Kafesli bileşiklerin Fotoliz çeşitli fizyolojik aktif bileşiklerin konsantrasyonu hızlı ve yerelleştirilmiş artar üretimi sağlar. Burada, kafesli cAMP fotoliz ile kombine veya ayrışmış bir fare koku alma duyusal nöronlarda koku iletimi çalışma için Ca kafesli patch-klemp kayıtları nasıl elde göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Koku Duyu Nöronlar Cilia Kafesli Bileşiklerin Flash Fotoliz
Bu makalede
Özet
Özet
Kafesli bileşiklerin Fotoliz hızlı ve yerelleştirilmiş çeşitli fizyolojik olarak aktif bileşikler 1 konsantrasyonu artar üretimi sağlar. Kafesli bileşikler, ultraviyole ışığın bir flash kırılmış olabilir kimyasal bir kafes tarafından fizyolojik olarak inaktif hale moleküllerdir. Burada, ayrışmış fare koku alma duyu nöronlar koku iletimi çalışması için kafesli bileşiklerin fotoliz ile birlikte patch-klemp kayıtları nasıl elde göstermektedir. Reseptörlerine bağlanarak odorant siklik nükleotid kapılı (CNG) kanal 2 açılır cAMP artışına yol açan koku alma duyu nöronlar, kirpikler, koku alma transdüksiyon işlemi (Şekil 1) yer alır . Ca CNG kanallar aracılığıyla giriş aktive Ca-Cl kanalları harekete geçirir. Biz, fare olfaktör epitel 3 ve kafesli cAMP 4 fotoliz veya Ca 5 kafesli CNG kanalları ya da Ca-aktive Cl kanalları nasıl aktif hale getirmek için nöronların nasıl ayırmak </> Destek. Biz tam hücreli gerilim kelepçe yapılandırma 8-11 patch-klemp kayıtları mevcut ölçmek için alınır uncage cAMP veya Ca ultraviyole yanıp söner siliyer bölgeye uygulamak için bir flash lamba 6,7 kullanın.
Protokol
1. Enstrümantasyon
- Kafesli bileşiklerin fotolizine karşı olfaktör duyusal nöronların yanıtını ölçmek için; bir patch-clamp amplifikatörü, bir kayıt elektrodu ve bir patch-clamp amplifikatörünün kafa ünitesine bağlı bir referans elektrodu, bir dijitalleştirici, bir bilgisayar, veri toplama yazılımı, mikro-manipülatörler, bir epifloresan mikroskop, bir perfüzyon sistemi, bir titreşim önleyici masa ve bir Faraday kafesini içeren tipik bir patch-clamp kayıt sistemi ile birlikte bir flaş lambası kullanıyoruz (Şekil 2).
- Yüksek yoğunluklu bir ultraviyole (UV) ışık flaşı oluşturmak için, Xenon gazı ile doldurulmuş kısa ark flaş tüpü üzerinden yüksek voltajlı bir kapasitörün boşaltılmasıyla çalışan bir Xenon flaş lambası (Rapp OptoElectronic JML-C2 Flaş Ünitesi, Şekil 3A) kullanıyoruz6-7. Işık flaşı, elektrofizyolojik veri toplama işlemini kontrol eden aynı yazılım kullanılarak manuel olarak veya bilgisayar tarafından tetiklenebilir.
- Kafes açma (uncaging) uygulamaları için optimize edilmiş bir UV kısa geçiren filtre (270-390 nm), flaş lambasının bir çıkış yuvasına yerleştirilir ve bir kuvars fiber optik ışık kılavuzu mikroskoba bağlanır (bkz. 1.5).
- Işık flaşının yoğunluğu ve dolayısıyla fotolizin derecesi, belirli parametrelerin değiştirilmesiyle modifiye edilebilir:
voltaj veya kapasitans6. Nitekim ışık yoğunluğu, kapasitörde depolanan enerjiyle ilişkilidir ve standart 0.5 CV2 ilişkisine göre kapasitans değerine ve üzerindeki voltaja bağlıdır. Flaş lambamızın ön panelinden üç kapasitans değerinden biri seçilebilir (C1=1000 μF, C2=2000 μF veya C3=3000 μF) ve voltaj 100 ile 385 Volt arasında değiştirilerek (Şekil 3A), 5 ile 220 J arasında depolanmış enerji üretilebilir. Flaş süresi, tam yarı maksimum genişlikte 0,5 ile 1 ms arasında değişir ve seçilen kapasitans değerine bağlıdır. Farklı bir kapasitans seçmeden veya voltajı daha düşük bir değere ayarlamadan önce, flaş lambasının ön panelindeki boşaltma modunu seçerek kapasitörü boşaltmak gerekir (Şekil 3A).
Ancak, gaz boşalmalarının fiziğiyle ilgili çok yönlü nedenler ve elektriksel enerji artırıldığında devredeki lineer olmayan kayıplar nedeniyle, ışık enerjisi depolanan enerjiyle basitçe orantılı değildir6. Bir ışık flaşı ile ilişkili enerjiyi ölçmek için, RappOptoElectronics tarafından sağlanan JM10 gibi bir joulemetre kullanılabilir. Rapp OptoElectronic Flaş Ünitesinin kullanıcı kılavuzunda belirtildiği üzere, UV filtre takılıyken kuvars ışık kılavuzunun çıkışındaki enerjinin flaş başına 1-15 mJ aralığında olduğuna dikkat edin.
Flaş lambası ünitesiyle birlikte bir fotodiyot düzeneği (Şekil 3B) sağlanmıştır ve bu düzenek, ışık yoğunluğündeki değişimlerin C ve V'ye bağlı olarak tahmin edilmesi için kullanılabilir. Nitekim fotodiyodun çıkışı ışık yoğunluğu ile orantılıdır. Kullanıcı kılavuzu talimatlarını izleyerek, ışık kılavuzu fotodiyot düzeneğinin girişine bağlanırken, çıkış bir osiloskoba bağlanır. Şekil 3C, flaş lambası ünitemizde mevcut olan üç kapasitans değeri C1, C2 veya C3 için ışık flaşlarına yanıt olarak fotodiyodun tepe çıkış voltajının uygulanan voltaja karşı değişimini göstermektedir. Bu değerler flaş ampulü eskidiğinde değişecektir. Flaş ampulünün bozulmasını kontrol etmek için fotodiyodu düzenli olarak kullanmak iyi bir uygulamadır.
Ön panelden kapasitans ve/veya voltajı modifiye etmek yerine, flaş lambasının ikinci bir filtre yuvasına nötr yoğunluk filtreleri yerleştirerek ışık yoğunluğu üzerinde daha hassas ve hızlı bir kontrol elde edilir (Şekil 3A). Bu yaklaşım daha hızlıdır ve ek olarak, seçilen kapasitans değerine bağlı olan flaş süresi modifiye edilmez. %100'den %0,1 iletim oranına kadar değişen nötr yoğunluk filtreleri ile flaş yoğunluğu geniş bir aralıkta hızlıca modifiye edilebilir. - Işık flaşı, cam tabanlı kaplara ekilmiş nörona, bir kuvars fiber optik ışık kılavuzu aracılığıyla yönlendirilir (Şekil 2). Işık kılavuzu, bir adaptör kullanılarak ters mikroskobun epifloresan eklentisine bağlanır. Eksitasyon filtresi olmayan modifiye edilmiş bir filtre kübü, UV ışınını bir dikroik ayna yardımıyla nörona yönlendirir.
- Işık, 100x yağ daldırma objektif aracılığıyla odaklanır. Flaşın kapsadığı alan, ışık kılavuzunun sürekli görünür ışık kaynağı sağlayan bir aydınlatıcıya yerleştirilmesiyle görselleştirilir. Görüntü (videoda sarı ile temsil edilmiştir), mikroskoba bağlı bir CCD kamera aracılığıyla bir monitörden izlenir. Deneyler için UV flaş alanını lokalize etmek amacıyla, aydınlatılan alanın konturu monitör üzerine çizilir. UV flaşı verilmeden önce, nöronun siliyer bölgesi monitörde çizilen alana getirilir.
- UV ışık noktasının boyutu objektif büyütmesi, ışık kılavuzunun çapı ve ışık kılavuzunun mikroskobun arkasındaki konumu ile kontrol edilir. 100x büyütmeli yağ daldırma objektif kullanıyoruz. Dairesel noktanın çapı, bir aydınlatıcıdan gelen ışığın mikroskobun tablasına yerleştirilmiş bir mikrometre lamı üzerine yönlendirilmesiyle ölçülür. Kurulumumuzda nokta çapı, çapları sırasıyla 200, 400, 600 veya 1250 μm olan bir ışık kılavuzu için yaklaşık olarak 16, 33, 50 veya 105 μm'dir.
2. Çözeltilerin hazırlanması
Diseksiyon
- Ringer çözeltisi: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glikoz, 1 mM sodyum piruvat (1M NaOH ile pH 7.4'e ayarlanmış).
- Durdurma karışımı çözeltisi: 0.1 mg/ml BSA, 0.3 mg/ml leupeptin ve 0.02 mg/ml DNaseI içeren Ringer çözeltisi.
- Sıfır-divalent Ringer çözeltisi: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM glikoz, 1 mM sodyum piruvat (1M NaOH ile pH 7.4). Enzimatik disosiyasyon için 200 μM sistein ve 2 U/ml papain ekleyin.
Not: Diseksiyon için çözeltileri steril filtreleyin.
Patch-clamp kayıt çözeltileri
Hücre dışı çözeltiler
- Ekstrasellüler Ringer çözeltisi: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glukoz, 1 mM sodyum piruvat (1M NaOH ile pH 7.4'e ayarlanmış).
- Düşük-Ca Ringer çözeltisi: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glukoz, 1 mM sodyum piruvat (1M NaOH ile pH 7.4'e ayarlanmış).
Hücre içi çözeltiler
Kafesli bileşiklerin ortam ışığıyla bozunmasını önlemek için, kafesli bileşik çözeltilerini daima loş ışıkta hazırlayın ve kullanın. Kapları alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun.
Kafeslenmiş cAMP:
- 145 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgATP ve 0.1 mM NaGTP içeren (pH'ı 1M KOH ile 7.4'e ayarlanmış) bir hücre içi çözelti hazırlayın.
- Kafeslenmiş cAMP'yi (BCMCM-cAMP4) DMSO içinde 50 mM konsantrasyonda çözerek bir stok çözelti hazırlayın. 5 μl'lik alikotlar oluşturun. -20°C'de bir yıla kadar saklayın.
- 50 μM nihai kafeslenmiş cAMP konsantrasyonu elde etmek için kafeslenmiş cAMP stok çözeltisinin bir alikotunu hücre içi çözeltide çözün. Vorteks kullanarak karıştırın.
- Kafeslenmiş cAMP içeren hücre içi çözeltiden 1 ml'lik alikotlar hazırlayın. Kullanılana kadar -20°C'de iki aya kadar saklayın.
Kafesli Ca:
1.5 mM Ca ile %50 yüklü 3 mM DMNP-EDTA5 içeren hücre içi solüsyonları hazırlarız.
- 140 mM KCl (veya CsCl), 10 mM HEPES (pH değeri 1M KOH veya CsOH ile 7,4'e ayarlanmış) içeren bir hücre içi solüsyonu hazırlayın.
- 5 mg DMNP-EDTA içeren bir flakonu açın. 52,8 μl 0,1 M kalsiyum klorür standart solüsyonu ve 1 ml hücre içi solüsyonu ekleyin. Vorteks kullanarak karıştırın.
- Kafeslenmiş Ca'nın ortam ışığıyla serbest kalmasını önlemek için solüsyonu alüminyum folyo ile ışıktan korunan bir tüpe aktarın. Final hacmi 3,5 ml olacak şekilde hücre içi solüsyonu ekleyin. Vorteks kullanarak karıştırın. Kafeslenmiş Ca hücre içi solüsyonundan yaklaşık 1 ml'lik alikotlar hazırlayın ve kullanıma kadar -20°C'de iki aya kadar saklayın.
Notlar: Deneyler sırasında, kafesli bileşik çözeltilerini alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun ve buz üzerinde tutun. Hücre içi çözeltiyi steril filtreleyin.
3. Fare olfaktör duyusal nöronlarının disosyasyonu
Hayvanlar, İtalya Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Kılavuzlar (Decreto Legislativo 27/01/1992, no. 116) ve hayvan araştırmaları üzerine Avrupa Birliği kılavuzları (No. 86/609/EEC) ile uyumlu şekilde kullanılmıştır.
- 10 mg/ml concanavalin-A ve 10 mg/ml poly-L-lysin ile kaplanmış üç adet cam tabanlı kap hazırlayın.
- Diseksiyon hazırlığı için 1 ml sıfır-divalent Ringer çözeltisi hazırlayın. İki adet 50 mm Sylgard kaplı Petri kabını Ringer çözeltisi ile doldurun ve buz üzerine yerleştirin. Ayrıca bir papain-sistein karışımını, 0,5 ml stop mix çözeltisini ve yaklaşık 10 ml Ringer çözeltisi içeren 0,22 μm filtreli bir şırıngayı soğutun.
- Bir fareyi önce CO2 asfiksisi ve ardından dekapitasyon yoluyla sakrifiye edin. Kafatasının üzerindeki deriyi kaldırın, çene hatları boyunca kesin ve başı Sylgard kaplı bir Petri kabına yerleştirin.
- Kabı bir stereomikroskobun altına yerleştirin. Bir skalpel kullanarak başı orta hattan sagital olarak ikiye bölün. Başın yarısını medial tarafı yukarı gelecek şekilde çevirin. Türbinatları açığa çıkarmak için septumu dikkatlice kaldırın (ayrıca bakınız Cygnar et al., 201013).
- 3 numara pens ve bir skalpel kullanarak olfaktör epitel ile kaplı türbinatları çıkarın. Sylgard kaplı bir Petri kabına aktarın.
- 55 numara süper ince pens kullanarak, olfaktör epitel parçalarını türbinatların yapışık kısımlarından ayırın. Bunları 1 ml sıfır divalent Ringer çözeltisi içeren bir tüpe aktarın. Papain ve sistein karışımını ekleyin. Mikro makas kullanarak epitelleri ince ince kıyın ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. Mikro makasla nazikçe tekrar kıyın ve 5 dakika daha bekleyin.
- Alevle cilalanmış bir Pasteur pipeti kullanarak, 0,5 ml stop mix çözeltisi içeren bir tüpe aktarın.
- 300 g (1500 RPM) hızda 5 dakika santrifüj edin. Süpernatantı atın ve yaklaşık 1 ml filtrelenmiş Ringer çözeltisi ekleyin. Alevle cilalanmış bir Pasteur pipeti ile nazikçe triture edin.
- Hücreleri içeren çözeltinin yaklaşık 0,3 ml'sini üç cam tabanlı kabın merkezine ekleyin. Hücrelerin +4°C'de yaklaşık bir saat boyunca çökelmesini bekleyin. Ringer çözeltisi ekleyin.
4. Kayıt
- Hücre içi solüsyonla doldurulduğunda 3-7 MΩ direnç sağlayacak şekilde borosilikat kapilerlerden patch pipetleri hazırlayın.
- Disosiye edilmiş olfaktor duyusal nöronlar içeren bir cam tabanlı kabı ters mikroskobun tablasına yerleştirin. Ringer solüsyonu ile perfüzyon uygulayın.
- Kafesli bileşikler (caged compounds) içeren hücre içi solüsyonlu şırıngayı alüminyum folyo ile ışıktan koruyun ve buzdolabında saklayın. Kafesli bileşiklerin ortam ışığıyla bozunmasını önlemek için loş ışıkta çalışın.
- 100x büyütmede, silyaları sağlam olan izole bir olfaktor duyusal nöron arayın. Daha önce belirlenmiş olan UV flaş alanını lokalize etmek için mikroskop tablasını hareket ettirerek siliyer bölgeyi monitörde çizili olan dairenin içine konumlandırın.
- Esnek bir iğne kullanarak bir patch pipetini kafesli bileşik içeren hücre içi solüsyonla doldurun. Pipet ucundaki hava kabarcıklarını giderin. Pipeti, patch-clamp amplifikatörünün headstage kısmındaki tutucuya yerleştirin. Mikromanipülatörü kullanarak nöronun somasına yaklaşın ve gigaohm sızdırmazlık (gigaohm seal) sağlamak için hafif vakum uygulayın. Voltajı -60 mV olarak ayarlayın ve standart patch-clamp tekniklerini12 kullanarak whole-cell moduna geçmek için ek vakum uygulayın.
- Kafesli bileşiğin silyalara difüzyonu için en az iki dakika bekleyin.
- Bilgisayar üzerinde bir stimülasyon protokolü başlatın ve yanıtı kaydedin. 1 kHz'de bir düşük geçiren filtre (low-pass filter) kullanın ve en az 2 kHz örnekleme frekansında dijitalleştirin.
- Tipik bir stimülasyon protokolü, voltajı sabit bir değerde tutar (clamp) ve siliyer bölgedeki kafesli bileşiğin fotolizi için flaş lambasından bir UV flaş salınımını tetikler.
5. Temsili sonuçlar:
İzole bir olfaktör duyusal nöronun siliyer bölgesinde kafesle tutulmuş cAMP veya kafesle tutulmuş Ca'nın lokal olarak serbest bırakılmasını sağlayabilmeli ve tüm hücre voltaj-kenetleme konfigürasyonunda akım yanıtını kaydedebilmelisiniz.
Şekil 4, hücre dışı düşük Ca Ringer çözeltisi varlığında, -60 mV voltajda kaydedilen ve kafeslenmiş cAMP'nin fotolizini sağlayan bir UV flaşı ile tetiklenen tipik bir içe doğru akımı göstermektedir. Bu koşulda içe doğru akım, CNG kanalları aracılığıyla Na girişinden kaynaklanmaktadır. Akımın yükselme fazı hızlıdır ve 3,4 ms zaman sabiti olan tek bir üstel fonksiyonla uydurulmuştur.
Şekil 5A-B, başka bir olfaktör duyusal nöronun düşük Ca'da ve 1mM Ca içeren Ringer çözeltisindeki yanıtlarını göstermektedir. -60 mV'daki akımın yükselme fazı çok daha yavaş ve çok fazlı hale gelmiştir (Şekil 5 A-B). Bu durum, Ca'nın CNG kanalları aracılığıyla siliyalara girerek ikincil bir Cl akımını aktive etmesinin bir sonucudur10. CNG aktivasyonundan kaynaklanan daha önceki katyonik akım bileşeni, 1mM Ca Ringer çözeltisinde, toplam akımı azaltan permeasyon yapan Ca iyonlarının neden olduğu blok nedeniyle düşük Ca çözeltisine göre daha küçüktür.
Siliyal Ca artışını azaltmanın bir başka yolu da nöronu +60 mV'da sabitlemektir (Şekil 5 C-D). +60 mV'da cAMP serbest bırakılmasına bağlı yanıtın yükselme fazı, 6,7 ms zaman sabitine sahip tek bir eksponansiyel ile iyi tanımlanmış olup, bu durum yalnızca tek bir akım bileşeninin mevcut olduğunu göstermektedir.
Bir olfaktör duyusal nöronun silya içerisinde Ca'nın fotorelease yöntemiyle serbest bırakılmasıyla, hızla yükselen bir akım ölçebilmeniz gerekir. Bu akım Cl iyonları tarafından taşınır. Şekil 6 A, farklı şiddetlerdeki UV flaşlarına yanıt olarak kafeslenmiş (caged) Ca'nın fotorelease edilmesiyle -50 mV'de indüklenen içe doğru akımları göstermektedir. Ca ile aktive edilen Cl akımlarının yükselme fazı, zaman sabitleri 3,8 ile 5 ms arasında değişen tek bir eksponansiyel ile iyi şekilde tanımlanmıştır (Şekil 6 B).
Şekil 1. Koku duyusal nöronlarının siliyalarında koku iletimi. Koku molekülleri koku reseptörlerine (OR) bağlanarak bir G proteinini aktive eder; bu protein de sırasıyla adenilil siklazı (ACIII) aktive ederek hücre içi cAMP artışına neden olur. cAMP, Na ve Ca iyonlarının girişine izin veren döngüsel nükleotidle aktive olan (CNG) kanalları açar. Hücre içi Ca artışı, Ca-aktive klor kanallarını aktive eder. Kafesli cAMP veya kafesli Ca, bir patch pipeti aracılığıyla siliyalar içine difüze edilerek getirilebilir. Bir UV ışık flaşı, kafesli bileşiğin fotolizini sağlar (Pifferi et al. 2006'dan2 izinle modifiye edilmiştir).
Şekil 2. Yamaç kenetleme (patch-clamp) kayıt ve flaş fotoliz sistemi. Düzenek bileşenleri bir yamaç kenetleme amplifikatörü, bir bilgisayar, bir dijitalleştirici, bir epifloresan mikroskop, bir Xenon flaş lamba, bir CCD kamera ve bir monitörden oluşmaktadır. Mavi ve mor çizgiler sırasıyla görünür ve UV ışık yolunu belirtmektedir.
Şekil 3. Xenon flaş lambası. (A) Kafeslenmiş bileşiklerin flaş fotolizi için kullanılan ışık kaynağı. (B) Işık flaşının şiddetini değerlendirmek için kullanılan fotodiyot modülü. (C) Flaş lambasından gelen ışık kılavuzu fotodiyot girişine bağlandı ve çıkış bir osiloskop üzerinde görselleştirildi. Flaş lambasının ön panel anahtarından üç mevcut kapasitans değerinden (C1, C2 veya C3) biri seçildi ve ön paneldeki düğme çevrilerek voltaj değiştirildi. Farklı flaş şiddetlerine yanıt olarak fotodiyottan gelen çıkış voltajı, her bir kapasitans değeri için uygulanan voltaja karşı grafiğe döküldü: C1 = 1000 μF, C2 = 2000 μF veya C3 = 3000 μF. 600 μm çapında bir ışık kılavuzu kullanıldı.
Şekil 4. Düşük hücre dışı Ca çözeltisinde kafesli cAMP fotolizine yanıt olarak patch-clamp kaydı. (A) Siliyalere lokalize edilmiş kafesli cAMP'nin fotolizi ile izole bir olfaktör duyusal nöronda indüklenen tüm hücre akım yanıtı. UV flaş, okla gösterilen zamanda verilmiştir. Tutma potansiyeli -60 mV idi. (B) Akımın yükselme fazı, 3,4 ms zaman sabiti olan tek bir eksponansiyel fonksiyonla (kesikli çizgi) iyi şekilde uydurulmuştur.
Şekil 5. Düşük Ca ve Ringer çözeltilerinde kafeslenmiş cAMP'nin fotolizi ile indüklenen akım yanıtları. (A) Bir olfaktör duyusal nöron, -60 mV tutma potansiyelinde 1 mM Ca içeren Ringer çözeltisine veya düşük Ca çözeltisine maruz bırakılmıştır. Ok ile belirtilen zamanda bir UV flaşı verilmiştir. (B) Genişletilmiş zaman ölçeğinde çizilen akım yanıtları, Ringer çözeltisinde çok fazlı bir yükselme fazı gösterirken, düşük Ca çözeltisinde kaydedilen yanıt için yükselme fazı 3,5 ms zaman sabitine sahip tek bir eksponansiyel fonksiyon (noktalı çizgi) ile iyi şekilde uyuşmuştur. (C) (A)'da gösterilen aynı nörondan, -60 ve +60 mV tutma potansiyellerinde Ringer çözeltisine maruz bırakıldığında alınan akım yanıtları. (D) Genişletilmiş zaman ölçeğinde çizilen akım yanıtları -60 mV'da çok fazlı bir yükselme fazı sergilerken, +60 mV'da yükselme fazı 6,7 ms zaman sabitine sahip tek bir eksponansiyel (noktalı çizgi) ile iyi şekilde uyuşmuştur.
Şekil 6. Kafeslenmiş (caged) Ca fotolizine verilen yanıtlar. (A) -50 mV'da kafeslenmiş Ca fotolizi ile indüklenen tüm hücre akımları. UV flaşları ok ile belirtilen zamanda verilmiştir. Flaş yoğunlukları nötr yoğunluk filtreleri ile değiştirilmiştir. (B) Genişletilmiş zaman ölçeği, Ca fotosalınımı sonrası akımdaki hızlı artışı göstermektedir. Akımlar, 5, 4.8, 3.8 ms zaman sabitlerine sahip tek bir eksponansiyel fonksiyon (noktalı çizgiler) ile iyi şekilde uydurulmuştur. (Boccaccio & Menini, 2007'den10 izin alınarak yeniden üretilmiştir).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Patch-klemp kayıtları ile birlikte kafesli bileşiklerin Flash fotoliz konsantrasyonu fizyolojik olarak aktif moleküllerin hem iç ve dış hücreleri hızlı ve yerel atlar elde etmek için çok kullanışlı bir tekniktir. Kafesli compounds1 çeşitli türlerde sentezlenen olmuştur ve bu tekniğin, kültür hücreleri aktive olabilir veya bazı kafesli bileşikler 11 fotoliz tarafından modüle iyon kanalları ifade de dahil olmak üzere hücreleri, çeşitli türleri için uygulanabilir.
Kafesli bileşikleri...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ekipman | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| Mikroskop için adaptör modülü flaş lambası | Rapp optoelektronik | FlashCube 70 | |
| Hava tablo | TMC | MİKRO-g 63-534 | |
| Sayısallaştırıcı | Akson Aletleri | Digidata 1322A | |
| Veri Toplama Yazılımı | Akson Aletleri | pClamp 8 | |
| Veri Analizi Yazılımı | WaveMetrics | Igor | |
| Ayna için adaptör modülü | Rapp optoelektronik | M70/100 | |
| Elektrod tutucu | Akson Aletleri | 1-HL-U | |
| Faraday kafesi | Özel yapılmış | ||
| Filtre küp | Olympus | U-MWU | Tahrik olma filtre kaldırıldı |
| Flaş lamba | Rapp optoelektronik | JML-C2 | |
| Forseps Dumont # 55 | Dünya Hassas Aletler | 14099 | |
| Cam kılcal damarlar | Dünya Hassas Aletler | PG10165-4 | |
| Cam alt çanak | Dünya Hassas Aletler | FD35-100 | |
| Aydınlatıcı | Olympus | Highlight 3100 | |
| Ters mikroskop | Olympus | IX70 | |
| Mikromanipülatörler | Luigs & Neumann | SM I | |
| Mikropipet Çektirme | Narishige | PP-830 | |
| Izlemek | HesaVision | MTB-01 | |
| Nötr yoğunluk filtreleri | Omega Optik | değişir | |
| Amaç 100X | Zeiss | Fluar 440.285 | Ya Zeiss veya Olympus |
| Amaç 100X | Olympus | UPLFLN 100XOI2 | Ya Zeiss veya Olympus |
| Optik UV shortpass filtresi | Rapp optoelektronik | SP400 | |
| Patch-kelepçe amplifikatör | Akson Aletleri | Axopatch 200B | |
| Foto Diyot Meclisi | Rapp optoelektronik | PDA | |
| Kuvars ışık kılavuzu | Rapp optoelektronik | değişir | Biz 600 mikron çapında |
| Gümüş tel | Dünya Hassas Aletler | AGT1025 | |
| Gümüş toprak pelet | Warner aletleri | 64-1309 | |
| Xenon ark lambası | Rapp optoelektronik | XBL-JML |
| Reaktif | Şirket | Katalog numarası |
|---|---|---|
| BCMCM-kafesli cAMP | Biolog | B016 |
| Sığır serum albumini (BSA) | Sigma | A8806 |
| CaCl2 standard çözeltisi 0,1 M | Fluka | 21059 |
| Kafesli Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 |
| Sistein | Sigma | C9768 |
| Concanavalin A tipi V (CONA) | Sigma | C7275 |
| CSCL | Sigma | C4036 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| DNAz I | Sigma | D4527 |
| EDTA | Sigma | E9884 |
| EGTA | Sigma | E4378 |
| Glikoz | Sigma | G5767 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| KCl | Sigma | P3911 |
| KOH | Sigma | P1767 |
| Leupeptin | Sigma | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Papain | Sigma | P3125 |
| Poli-L-lisin | Sigma | P1274 |
| NaCl | Sigma | S9888 |
| NaOH | Sigma | S5881 |
| NaPyruvate | Sigma | P2256 |
Kaynaklar
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
