Bir Genotipik Yöntemi'ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

Summary

HIV-1 coreceptor kullanımının tahmin antiretroviral ilaçlara, örneğin coreceptor antagonistlerinin yeni bir sınıfını idaresi için gereklidir. Bu, bir dizi analizi ile yapılabilir Env gen ve sonraki yorumlanması (geno2pheno _[Coreceptor]).

Abstract

Maraviroc (MVC) coreceptor antagonistleri sınıfından ilk lisanslı antiretroviral ilaç olduğunu. Bu, insan bağışıklık hücreleri (Şekil 1) enfekte etmek için, HIV suşu çoğunluğu tarafından kullanılan ana bilgisayar coreceptor CCR5, bağlanır. Diğer HIV izolatlarının farklı coreceptor, CXCR4 kullanabilirsiniz. Kullanıldığı reseptör, Env proteini (Şekil 2) tarafından virüs olarak belirlenir. Ikinci coreceptor bağlı olarak, sırasıyla virüs R5 veya X4 olarak sınıflandırılır. MVC inhibe CCR5 reseptör hedef hücre içine R5 virüslerin girişine bağlanır. Hastalığın seyri sırasında, X4 virüsler ortaya ve R5 virüsler büyümek olabilir. EMA ve FDA tarafından talep olarak coreceptor kullanımı (ayrıca tropizm denir) belirlenmesi, bu nedenle önceki MVC idaresi zorunludur.

MVC verimliliği MOTİVE, BAŞARI ve 1029 için çalışmalara Bu sophi dayanan yüksek kaliteli bir testtir Monogram, San Francisco, ABD Trofile testi ile yapılmıştırsticated rekombinant testleri. Avrupalı ​​doktorlar değil, aynı zamanda eş zamanlı direnç testleri verin desantralize uzman laboratuarlar ile çalışmak eğilimindedir beri günlük rutin için bu test için kabul, ABD dışında oldukça düşüktür. Bu laboratuvarlar çeşitli kalite güvence değerlendirme 2011 ¹ sunulmadan sonuncusu uğramıştır.

Şimdi birkaç yıl için, HIV env-V3 gen bölgesi (V3), ² sıra analize dayalı tropizm tespitler gerçekleştirdik. Bu bölge güvenilir bir tahmin yapmak için yeterli bilgi taşır. Kısa ciro süresi (direnç testi eşdeğeri), daha düşük maliyetler, hastaların ihtiyaçlarına sonuçları uyum olasılığı çok düşük hatta saptanamayan viral yük (VL klinik örneklerin analiz olanağı: coreceptor kullanım genotipik belirlenmesi gibi avantajlar sunuyor ), özellikle bu yana VL ile analiz örnek sayısı, <1000 kopya / ml 'kabaca (Şekil 3) son yıllarda artmıştır.

Tropizm testi için ana adım (Şekil 4) bu video gösterilmiştir:

1. Kan örneği toplanması
2. Plazma ve / veya HIV proviral DNA kan mononükleer hücrelerin HIV RNA'nın izolasyonu
3. Env bölgenin Amplifikasyon
4. V3 bölgenin amplifikasyonu
5. V3 Amplikon sekans reaksiyonu
6. Dizi analizi örnekleri saflaştırılması
7. Saflaştırılmış örnekleri Sekans
8. Sıra düzenleme
9. Veri yorumlama ve tropizm tahmin Dizileme

Protocol

Protokol Şekil 'de özetlenmiştir. 4.

1. Kan numuneleri

1. Klinik yerinde EDTA tüpleri içinde en azından 3 ml kan toplanır.
2. Numuneler 4 ° C'de bir haftaya kadar saklanabilir
3. Normal posta ile kısa sürede laboratuvara mümkün EDTA-kan örnekleri gönderin.

2. HIV RNA ve / veya DNA izolasyonu

1. MagNA Pure Compact Nükleik Asit İzolasyon Ben kiti ve MagNA Pure Kompakt Sistem kullanarak, 1000 ul tam kan, serum veya plazma viral RNA ve / veya DNA edinin.
2. 50 ul TE tamponunda elde RNA veya DNA Zehir. Alternatif olarak, diğer nükleik asit saflaştırma prosedürleri kullanılabilir.

3. Env bölgenin Amplifikasyon

Plazma RNA ya da DNA ya da proviral gelen env bölgesi (Şekil 2 ve 4) yükseltin. Env proteini çoğunluğunu kapsayan bir 1245 bp uzunluğunda bir ürün (nt 6556-7811 accordinHXB2 g) oluşturulur.

1. RNA örnekleri: RT-PCR tepkimesinde
   1. Viral RNA'nın RT reaksiyonu engelleyebilir çok karmaşık bir ikincil yapı (Şekil 4) sunuyor. Bu sorunu önlemek için, 10 dakika (önceden PCR tüp içinde ve PCR makine) için 65 ° C 'de 10 ul RNA inkübe edilir ve daha sonra da 50 ° C' ye sıcaklığını düşürmek
   2. Primerler Env-F ve Env-R içeren PCR ana karışımı 40 ul ekle.
      
      -House-Sistemi RT-PCR Master Mix:
      

      	hacim / reaksiyon (ul)	nihai konsantrasyon
      RNase içermeyen H2O	14.4
      5x Buffer (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)	10	1x
      5x Q-Çözüm	10	1x
      dNTP Mix (10 mM her biri)	2	Her bir dNTP 400 uM
      Enzim-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit)	2
      Primer Env-F (100 uM)	0.3	0.6 uM
      Primer Env-R (100 uM)	0.3	0.6 uM
      RNaz İnhibitör (RNasin)	1	5 adet / reaksiyon

      
      
      Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586 HXB2 göre)
      
      Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(← 7811 nt 7785)
   3. 30 dakika için 50 ° C'da RT reaksiyon çalıştırın.
   4. Aşağıdaki gibi ilk PCR:
      
      

      95 ° C, 15 dakika	1 x
      95 ° C, 30 saniye 50 ° C, 30 saniye 72 ° C, 2 dakika
      95 ° C, 30 saniye 56 ° C, 30 saniye 72 ° C, 2 dakika	38 x
      72 ° C, 10 dak 4 ° C ∞

      1 x
2. DNA örnekleri: PCR reaksiyonu
   
   Proviral DNA örnekleri için, başlangıçta herhangi bir RT reaksiyonu tabi ve PCR reaksiyonu doğrudan başlayabilirsiniz.
   1. Provial DNA'nın 10 ul PCR Master Mix 40 ul ekleyin.
      
      
      -House-Sistemi PCR Master Mix:
      

      	hacim / reaksiyon (ul)	nihai konsantrasyon
      RNase içermeyen H2O	15.4
      5x Buffer (HotStarTaq DNA Polimeraz)	10	1x
      5x Q-Çözüm	10	1x
      dNTP Mix (10 mM her biri)	2	Her bir dNTP 400 uM
      Enzim-Mix (HotStarTaq DNA Polimeraz)	2
      Primer Env-F (100 uM)	0.3	0.6 uM
      Primer Env-R (100 uM)	0.3	0.6 uM

      
      
      Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(→ 6586 nt 6556)
      
      Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(← 7811 nt 7785)
   2. Daha önce RNA örnekleri (Adım 3.1.4) için tarif edildiği gibi PCR koşulları çalıştırın.

4. V3 bölgenin Amplifikasyon: nested PCR

1. Nested PCR için şablon olarak ilk PCR reaksiyonu (agaroz jel önceki analizi olmadan) 5 ul kullanın ve PCR Mas 95 ul ekleyinter karıştırın.
   
   İç içe-In-House PCR Master Mix

   	hacim / reaksiyon (ul)	nihai konsantrasyon
   H2O	61.9
   10x PCR Tamponu	10	1x
   5x Q-Çözüm	20	1x
   dNTP Mix (10 mM her biri)	2	Her bir dNTP 200 uM
   Primer Env-2F (100 uM)	0.3	0.6 uM
   Primer Env-2R (100 uM)	0.3	0.6 uM
   HotStarTaq DNA Polimeraz	0.5	2,5 ünite / reaksiyon

   
   
   Env-2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(nt 6838 → 6864)
   
   
2. Aşağıdaki gibi PCR:

   93 ° C, 15 dakika	1 x
   95 ° C, 30 saniye 50 ° C, 30 saniye 72 ° C, 90 saniye	1 x
   95 ° C, 30 saniye 56 ° C, 30 saniye 72 ° C, 90 saniye	43 x
   72 ° C, 10 dak 4 ° C ∞

3. Bir% 1 agaroz jeli (Şek. 4) PCR ürünü analiz edin. Beklenen ürün 902 bp-uzun.
4. Sıralama örnekleri saflaştırılması.
   1. Tedarikçi tarafından sağlanan protokolü, çözümler ve mikro-kolon kullanarak Qiagen PCR Arıtma kiti ile PCR ürünü arındırın. Bant yoğunluğuna bağlı olarak, 30-100 ul PE tampon Zehir.
   2. Alternatif olarak, numune eksonükleaz ile daha da arıtılabilirBen ve Hızlı AP (Termo alkalen fosfataz). Bu amaç için, 15 ul PCR ürünü ile 6 ul Exo-AP karışımı ekleyin ve 37 dakika 15 ° C'de inkübe

      580 ul H 2 O

      66 ul hızlı AP

      13.4 ul Exo I

5. V3 Amplikon sekans reaksiyonu

1. Sıra reaksiyon, aşağıdaki primerler yalnızca biri kullanılarak bir PCR reaksiyonu oluşur:
   
   Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (→ 6980 nt 6959)
   Env-5: 5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3 '(nt 7352 ← 7371)
   Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '(nt 6979 → 7000)
   Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '(nt 7530 ← 7549)
   Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478 ← 7507)
   Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638 ← 7664)
   İlk tercih primerler şunlardır: Env-2, Env-6 veya Env-7, Env-11
2. Şablon olarak saflaştırılmış V3 Amplikon 1 ul kullanın ve PCR master mix 9 ul ekleyin.
   
   Master Mix Sıralama:

   4 ul dizisi karışımı (HIV-Genotiplendirme Takımı)

   4 ul H 2 O

   1 ul Astar (100 pmol / ul)

3. Aşağıdaki gibi dizi tepkime çalıştırın:

   96 ° C, 10 saniye
   50 ° C, 10 saniye	36 x
   60 ° C, 45 saniye
   4 ° C ∞

6. Dizi analizi örnekleri saflaştırılması

Dizileri USI Purifyng Sephadex G-50 ince.

1. Sephadex G-50 ince olan "sütununda loader" kuyuların uygun sayıda doldurun. Çevirerek filtre plakası MAHVN4510 için Sephadex aktarın.
2. Filtre plakası içinde her bir oyuğa 300 ul Milli-Q _H2O ekleyin ve en azından 2-8 3h için inkübe ° C
3. 910Xg ve 4-15 ° C sıcaklıkta 5 dk için levha santrifüje Flow-through atın.
4. Sıra ürün ve sonra şişmiş Sephadex plaka üzerinde pipeti sıra ile 10 ul _H2O ekleyin.
5. Arıtılmış ürün elde etmek için, 5 dakika boyunca plaka santrifüj. 910Xg ve 4-15 ° C ve akan toplamak.

7. Sequencer ABI Prism 3130 XL saflaştırılmış örnekleri Sıralama

1. Her çalışma öncesinde, tampon değiştirmek ve polimer (POP7) hacmini kontrol edin. Gerekirse, yeni bir ile eski polimer şişeyi değiştirin.
2. 18 saniyelik bir enjeksiyon süresi de dahil olmak üzere kaydedilen çalışma koşulları, kullanın.
3. Bu makine, 16 dizisi örnekleri ile bir run sinyal verilerinin toplanması yaklaşık 60 dk (36 cm kapiller) veya 150 dakika (50 cm kapiller) alır.

8. Sıra düzenleme

1. Dizileri (Şekil 5) hizalamak ve düzenlemek için program Lasergene (DNA-Yıldız) kullanın. Diğer dizi düzenleme programları da kullanılabilir. Bir "V3-Konsensus B" ve referans olarak env uzlaşma dizisi kullanın.
2. Lasergene mevcut ve FASTA dosyası olarak depolamak tüm ham veriler kullanılarak analiz örnek bir konsensüs dizisini oluşturur. FASTA dosya örnek adını ve nükleotid sekansı içeren bir başlık, bir metin dosyası.

9. Veri yorumlama ve tropizm tahmin Dizileme

1. Verileri yorumlama Sıralama web tabanlı yorumlama sistemi tarafından gerçekleştirilir geno2pheno _[coreceptor] ( http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). Tropizm tahmin için, farklı FPR ayarlar seçilebilir. Varsayılan ayar Alman-Avusturya tedavisi kurallarına göre yapılır. FPR ≥% 20 için, virüs R5 olarak sınıflandırılır zaman FPR ≥ 20 ve% FPR <% 12.5 için X4.
2. Sunucuya FASTA dosya yükleyin. Bu sunucu, amino asitler haline nükleotid sekansı tercüme V3-Konsensüs dizisi B ile hizalanır ve bir alt sınıflandırma üretir. Buna ek olarak, yanlış pozitif oran (FPR) olarak ifade edilir (Şek. 4) coreceptor bir kullanım tahmin oluşturur.

10. Temsilcisi Sonuçlar

Geno2pheno _[coreceptor] çıkış tropizm bir kademeli yorumunu gösterir. Coreceptor kullanımı olasılığını bağlı olarak yorumlanması metin ve arka plan rengini olası bir, düşük riskli düşündüren ve nihayet kırmızı, sarı, MVC için güvenli bir yönetim düşündüren, yeşil (<% 20 FPR) arasında değişir. Kırmızı öneririz renktirMVC reçete değil ing. Buna ek olarak, sunucu hasta ve örnek veri ile doldurulur basılabilir bir pdf raporu oluşturur ve hekim gönderildi. Geno2pheno _[coreceptor] çıkışı örnekleri Şekil tasvir edilmektedir. 6.

Şekil. 1. HIV şematik çoğaltma. Virion reseptörü olarak hücresel CD4 bağlamak gerekir ve coreceptor olarak CCR5 veya CXCR4 birine. Coreceptor CCR5 Maraviroc gibi CCR5 antagonistleri (MVC, Celsentri, Selzentry) ile bloke edilebilir. Viral ve hücresel membran füzyon sonra, viral nükleokapsit sitoplazma içinde serbest bırakılır. Nükleokapsid demonte ve virüs RNA'sının, kompleks sitoplazma içine serbest kalır. Viral ters transkriptaz (RT) sonra çekirdek taşınır ve HIV integraz göre ev sahibi genom içine entegre edilmiştir proviral DNA içine genomik RNA aktarır. Hücresel RNA polimeraz traproviral genomdan viral genomik ve haberci RNA'lar nscribe. Virüs proteinleri sitoplazmada üretilir ve hücre yüzeyine taşınır. Hücreleri olgunlaşmamış bulaşıcı olmayan virionlar gibi virüs partikülleri tomurcuk. HIV proteaz bulaşıcı parçacıklara üreten proteinleri parçalayarak. Adımlardan biri inhibisyonu replikasyon döngüsünün bir ara yol açar.

Onlar inhibe ettiği antiretroviral ilaçlar ve çoğaltma adım kırmızı olarak işaretlenmiştir.

Viral RNA ve DNA proviral (malzeme tropizm veya direnç analizi için kullanılan) yeşil işaretlenir.

Şekil 2. HIV proviral genom. HIV partikül farklı yapısal proteinleri ve evler viral ve hücresel kaynaklı hem çeşitli enzimler ve proteinler ile inşa edilmiştir. Şekil gösterisiviral genom içerisindeki genin yerini s. Yüzey gp120 ve gp41 viryonunun yüzeyi üzerinde sivri oluşturan ve membran füzyon gerçekleştirmek için insan hücre temas proteinleri. Şeklin alt kısmında, PCR amplifikasyon ürünleri ve protokolünde kullanılan primerler gösterilmiştir.

Şekil 3. Viral yükü düşük (VL) olan hastaların oranı Köln Viroloji, Üniversitesi (Almanya) Enstitüsü'nde ilaç direnci ya tropizm belirlenmesi için analiz ölçümleri.

Şekil 4. Deneme Genel şeması .. Lütfen buraya tıklayın Bu rakam bir büyük halini görmek için.

Şekil 5,. Sıra Lasergene ile düzenleme. V3 Amplikon en az bir ileri ve bir geri astar ile sıralı. Lasergene referans sekanslar "V3-Konsensus B" sequencer elde edilen ve env ". Abi" dosyaları alignes. Lasergene tüm satır veri mevcut kullanarak bir uzlaşma dizisi oluşturur. Onlar örnek uzlaşma dizisi katkıda kalmamak referans dizileri (ve daha sonra gri renkli görüntülenir) işaretlenebilir.

Şekil 6. Geno2pheno tarafından oluşturulan tropizm tahmin raporları _[coreceptor] tool.The raporları kaydedilir ve bilgisayarda tamamlanması pdf dosyaları olarak oluşturulur. Ek veriler gibi bize hastanın adı, kan çıkarma tarihi, vb, elle bir pdf yazar program kullanılarak eklenebilir. Özgül yorum da eklenebilir. These veri kullanıcının bilgisayarında değil geno2pheno _[coreceptor] sunucusunda özeldir. Lütfen buraya tıklayın Bu rakam bir büyük halini görmek için.

Discussion

^3-9 klinik deneylerinde gösterildiği gibi V3 sekans, güvenilir bir viral tropizm tahmin sağlar. Aslında, genotipik belirlenmesi mevcut Avrupa ve Alman-Avusturya yönergelere ¹⁰ düşünülmektedir.

Fenotipik testi ile karşılaştırıldığında, sadece kısa bir devir süresi (dayanıklılık testi için eşdeğer) değil, aynı zamanda maliyeti daha yüksektir. Buna ek olarak, genotipik test önemli bir avantaj sonuçlar FPR olarak sınıflandırılır ve bu yüzden, hastanın ihtiyaçlarına göre uyarlanabilir olmasıdır. Trofile sonuçlar, diğer yandan, sadece R5 veya X4 rapor vardır ve ham verilere erişimi verilmez.

Avusturya-Alman esaslarına her bir hastanın ihtiyaçlarına ¹¹ cut-off özel FPR adapte izin verirken, şu anda, Avrupa yönergeleri, 20% ¹⁰ bir FPR kesme öneririz. Bu doğrultuda, antiretroviral ilaçlar seçenekleri geniş bir yelpazede, yüksek FPR cut-off (>% 20) olan hastalar için recomm vardırsona erdi. Tersine, sınırlı tedavi seçenekleri ile ağır ön tedavi edilen hastalarda, düşük FPR cut-off (>% 5) kullanılabilir. Tedavisi rehberlik Bu tür şu anda kısmen-aktif ilaçlar azaltılmış tedavi seçenekleri olan hastalar için tedavi dahil edilebilir NRTIs, NNRTI'ler, işlem yönergeleri ve Inis için test direnç ile devam etmektedir. Buna ek olarak, genotipik güdümlü terapi değişiklikleri, artan sayıları ile klinik-ilgili FPR kesilmelerine sürekli bioinformaticians, virologlar ve klinisyenlerin bir panel tarafından ayarlanır edilmektedir.

Genotipik tropizm testi diğer önemli bir avantajı çok düşük hatta saptanamayan viral yük (VL) ile klinik örneklerin analiz olasılığıdır. Bu durumda, RNA plazma amplifiable olmadığı zaman, proviral DNA dizilimini edilebilir ve güvenilir ^9,12 tahmin etmek için kullanılır. Unutmayın ki, düşük veya belirlenemeyen viral yükü olan hastaların sayısı hızla son yıllarda artmıştır. , T Bugünerofile tahlil sadece VL olan hastalarda <1000 kopya / ml 'den, numunelerin analizine izin verir. Ancak, ön çalışmalar proviral DNA ayrıca Trofile ¹³ tarafından test edilmesi adecuate olabileceğini göstermiştir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
MagNA Pure Compact Nükleik Asit İzolasyon Kiti I	Roche Diagnostics	04 802 993 001
MagNA Pure Kompakt Sistem	Roche Diagnostics	03731146001
T3000 termalcycler	Biometra	050-723
One Step RT-PCR Kit	Qiagen	210215
HotStarTaq Master Mix Takımı	Qiagen	203445
QIAquick PCR Arıtma Kiti	Qiagen	28106
Ekzonükleaz I (Exo I)	Fermentas	EN0582
Termosensitif Alkalin Fosfataz Fastap	Fermentas	EF0651
BigDye Terminator v3.1 Cycle Dizileme Takımı	Applied Biosystems	4337457
Sephadex G-50 Superfine	GE Healthcare	17-0041-01
ABI Prism 3130 XL kılcal sıralayıcı	Applied Biosystems	3130XL