yatak ve karton konut ile steril bir kafes içine aktarın.
- Su şişeleri iyice temizlenir, steril ve steril su ile dolu olmalıdır. Su için 500 mL, 2 mL sulfametazin antibiyotik (% 25 hisse senedi) ekleyin.
- 0.05 mg / kg buprenorfin subkutan sabah cerrahi sonrası yönetme.
- Kadın ameliyat sonrası ilk 24 saat için yakından izleyin. Hayvanların 24 saat daha uzun süre tutulur, kadınlarda yeni ster taşınır2 gün ile kafesleri.
9 - Temsilcisi Sonuçlar
Neokorteks
Neokorteks, görsel ve sensorimotor işleme ve daha yüksek bilişsel işlevler sorumlu CNS bölgedir. Sırasıyla dorsal ve ventral telencephalon türetilmiştir glutamaterjik projeksiyon nöronları ve GABAerjik internöronlar oluşur. Neokortikal gelişiminde farklı genlerin rolleri ele almak için, ya misexpress utero elektroporasyon kullanımı ya da dorsal veya ventral telencephalon 1,3,4 farklı genler ifade bloğu (yani, shRNA yapıları kullanımı yoluyla). Embriyonik telencephalon genler misexpress için, biz, bir CMV βactin organizatörü geliştirici ve bir iç ribozom giriş yeri (IRES) gelişmiş yeşil flüoresan protein içeren bir bicistronic ifade vektör (pCIG2) kullanımı (EGFP; pCIG2) kaset, transfekte izin hücreleri Epifloresans (Şekil 2A-C) tarafından tespit edilmesi. Biz E11.5 E15.5 (Şekil 2 gösterildiği gibi veri E12.5) telencephalon ifade yapıları tanıtmak için bu teknolojiyi kullandı. Embriyolar birkaç gün sonrası elektroporasyon geliştirmek izin vererek, GFP etiketli atalarıdır farklılaşma ve göç takip edebiliyoruz. Farklılaşması devam ederken, 3 gün, post-elektroporasyon GFP + hücrelerin ayırt etmek ve ventriküler zon (vz), subventricular bölgesi (SVZ) ve ara bölge (iz) ve kortikal plaka (cp; Şekil 2C) içine dışına göç . , Bazal atalarıdır (yani Tbr2; E12.5 az electroporated 24 saat sonra beyinleri analiz yapıyorsanız, biz progenitör olgunlaşması ve nöronal göç apikal atalarıdır belirteçleri ile birlikte-etiketleme (Şekil 2A, yani Pax6) tarafından önceki olaylar izleyebilir; Şekil 2B) ve postmitotic neokortikal nöronların (yani, Tbr1 Şekil 2C).
Diencephalon
Hipotalamus, endokrin ve otonom sinir sistemi arasında bir ağ geçidi olarak merkezi sinir sistemi ve işlevleri ventral dibinde yatıyor. Gelişimi sırasında, olgun hipotalamus makyaj çoklu çekirdeklerin ortak bir progenitör bölgesi ayırt embriyonik diensefalon ventral en bölge bu satırları. Şu anda, progenitör hücre çoğalması, nöronal farklılaşma ve hipotalamik çekirdeğinin oluşumunu düzenleyen moleküler yollar tam olarak anlaşılamamıştır. E12 embryos.We 3. ventrikül içine DNA enjekte edilerek embriyonik diensefalon muhabiri gen ekspresyonu hedef utero elektroporasyon kullanılan E14 nöronların ayırt GFP dağılımı izledi. Bu metodoloji ile, başarıyla talamus, pre-talamus ve hipotalamus (Şekil 3A), GFP ifade hedeflediğiniz. Koronal bölümleri Analizi başarıyla GFP ifade progenitör hücrelerin hedef olduğunu ortaya koymaktadır 3. ventrikül ve nöronların çekirdekleri oluşturmak için manto bölge dışına göç hattı ventriküler bölgesi (Şekil 3B)
Retina
Retina gözün sinir tabakası, beyne iletilen elektrik impulsları ışık fotonları dönüştürmek için sorumludur. Bu embriyonik diensefalon outpocketing olarak gelişir ve bu nedenle, nöral tüp türetilmiştir. Nöral retina subretinal alan, baş mezenşimin göz ayıran boşluğuna bitişik yatıyor apikal progenitör bölmesi geliştirir. Bu nedenle retina atalarıdır DNA yapıları Hedefleme küçük bir hedef alana bu enjeksiyonları yapılır gerektirir. Mikromanipülatörler kullanarak, başarılı bir şekilde (Şekil 4 gösterildiği mCherry muhabiri ile PCIC E15.5 electroporations) E13.5 E15.5 için embriyolar bu küçük bir alanda hedef başardık. ; Electroporated retinae 24 saat sonrası transfeksiyon incelendiğinde ise, en mCherry + hücreleri dış neuroblast bölünmesi atalarıdır bulunmaktadır katmanı (onbl), ve retina ganglion hücre tabakası (inset görüntü GCL) bulunmaktadır gözlemlemek postmitotic hücreleri yerelleştirilmesine.
Şekil 1. Utero elektroporasyon set-up ve metodoloji Giriş (A), cerrahi set-up anahtar bileşenleri bir Eppendorf FemtoJet mikroenjektör (1), iğne tutucu (2) Narishige mikromanipülatör, Leica steromicroscope (3), fiber optik aydınlatma sistemi (4), elektrotlar (5) ve ısıtma yastığı (6) ile ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistemi. (A ') hayvan isofluran anestetik bir buharlaştırıcı kullanılarak anestezi. (B, B ') Kısaca, anestezi sonra, rahim boynuzları maruz kalan ve hızlı yeşil karışık DNA embriyonik beyin veziküller içine enjekte edilir. Başarılı bir enjeksiyon hızlı yeşil boya (B ') takip ederek görüntülenmiştir. DNA başarıyla enjekte edildikten sonra (C, C '), rahim, positi iki tarafında, kürek elektrotlar yerleştirilirDNA seçim beyin bölgeye pozitif kutbu doğru çekilecektir, böylece embriyo oning. (D, D ') istenilen tüm embriyolar enjekte sonra, rahim karın (D) içine itilir, periton sütüre edilir ve deri (D zımbalanmalı'). Hamile kadın daha sonra kurtarmak için izin verilir ve electroporated yavrular istenilen zaman noktalarda toplanmaktadır.
Şekil 2. PCIG2 ile E12.5 electroporated bir E13.5 dorsal telencephalon aracılığıyla koronal bölümünün dorsal telencephalic elektroporasyon Temsilcisi örnek (AC) yüzey elde. Electroporated GFP + hücreler apikal atalarıdır belirteçleri ifade analiz (Pax6 +, kırmızı, A), bazal atalarıdır (Tbr2 +, kırmızı, B) ve postmitotic nöron (Tbr1 +, kırmızı, C). cp, kortikal plaka; SVZ, subventricular bölge, vz, ventriküler bölge.
Şekil 3. Diensefalik elektroporasyon Temsilcisi örnek (A) pCIG2 ile E12 electroporated olmuştur, E14 beynin ventral görünüm. GFP Epifloresans talamus görünür, ön-talamus ve hipotalamus, 3. ventrikül boyunca plazmid microinjected pCIG2 yayılmasını gösteren. Electroporated beyin ile koronal bölümünde (B) yüzey elde GFP göç gösteren + ventrikül bölgesi ve hipotalamik çekirdekleri oluşturacak manto bölgesi, içine hücreleri. 3V, üçüncü ventrikül; T, talamus; Hy, hipotalamus, mz, manto bölge; Telefon, telencephalon; Pret, prethalamus; vz, ventriküler dilimi.
Şekil 4. Retina elektroporasyon Temsilcisi örneğidir. MCherry + hücrelerin dış neuroblast tabakası birikimi gösteren E15.5 PCIC ile electroporated bir E16.5 göz ile koronal bölümünde değil Brn3b + retina ganglion hücrelerinin ganglion hücre tabakası. Içerlek kutulu alanda daha yüksek bir büyütme görüntü. GCL, retina ganglion hücre tabakası, le, lens; onbl, dış neuroblast katmanı; yeniden, retina.