$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Compartmentalization E18 Fetal Sıçan Kortikal nöronlar hazırlanması
Başlamadan önce, gerekli tüm medya ve reaktifler 37 ° C'ye kadar ısıtmak için önemlidir.
% 70 etanol ile silerek, kaput yerleştirilir hücreleri (örneğin, kauçuk ampuller, boru rafları, medya şişeleri, vb), ve hazırlanması için kullanılan her şeyi sterilize etmek için de önemlidir.
- E18 Fetal Sıçan Korteks iki adet (biri beyin, daha önce disseke) 1 ml buz Kalsiyum Magnezyum ücretsiz diseksiyonu tampon içeren 15 ml tüp yerleştirin.
- Son hacmi 2 ml ve% 0.125 'son tripsin konsantrasyon getirerek, diseksiyon tamponunda kortekse 1 ml% 0.25' lik tripsin-EDTA ekleyin.
- 8 dakika 37 ° C su banyosunda 15 ml tüp yerleştirin.
- Bu süre zarfında, yangın cilası 3 su bardağı Pasteur pipetler, kısırlık korumaya yardımcı olmak için bir biyogüvenlik kabini, gittikçe daha küçük açıklıklar oluşturan.
- Korteksin 8 dakika inkübasyondan sonra, DMEM korteks tripsin reaksiyon durdurmaya yardımcı olmak için% 10 FBS içeren 10 ml ekleyin.
- 2 dakika süreyle 2500 rpm'de korteks ve DMEM/10% FBS içeren 15 ml tüp santrifüjleyin.
- Biyogüvenlik kabini, vakum emme eklenmiş bir bardak yeniden süspanse kullanarak korteks süpernatant kaldırmak. Rahatsız ya da pelet çıkarmak için dikkatli olun.
- NMB 1 ml korteks pelet ve hafifçe pipetlemeyin yukarı ve aşağı ekleyin. Bu hava kabarcıkları oksidasyonu ile hücrelere zarar verebilir gibi, aşağı yukarı pipeting sırasında hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için çok önemlidir.
- Sonuna kadar steril bir kauçuk ampul takmak ve 5 kat yukarı ve aşağı pipeting korteks çiğnemek geniş açılması ile yangın cilalı yeniden süspanse kullanın, yine dikkatli olmak hava kabarcıkları tanıtmak değil. Her bir azalma açılış boyutu ile, diğer 2 cam pipetler ile bu işleme devam edin.
- Öğütme sonra 2 dakika süreyle 2500 rpm'de hücreleri tekrar santrifüj.
- Santrifüj sonra, bir kez daha süpernatantı kaldırmak ve NBM 2 ml hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin.
- 45 um hücre süzgecinden yeniden süspanse hücre çözümü Filtresi.
- Sayılır ve cihazlar içine yüklenen Tripan Mavi, hücrelerin Leke. Biz genellikle cihaz başına 20 ul hücrelerinin yükleyin.
Not: hücrelerin nihai konsantrasyonu tipik olarak 2,5 milyon hücre / ml ve 8 milyon hücre / ml arasında
Hücrelerin yükleniyor
Hücreler sayılır edildikten sonra, cihaz hücreleri yük zamanı:
- Kısırlık korumak için biyogüvenlik kabini içine NBM içeren önceden hazırlanmış cihazlar getirin.
- Vakum emiş kuyularından aşırı ortamı çıkarın. Ancak, tüm medya kaldırarak önlemek için dikkatli olmak, ana kanal bazı medya olması gerekir.
- (Diyagram gerekirse bakınız) hücrelerin 20 ul cihazın sol üst rezervuar uygulayın. Hücreleri cihazın içine akışı ve PLL tedavi yüzey eklemek.
- Yükledikten sonra, bir kuluçka hücreleri takmak için izin vermek için 10 dakika geri hücreleri içeren cihazlar yerleştirmek.
- 10 dakika sonra geri inkübatör medya ve yer cihazlar rezervuarları doldurun.