Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

Özet

Bu yöntem kalp fonksiyonel bağışıklık hücrelerini izole etmek için, bu hücrelerin azalmış yanıt ile sonuçlanan istenmeyen bağışıklık hücre aktivasyonuna neden olur kollajenaz sindirim, geleneksel yöntemlere alternatif sunuyor. Izolasyon yöntemi, enzimatik sindirim ile ilgili sorunlar kaçınarak fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücreleri elde edilir.

Özet

Kardiyak bağışıklık hücreleri, birçok kalp hastalıkları patolojik remodeling oynadıkları roller için faiz kazanıyor mast hücreleri, T hücreleri ve ^makrofajlar 1-5 Bu bağışıklık hücreleri, depo ve sitokinler ve dahil olmak üzere çeşitli biyolojik olarak aktif mediatörlerin serbest triptaz olarak proteazlar ^6-8 Bu aracılar, ekstraselüler matriks metabolizmasında anahtar oyuncular matriks metalloproteinazların aktive veya modüle kardiyak fibroblastlar 'fonksiyonu kollajen birikimi neden olduğu ^{gösterilmiştir.} 9-11 Bununla birlikte, kardiyak bağışıklık hücrelerini izole etmek için uygun teknikler var miyokard doku sindirimi bakteriyel kollajenaz kullanımı nedeniyle sorunlu olmuştur. Bu teknik, bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu ve böylece fonksiyon kaybına neden olur. Örneğin, kalp mast hücrelerinin degranülasyonu neden olan bileşiklerin önemli ölçüde daha az duyarlı hale gelir. ¹² Bu nedenle, biz t sağlayan bir teknik geliştirdikalp hastalığı bu hücrelerin rolü daha iyi anlaşılmasına yol açacak fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücrelerinin izolasyonu ^{13, 14}

Bu yöntem, kalbin anatomik sıçan kılıç şeklinde süreci, koltuk altı ve orak şeklinde ligaman konumu ve perikard ile bir aşinalık gerektirir. Bu simge prosedürün başarısını artırmak ve kalp bağışıklık hücrelerini daha yüksek bir verim sağlamak için önemlidir. Bu izole kardiyak bağışıklık hücrelerini sonra, fenotip, olgunluk, ve diğer kalp hücreleri ile ko-kültür deneyler, bunların karşılıklı etkileşimi daha iyi bir anlayış kazanmak için karakterizasyonu için kullanılabilir.

Protokol

1. Hanks 'Balance Tuz Çözeltisi Hazırlama (HBSS)

1. Otoklav 1 L cam beher, 1000 mL dereceli silindir, ve bar karıştırın.
2. Çift distile su ile 900 mL işaretine otoklavlanmış 1 L cam beher HBSS toz çözüm sulandırın.
3. HBSS çözüm 3.4 g HEPES Na + tuz ile karıştırın ve 7,35-7,41 arasında bir değer ya da konsantre HCL veya NaOH kullanılarak pH ayarlamak.
4. Istenilen pH elde ve sabit kalır sonra 5 g, albümin, tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında çözüm sığır albümin serum ekleyin.
5. Toplam hacmi 1000 ml işaretine kadar çözüm antimyotic, antibiyotik ve çift distile su 10 ml ekleyin.
6. Çözümü iyice karıştırın.
7. HBSS çözüm Filtre ve daha sonra kullanmak için 50 ml Falcon tüp içine ayrı. Ek tüpler dondurulmuş ve sonraki bir tarihte kullanılabilir.

2. Hayvan preparatlarn - Trakeal Tüp yerleştirilmesi

1. (Yani forseps, makas, trakeal tüp, 3-0 siyah örgülü sütür, küçük hayvan vantilatör vb) bir trakeal tüp yerleştirilmesi için gerekli aletler ve malzeme ile bir tepsi hazırlayın.
2. Sıçan oranı 1 ksilizin 2 ketamin ketamin / xylazine bir kokteyl ile tamamen uyuşturulduktan sonra, sıçan, karın, göğüs ve boğaz tıraş. Derin bir anestezi devleti elde edildiğine emin olmak için, farenin ayak tutam ve ekstremitenin pedal çekilmesi için kontrol edin. Sıçan bütün kesiler yapmadan önce derin anestezi olduğundan emin olun.
3. 30 ° açıyla eğimli bir kesme tahtası üzerinde kaldırdı başını sıçan yerleştirin
4. Orta-karın alt çene altına bir cilt insizyonu olun. Trakea ortaya çıkarmak için boynun ön üçgen kasları parçalara ayır.
5. Trakea altında 3-0 siyah örgülü sütür yerleştirin.
6. Trakea kıkırdak halkaları arasında bir kesi olun.d trakeal tüp yerleştirin. Trakeal tüp trakea güvenli dikiş sıkıca bağlayın.
7. Küçük bir hayvan ventilatöre trakeal tüp bağlayın.

3. Bağışıklık Hücre İzolasyon Aracı Hazırlama

1. Bağışıklık hücre izolasyon işlemi için araçların (forseps, makas, HBSS, iğne hızlı cath üzerinde yumuşak teflon 24 gauge Baxter intravasküler kesilmiş) ile bir tepsi hazırlayın
2. İki 10cc şırınga hazırlayın, HBSS içeren hücreleri aspire perikardiyal kese ve yedek diğeri içine tampon tanıtmak için bir şırınga HBSS doldurun.

   3.2.1. Izolasyon prosedürü için orijinal uzunluğunun 1 / 2 3 / 4 iğne hızlı cath (1.6 cm) üzerinden 24 gauge Baxter intravasküler teflon ucu azaltın.

3. Tüm şırıngalar, tamponlar ve boş bir 15 ml Falcon Tüp (prosedür tamamlandıktan sonra çıkarılan sıvı tutmak için) buz üzerinde yerleştirin.

4. Bağışıklık Hücre İzolasyonu

1. Kılıç şeklinde bir süreç ulaşana kadar orta hat karın duvarı linea alba boyunca bir kesi yapmak.
2. Biraz yanal kılıç şeklinde bir süreç başlayarak, aksilla doğru bir açıyla devam eden göğüs kafesi ile ikili kesiler yapmak. Akciğerler, kalp, perikard ya da perfore için dikkatli olun.
3. Sternumun her iki tarafta insizyon tamamlandıktan sonra, mediale yanal kesme, alt kaburga diyafram uzak teşrih.

   Not: perikard diyafram ve zarar görmemesi için sternum bağlanır hiç farkında olun. Orak şeklinde ligaman perikard karşı tarafında diyaframın bağlı olduğu notu için bir dönüm noktası olarak kullanın. Ayrıca, perikard kesilir, hücreleri izole etme yeteneğini kaybetti.

4. , Göğüs boşluğu ve kalp (hala perikard kapsüllenir) maruz göğüs kafesi bir tarafı hafifçe kaldırın.
5. HBSS şırınga alın ve sternum ve kalp (tercihen daha fazla rostral kaudal daha) arasında yaklaşık yarım perikard kesesi içinde bir nokta bulmak ve teflon ucu takın perikard her iki katmanları ile hızlı cath kısaltılabilir.
6. Kateter yerleştirildikten sonra, 2 ila 3 ml HBBS tampon ile perikard boşluğu doldurmak hafifçe geçin. Perikardiyal alanı genişleyen gördüğünüzde kateter yerleştirilir hemen bilecektir. Dolum tanık ise, çekilme ve hızlı cath yeniden konumlandırmak.
7. Perikard kesesi dolu olduğunda, diğer 10 cc şırınga ve perikard ucu yerleştirin ve tampon aspire başlar. Aynı giriş deliği kullanılabilir ya da başka bir oluşturulabilir. Özellikle kalbin alt sağlarken, emme ucu perikardiyal kese duvarları çok yakın gelmiyor emin olun. Bu perikardiyal kese ve hücre içeren hücre kaybı delinmesiyle yol açabilirs
8. Tampon aspire ederken, kateter ucu mümkün olduğunca tampon toplamak için perikardiyal kese içinde dolaştı olabilir.

Not: Bunu yaparken biraz perikard yırtılma ve orijinal bir delik daha büyük kalp üstündeki delik, panik yapmayın . Perikard sürece hala yeterince kalp çevreleyen tampon daha az miktarda da olsa kalp üzerinde hala başka bir yıkama gerçekleştirebilirsiniz. Optimal miktarda hücre toplama, 03:57 ek yıkar ihtiyaç vardır.

9. Ayıklanan tampon buz üzerine yerleştirildi Falcon tüpler içine yerleştirin.
10. Kalp, akciğerler ve / veya daha ileri çalışmalar için gerekli olan diğer doku varsa çıkarın. Bağışıklık hücreleri ve diğer dokulara toplandıktan sonra, sıçan, hızlı ve insanca ötenazi olmalıdır.
11. 4 200g az 10 dakika ° C için toplanan bağışıklık hücre örnekleri Santrifüj Tüpler her zaman buz üzerinde tutmakKullanılmadığı zaman.
12. Hyclone Tampon veya HBSS 1 mL supernatant ve sulandırmak pelet çıkarın.

Not: bağışıklık hücre izolasyon prosedürü sonra her kalp elde edilen bağışıklık hücrelerinin sayısını çok önemlidir.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Bu toluidin mavi ve safranin O / alcian mavi ve vitray tekniği ile elde edilen izole kardiyak mast hücreleri bir örnek, 2A ve 2B rakamlar sırasıyla sunulmuştur. Şekil 3, kalp direk görülebileceği gibi, Morgan ve ark açıklandığı gibi bileşik 48/80 ve P maddesi olarak bilinen aktivatörleri ile tedaviden sonra histamin salınımı yeteneğini sürdürdü. CD4 flow sitometri ⁹ Temsilcisi dağılım araziler + hücreleri ve sırasıyla Şekil 4 ve 5, CD8 + hücreleri sunulmaktadır. T-lenfositler daha da tanımlanır ve bu tekniğin bir hücre popülasyonu olarak phenotyped.

Kalp bağışıklık hücre izolasyon prosedürü Şekil 1. Akış şeması.

Şekil 2 kalp mast hücrelerinin histolojik temsilcisi görüntüleri aşağıdaki gibi lekeli: (A) (B) toluidin mavi ve safranin O / alcian mavi.

Şekil 3 epikardiyal miyokard bölgeden izole edilmiş ve bileşik 48/80 (10μg/mL) ve P maddesi (10μM) ile uyarılan kalp mast hücreleri fonksiyonel çalışma.

Şekil 4 izole CD4 + hücreler, P maddesi (1:100 dilut ile etiketlenen Temsilcisi flow sitometri dağılım arazileriyon).

Şekil 5, P maddesi (1:100 dilüsyon) ile etiketlenmiş izole CD8 + hücreleri Temsilcisi flow sitometri .

Tartışma

Kardiyak bağışıklık hücrelerini izole Bu yöntem genellikle enzimatik sindirimi geleneksel bir izolasyon tekniği sırasında ortaya çıkan istenmeyen aktivasyon olmadan bunların fonksiyonları, fenotip ve olgunluk analizi sağlar. Bu tekniği ile elde edilen hücrelerin ortalama toplam sayısı sıçan kalbinde başına 400.000 civarındadır ve bu hücrelerin diferansiyel boyama ve flow sitometri analizi, T-lenfositler (~% 70), makrofajlar (~% 12) ve mast hücreleri ile karışık bir nüfus olduğunu gösterir Bu tekniğin kullanılması (~% 12...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif ve Ekipman Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Tom Hanks 'Dengeli Tuz	Sigma	H4891	Bir şişe Hanks 'Denge Tuz 1 L yapar Çözümü. Sulandırın Hanks 'Denge Tuz Çözüm prosedürünün bir parçası olarak.
Antibiyotik-Antimyotic	Gibco	15240-062
Hepes	Sigma	H3784
Sığır Serum Albumin	Sigma	A3912
250 ml Nalogene Filtre Şişe	Thermoscientific	157-0020
12 N HCl	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	6 N HCL eşit hacimlerde eklemek, deiyonizesu.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	5 N için eşit miktarda NaOH, deiyonize su ekleyin.
Çift Distile Su

Özel Ekipman Tablo:

Reaktif ve Ekipman Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
3-O Sütur İpek Örgülü	Ethicon Ürünler	SA64H
Küçük Hayvan Vantilatör	CWE Incorporated	SAR-830	Solunum hızı dakikada 40,5 nefes ayarlayın.
Konik 18 iğne	BD Biosciences	305199	Trakeal tüp olarak kullanmak için kendi orijinal boyunun 1 / 2 3 / 4 iğne kesin.
24-gauge Baxter hızlı cath kateter Teflon İpucu (iğne kaldırıldı)	Baxter	2N111	1 / 2 3 / 4 Teflon İpucu süresini azaltın.
10 cc şırınga	Fisher Scientific	14-823-16B
15 ml Falcon Tüpleri	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Soğutmalı Santrifüj	Fisher Scientific	75-004-377	Ön-cool unutmayın ve 4 ° C
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
Hemasitometre	Hausser Bilimsel	HS-LB-1483