Biz enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirus nucleocapsid DNA izole süreci tanımlamak. Çözüm yakalanan son DNA ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonlar, ve yeni virüs rekombinantlar üretmek için transfections için uygun, yüksek konsantrasyon ve saflık.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Virüsler zorunlu hücresel parazitler, ve böylece kendi DNA çalışma, konak hücre kirleticiler ve DNA viral malzeme izole gerektirir. Birkaç downstream uygulamalar bu protokolü tarafından sağlanan saf viral DNA, büyük miktarlarda gerektirir. Bu uygulamalar, viral genom konak DNA kaldırılması viral dizileri için veri çıkışı optimize etmek için çok önemlidir sıralama, ve yeni rekombinant virüs suşları üretimi, plazmid ve lineer viral DNA rekombinasyon kolaylaştırır saflaştırılmış co-transfeksiyon 1,2, 3
Bu prosedür, ekstraksiyon ve enfekte hücrelerden doğrusal herpesvirus nucleocapsid saflaştırılmış DNA izole etmek için yoğunluk tabanlı santrifüj bir kombinasyonunu kullanır. 4,5 ilk arıtma adımları ekstraksiyon ve santrifüj adımları sırasında viral DNA içermediğinden ve korumak, saflaştırılmış virüs capsids izole etmek amacı hücresel protein ve DNA kaldırmak. Nucleocapsids, Lizis sonra viral DNA açıklamaları ve son iki fenol-kloroform adımları kalan proteinler kaldırmak. Çözüm yakalanan son DNA, 1.90 ortalama OD 260/280 ile, son derece konsantre ve saf. Kullanılan enfekte hücreler, viral DNA aralığı 150-800 mg veya daha fazla verim miktarına bağlı olarak değişir. Bu DNA saflık 4C uzun süreli depolama sırasında istikrarlı hale getiriyor. Bu DNA böylece ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonları ve transfections için çok uygundur.
Protokol başlamadan önce, çanak başına hücre (örneğin konfluent 15 cm çanak ortalama 8 x 10 6 PK-15 hücreleri) ve viral stokunun titresi (ortalama sayısını bilmek önemlidir. örneğin 1 x 10 ml başına 8 plak oluşturan birim). Bu protokol için uygun enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) hesaplamak için gereklidir. Örneğin 6, 5 bir İçişleri Bakanlığı Yukarıdaki viral stoğu ile PK-15 hücreleri, biri 15 cm çanak bulaştırmak için, 400 ul 3.6 ml (15 cm plaka için toplam aşılama hacmi 4 ml) orta ile viral stok ve sulandırmak.
Çoklu viral DNA preparatları aynı zamanda hazırlanabilir. Sadece ultrasantrifüjdeki rotor tarafından düzenlenen tüplerin sayısına göre eş zamanlı olarak hazırlıkları sayısı sınırlıdır (virüs başına bir adım aşağıda 3.9). Burada bir virüs için yapılıyor gibi prosedürü açıklar.
Protokol
1. İlk Gün: Viral Enfeksiyon ve Tamponlar hazırlanması
- Doku kültürü enfeksiyon hücreleri 5-10 yemekleri hazırlayın (15 cm çapında), örneğin pseudorabies virüs (PRV) veya herpes Vero hücreleri PK-15 hücreleri virüs simpleks (HSV).
- Hücreleri 95 -% 100 birleşmiş, bir (İçişleri Bakanlığı) 5-10 onları bozar. Bunu yapmak için, plaka, plaka başına 4 ml toplam hacmi virüs stok kullanılarak her aşılamak, daha sonra 37 tabak az 1 saat inkübe ° C Rock plates yavaşça her 15 dakikada bir hücre tek tabaka virüs inokulum tarafından tamamen kaplı kalmasını sağlamak için. Bu arada, bir sonraki adım için ortam sıcak.
- Bir saat sonra enfeksiyon, viral inok....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol bölümleri başlangıçta BSL4 şartlarda viral DNA izolasyonu için geliştirilmiş, ancak bu eşit olmayan BSL koşulları iyi uyum 4. yaygın DNA genomların olan alfa-herpesvirüslerinin PRV ve HSV-1, DNA izole etmek için bu protokolü kullanan kapsid bir protein ve lipid bir zarf ile çevrili içine 7,8 Bununla beraber, beta ve gama-herpesvirüslerinin ve adenovirüs, büyük olasılıkla diğer büyük DNA virüsleri doğrudan uyarlanabilir. Benzer ekstraksiyon yaygın RNA virüsleri için de kullanılır. 9.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Yazarları Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, Enquist laboratuvar ince ayar bu protokol üyeleri ve katkıları için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| Freon (1,1,2 trikloro-1 ,2,2-trifluoroethane) | Balıkçı | T178-4 | Uygun bertaraf kurallar Freon içeren atıklar için kurum ile kontrol edin, ya da görmek Mendez et al. potansiyel Freon alternatifleri. 9 |
| Faz kilit jel tüpler, Ağır 15ml kapasiteli | 5 PRIME | 2302850 | Isteğe bağlı |
| Polyallomer ultrasantrifüjdeki borular | Beckman * | 331.372 * | Kendi ultrasantrifüjdeki için uygun Select * tüpleri; bu sadece bir örnek olarak yer almaktadır |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma | I-3021 | |
| PK-15 hücre | ATCC | CCL-33 | |
| Vero hücrelerinde | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | HyClone | SH30028.03 |
Kaynaklar
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
