Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

10.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/3404

⸱

6 Aralık 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Anatomy and Cell Biology, The University of Kansas School of Medicine

Bu makalede

Özet

Vomeronazal organ (VNO), sosyal ve üreme bilgilerini ileten tür içi kimyasal sinyalleri tespit eder. VNO dokusunda G-CaMP2 eksprese eden transgenik fareler kullanarak Ca2+ görüntüleme deneyleri gerçekleştirdik. Bu yaklaşım, vomeronazal nöronların çok sayıda feromon uyarısına verdiği karmaşık yanıt modellerini analiz etmemize olanak tanır.

Özet

Vomeronazal organ (VNO), aynı türdeki bireylerin sosyal, cinsel ve reprodüktif durumları hakkında bilgi taşıyan kemosensör sinyalleri algılar 1,2. Bu tür içi sinyaller olan feromonlar ve bazı yırtıcılardan gelen sinyaller 3, vomeronazal duyusal nöronları (VSN'ler) yüksek düzeyde özgünlük ve hassasiyetle aktive eder 4. Kemosensör ipuçlarının algılanmasını sağlamak için VNO nöronlarında G-protein kenetli reseptörlerin en az üç farklı ailesi, V1R, V2R ve FPR 5-14, eksprese edilir. Feromon bilgisinin VNO tarafından nasıl kodlandığını anlamak için, tekil VSN'lerin çeşitli uyaranlara karşı verdikleri yanıt profillerini analiz etmek ve bu yanıtları yöneten spesifik reseptörleri belirlemek kritik önem taşır.

VNO'nun nöroepitelyumları bir çift vomer kemiği ile çevrilidir. VNO'nun yarı kör tübüler yapısının, burun boşluğuna bağlanan bir açık ucu (vomeronazal kanal) vardır. VSN'ler dendritlerini, feromon sinyallerinin dendritik yumrularda eksprese edilen reseptörlerle temas ettiği VNO'nun lümen kısmına uzatırlar. VSN'lerin hücre gövdeleri, apikal ve bazal katmanlarda sırasıyla V1R ve V2R eksprese edilen yalancı tabakalı katmanlar oluşturur 6-8. VSN'lerin duyusal uyarılara verdiği yanıtları izlemek için çeşitli teknikler kullanılmıştır 4,12,15-19. Bu teknikler arasında, akut dilim preparasyonu birçok avantaj sunar. Birincisi, disosiye VSN'lerle 3,17 karşılaştırıldığında, dilim preparasyonları nöronları doğal morfolojilerinde tutar ve hücrelerin dendritleri nispeten bozulmadan kalır. İkincisi, tüm epitel ve whole-mount preparasyonlara kıyasla 12,20, VNO'nun koronal dilimlerinde VSN'lerin hücre gövdelerine elektrofizyoloji çalışmaları ve görüntüleme deneyleri için kolayca erişilebilir. Üçüncüsü, bu yöntem, reseptör tanımlamaya olanak sağlamak için moleküler klonlama teknikleriyle birleştirilebilir.

Duyusal stimülasyon, VSN'lerde reseptör aktivasyonunun göstergesi olan güçlü bir Ca2+ girişini tetikler 4,21. Bu nedenle, VSN'ler dahil olmak üzere olfaktör duyusal nöronlarda G-CaMP2 eksprese eden transgenik fareler geliştirdik 15,22. Probun hassasiyeti ve genetik doğası, Ca2+ görüntüleme deneylerini büyük ölçüde kolaylaştırmaktadır. Bu yöntem, önceki çalışmalarda kullanılan boya yükleme sürecini ortadan kaldırmıştır 4,21. Ayrıca, VNO dilimlerine çeşitli stimülüslerin uygulanmasına olanak tanıyan bir ligand iletim sistemi kullanıyoruz. İki tekniğin kombinasyonu, çok sayıda stimülüse yanıt olarak birden fazla nöronun eş zamanlı olarak izlenmesini sağlamaktadır. Son olarak, görüntü işlemeye yardımcı olmak amacıyla yarı otomatik bir analiz hattı oluşturduk.

Protokol

1. Çözelti hazırlama

  1. Tabloya göre 10X R1, 10X R2 ve 10X R3 çözeltilerini hazırlayın.
    R1
    KimyasallarMW(g/mol)mM (1X)10X stok (g/L)
    NaCl58.4412573.05
    KCl74.552.51.86
    MgCl21 M stok110 ml
    CaCl2·2H2O147.0222.94
    NaH2PO4·H2O137.991.251.72

    R2
    KimyasalMW(g/mol)mM (1X)10X stok (g/L)
    NaHCO384.012521

    R3
    KimyasallarMW(g/mol)mM (1X)10X stok (g/L)
    NaCl58.4412573.05
    KCl74.552.51.86
    MgCl21 M stok220 ml
    CaCl2·2H2O147.0222.94
    HEPES1 M stok550 ml
  2. Deney günü, 100 ml 10X R1 ve 100 ml 10X R2'yi çift distile su (DDW) içinde karıştırıp 1.8 g dekstroz (final 10 mM) ekleyerek 1 litre fare yapay beyin-omurilik sıvısı (mACSF) hazırlayın. Bu hazırlama yöntemi, yüksek pH'de kalsiyum karbonat çökelmesini önler. mACSF'nin osmolaritesi yaklaşık 310-315 mOsm/L civarındadır. Gerekiyorsa osmolariteyi dekstroz veya su ile ayarlayın. Çözeltinin pH değerini 7.2-7.4'e ayarlamadan önce, çözeltiyi en az 30 dakika boyunca Karboksijen gazı (%95 oksijen ve %5 karbondioksit) ile havalandırın.
  3. Deney günü, 100 ml 10X R2 ve 100 ml 10X R3'ü DDW içinde karıştırıp 1.8 g dekstroz (10 mM) ekleyerek 1 litre Ringer çözeltisi hazırlayın. Ringer çözeltisinin osmolaritesi ve pH değeri mACSF ile benzer olmalıdır. Çözeltiyi Karboksijen gazı ile havalandırın.
  4. mACSF veya Ringer çözeltisi içinde %4 düşük erime noktalı agaroz (LMA) hazırlayın. Eritilmiş agarozu eppendorf tüplerine paylaştırın ve kullanıma kadar 4°C'de saklayın. Saflaştırılmış polisakkaritten oluşan LMA, 37°C'de sıvı halde kalır ve 25°C'nin altındaki sıcaklıklarda hızla katılaşır. Bu özellikler, LMA'yı VNO gömme ve canlı doku fizyolojisi için ideal kılar. Agar gibi diğer saf olmayan materyaller, tanımlanmamış bileşenler nöronal yanıtı etkileyebileceği için canlı doku deneylerinde tercih edilmemelidir.
  5. Feromon stimülasyonlarını Ringer çözeltisi içinde hazırlayın. Fare idrarı için 1:100 dilüsyon güçlü yanıtlar verir.

2. VNO kesitinin hazırlanması

  1. Hayvanı sakrifiye etmeden önce, agarozu eritmek için iki tüp LMA'yı bir ısıtıcı bloğa yerleştirin ve sıcaklığı >60°C olarak ayarlayın. Jel sıvılaştığında, tüpleri 37°C'lik bir ısıtıcı bloğa aktarın.
  2. CO2 ötanazisinin ardından bir G-CaMP2 faresinin kafasını kesin. Alt çeneyi çıkarmak için mandibula kemiklerini makasla kesin. Nazal boşluğu açığa çıkarmak için tırtıklı üst damak dokusunu soyun (Şekil 1A). İki ön kesici dişin arasına cerrahi bir bistüri yerleştirerek çene kemiklerini ayırın. VNO'yu açığa çıkarmak için çene kemiklerini dikkatlice çıkarın. Bu noktada, tüm VNO, kuyruk kemiğinden tutularak nazal boşluktan yukarı kaldırılabilir (Şekil 1B). VNO'yu hemen soğuk, oksijenlendirilmiş mACSF solüsyonuna aktarın.
  3. Diseksiyon mikroskobu altında, #5 pensetin ucunu septal kemik duvarı boyunca nazikçe kaydırarak iki VNO'yu birbirinden ayırın (Şekil 1C). VNO dokusunu çevreleyen vomer kemiğini soyun. Tüm VNO dokusunu kemik boşluğundan nazikçe kaldırın. Bu adımda nöroepitelyuma zarar vermemek için aşırı dikkatli olunmalıdır. Doku yüzeyinde kalan küçük kemik parçaları, gömme işleminden önce tamamen temizlenmelidir. Doku üzerinde kalan parçalar, kesme bıçağına takılarak dokunun agaroz bloktan dışarı çekilmesine neden olabilir.
  4. VNO dokusunun arka ucunu tutmak için penseti kullanın ve dokuyu nazikçe eritilmiş agarozun içine daldırın (Şekil 1D). Agarozu katılaştırmak için tüpü buz üzerinde hızla soğutun. Gömme ve soğutma işlemi 2 dakikadan kısa sürmelidir.
  5. Kesitler almak için VF300 doku dilimleyici (Precisionary Instruments, Greenville, NC) kullanılır. VNO'yu içeren agaroz bloğu uygun şekilde kesin ve doku tutucuya yapıştırın (Şekil 1E ve F). Doku tutucuyu metal silindire yerleştirin ve kalan boşluğu ek LMA ile doldurun. LMA buz üzerinde katılaştığında, hemen kesme işlemine geçin. Kesme haznesine soğuk, oksijenlendirilmiş mACSF verin ve dilim başına 180-200 μm kalınlığında kesmeye başlayın. Kesme sırasında dokunun sıkışmaması ve VNO'nun agarozdan ayrılmaması için ilerleme hızını ve vibrasyon frekansını ayarlayın. Kesilen dilimleri toplayın ve mACSF inkübasyon haznesine aktarın (Şekil 2A). Dilimler, oda sıcaklığında oksijenlendirilmiş mACSF içinde 6-8 saat boyunca canlı kalır. Şekil 2B ve C sırasıyla bir G-CaMP2 VNO diliminin DIC ve 2-foton görüntülerini göstermektedir.

3. Görüntüleme odası kurulumu

  1. VNO kesitini perfüzyon odasının (Siskiyou, Grants Pass, OR) ortasına yerleştirin ve kesiti bir kesit sabitleyicisi (Warner Instruments, Hamden, CT) ile aşağıda tutun (Şekil 3A). Sabitleyicinin iplikleri sadece kesitin LMA kısmına baskı yapmalı, VNO dokusuna temas etmemelidir. Oksijenlendirilmiş mACSF, giriş portu aracılığıyla perfüzyon odasına ∼100 μl/sec hızla iletilir ve taze mACSF'nin sürekli akışını sağlamak için sıvı, çıkış portu üzerinden bir vakum iğnesi ile tahliye edilir (Şekil 3A ve B).
  2. 30 ml'lik bir şırıngayı Ringer çözeltisi ile doldurun ve şırınga pompasına (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY) sabitleyin. Kesit üzerine sürekli bir Ringer çözeltisi akışı sağlamak için pompa hızını 300-600 μl/min olarak ayarlayın (Şekil 3C).
  3. Ringer çıkışını bir HPLC enjeksiyon döngüsüne (Chromtech, Apple Valley, MN) bağlayın (Şekil 3D). İletilen hacmin hassas kontrolü için farklı döngü boyutları seçilebilir. Deneylerimizde 20 μl'lik bir döngü kullanıyoruz. Enjeksiyon döngüsü kontrolünün iki akış yolu vardır (Şekil 3E). "Yükleme" (load) konumunda, numuneler bir Hamilton hassas şırınga ile numune döngüsüne yüklenebilir. Fazla numune, atık çıkışından numune döngüsünü terk eder. Şırınga pompası tarafından enjekte edilen Ringer çözeltisi, numune döngüsünü baypas ederek doğrudan perfüzyon ucuna bağlı olan çıkışa gider (Şekil 3A ve E). "Enjeksiyon" (injection) konumunda, pompa çözeltisi numune döngüsü üzerinden akar ve stimülasyonları çıkışa iter (Şekil 3E). Görüntüleme deneyinden önce, perfüzyon sıvısının sorunsuz akışını sağlamak için hava kabarcıkları dışarı atılmalıdır. Stimülasyon iletimi için diğer ticari veya özel yapım enjeksiyon sistemleri de uygulanabilir.
  4. Perfüzyon ucunu 5X veya 10X objektif altında, uç VNO kesitinden yaklaşık 1 mm uzaklıkta olacak şekilde ayarlayın.
  5. Yeni bir perfüzyon sistemi kurulduğunda, numune gecikme süresinin ve süresinin floresan boya ile ölçülmesi önerilir. Numune döngüsüne %0,1 rhodamine 6G boyası yükleyin ve görüntüleme başlangıcından 5 saniye sonra valfi enjeksiyon konumuna getirin (Şekil 3F). Floresan sinyali 10-30 saniye arasında tespit edilir. Floresan sinyalinin pürüzsüz eğrisi, daldırma objektif altında çok az türbülans oluştuğunu ve oksijenlendirilmiş mACSF'nin kesite yeterli düzeyde perfüzyon sağladığını da gösterir.

4. Zaman ayarlı görüntüleme

  1. Zaman ayarlı görüntüleme için 10X veya 20X su daldırmalı lensli Zeiss AxioSkope FS2 mikroskobu kullanıyoruz. G-CaMP2 sinyalleri için standart GFP bant geçiren filtre (450-490nm) kullanılmaktadır. Epifloresan görüntüler, G-CaMP2 ekspresyon seviyelerine bağlı olarak 1X1 veya 2x2 binning ile bir CCD kamera (Zeiss HRM) aracılığıyla elde edilir.
  2. Kazanım hızını saniyede 1 kareye ayarlayın. G-CaMP2 sinyallerinin ağarmasını ve hücrelerin fotohasarar görmesini en aza indirmek için ışık yoğunluğunu ayarlayın. Her deney için normalde 60 karelik bir görüntü yığını (∼60-70 saniye) elde ederiz. Belirli bir zaman noktasında (örneğin, 5. saniyede) valfi enjeksiyon konumuna getirin. Şekil 3F) tüm denemelerde tutarlı bir zaman gecikmesi elde etmek için bir deney seti için.
  3. Uyaran olarak Ringer çözeltisi kullanarak bir deneme çalışması gerçekleştirin. Örnek enjeksiyonu sırasında hareket artefaktı oluşursa perfüzyon düzeneğini yeniden ayarlayın.
  4. Ringer çözeltisi ile 1:100 oranında seyreltilmiş fare idrarı ile bir pozitif kontrol çalışması gerçekleştirin. Fare idrarına karşı G-CaMP2 yanıtının tipik maksimum ΔF/F değeri yaklaşık %20-40 civarındadır. Gerektiğinde, deneylerin sonunda dilimleri stimüle etmek amacıyla Ringer çözeltisi içinde 10 mM KCl uygulanarak dilimlerin canlılığı doğrulanabilir.
  5. Tek bir stimülüs yüklendikten sonra Hamilton şırıngasını Ringer çözeltisi ile en az üç kez yıkayın. Farklı stimülüsler arasında örnek döngüsünü Ringer çözeltisi ile en az üç kez yıkayın. Bu adımlar, farklı örnekler arasında çapraz kontaminasyonu önler.
  6. Bir sonraki uyaranı uygulamadan önce VSN'lerin toparlanması için 4-10 dakika bekleyin.

5. Veri analizi

  1. Tek bir kesitten elde edilen tüm görüntülerin görüntü kaydını (image registration) gerçekleştirin. Bu işlemi otomatikleştirmek için AxioVision (Carl Zeiss, North America) içinde özel olarak yazılmış bir VBA betiği kullanıyoruz. Aynı deney kapsamındaki tüm görüntü kareleri, elastik kayıt (elastic registration) kullanılarak ortak seçilmiş bir referans kareye göre hizalanır (Şekil 4A). Doğrusal olmayan kayıt olarak da bilinen elastik kayıt, bir hedef görüntünün bir referans görüntüye rijit olmayan bir şekilde dönüştürülmesine odaklanan bir görüntü kayıt tekniği kategorisidir. Burada AxioVision'ın uygulamasını kullandık.

    Bu referans kare, görüntü yığınları arasından rastgele seçilir.
  2. Yanıt veren hücreleri belirlemek için görüntü çıkarma (image subtraction) işlemini gerçekleştirin. Bu işlemi otomatikleştirmek için ImageJ v1.42 (http://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, MD) içerisinde özel olarak yazılmış makrolar kullanıyoruz. Her yığın için bir minimum projeksiyon görüntüsü oluşturulur. Ham yığınlardan minimum projeksiyon çıkarıldıktan sonra yanıt veren hücreler ortaya çıkar (Şekil 4B).
  3. Çıkarılmış yığınlardan ilgi bölgesini (ROI) belirleyin ve ImageJ'deki Multi-Measure eklentisini kullanarak ROI koordinatlarını elde edin. Bir deney için tüm yığınları işleyin ve tüm ROI koordinatlarını bir ROI ana listesine kaydedin (Şekil 4C).
  4. Özel olarak yazılmış makro ve ImageJ'deki Multi-Measure eklentisini kullanarak, ham görüntü yığınlarındaki hücre yanıtlarını ölçmek için ROI ana listesini kullanın (Şekil 4D). Yanıt eğrilerini ve ısı haritasını Matlab (Mathworks Inc., Natick, MA) programında çizin.

6. Temsili Sonuçlar

Dört farklı fareden toplanan idrar örneklerinin kullanıldığı VNO görüntüleme deneyine bir örnek Şekil 5'te gösterilmektedir. Kesit, idrar stimülasyonuna çeşitli aktivasyon modelleriyle yanıt vermektedir. İdrar stimülasyonlarından en az birine yanıt veren yaklaşık 80 hücre tanımlanmış ve bunların yanıt ΔF/F değerleri ısı haritasında grafiğe dökülmüştür (Şekil 5A). 1, 2 ve 3 numaralı hücrelerin yanıt izleri, idrar stimülasyonuyla gerçekleşen aktivasyonun zaman seyrini göstermek üzere Şekil 5B'de çizilmiştir. Hücre 1, her iki dişi idrar örneğine yanıt verirken erkek örneklerine yanıt vermemektedir; hücre 2 ise bunun tam tersi bir aktivasyon modeli sergileyerek yalnızca her iki erkek örneğe yanıt vermektedir. Hücre 3, hem bireysel erkek hem de dişi örnekler tarafından aktive edilmiştir. Hücre 1 ve 2, idrardaki cinsiyete özgü ipuçlarına karşı karakteristik yanıtlar sergilemektedir 15.

Vomeronasal organ (VNO) diseksiyonu, anatomik diyagramlar, duyusal analiz için ekipman kurulumu.
Şekil 1 VNO diseksiyon sürecinin şematik gösterimi. A. Fare kafasında VNO'nun anatomik konumu. Bir G-CaMP2 faresinin kafası diseke edilmiş ve VNO'yu açığa çıkarmak için damaktan yumuşak dokular uzaklaştırılarak ters şekilde yerleştirilmiştir. Küçük resim, aynı görüntünün floresan görüntüsünü göstermektedir. VNO'nun nöroepitelyumları parlak yeşildir. B. Vomer kemiği (üst) içinde yer alan izole edilmiş VNO'nun yan görünümü ve aynı VNO'nun floresan görüntüsü (alt). C. VNO'nun koronal görünümü ve diseksiyon süreci. Bir VNO septumdan ayrılır ve ardından nöroepitelyumu çıkarmak için vomer kemiği uzaklaştırılabilir. D. VNO, LMA içine gömülür. E. Gömülü blok, kesit almak için doku tutucuya yapıştırılır. Doku tutucu, agaroz bloğu kesim için metal namludan dışarı itecek şekilde kesit başına 180-200 μm ilerletilir. Kesici bıçak, metal namluya yakın konumlandırılır. F. VF300 doku dilimleme sisteminin yan görünümü. B.V., kan damarı. N.E., nöroepitelyum.

A. Görüntüleme için optik ayarlamaları yapılmış mikroskop düzeneği; B, C. Biyolojik örneklerin mikroskobik görüntüleri.
Şekil 2 VNO kesitleri. A. VNO kesitleri, oda sıcaklığında oksijenlendirilmiş mACSF içinde muhafaza edilir. B. VNO kesitinin bir DIC görüntüsü. C. G-CaMP2 faresinden alınan VNO'nun 2-foton görüntüsü. Ölçek çubuğu, 50 μm.

VNO perfüzyon düzeneği, şırınga pompası ve veri sonuç grafiği ile kromatografi yöntem diyagramı.
Şekil 3 Perfüzyon sistemi düzeneğinin gösterimi. A. Giriş ve çıkışı olan tipik bir perfüzyon odası. VNO dilimi odanın merkezine yerleştirilmiş ve bir doku sabitleyici ile aşağı doğru bastırılmıştır. VNO dokusunun ezilmemesi için doku sabitleyicinin orta dişleri çıkarılmıştır. B. Perfüzyon odası, daldırma objektifinin altında mikroskop tablasına yerleştirilmiştir. mACSF girişi, vakum çıkışı ve perfüzyon ucu belirtilmiştir. C. Tek kanallı şırınga pompası, perfüzyon ucu aracılığıyla sürekli Ringer çözeltisi akışı sağlar. D. Stimülüs örneğinin kolayca yüklenmesi ve enjeksiyonu için HPLC enjeksiyon döngü sistemi kullanılmıştır. E. Yükleme ve enjeksiyon konumlarındaki akış yönlerinin şematik gösterimi. Ringer çözeltisi, yeşil. Stimülüs örneği, macenta. Oklar akış yönünü göstermektedir. F. Perfüzyon sisteminin gecikme ve yıkanma süresinin ölçümü. Rhodamine 6G floresan boyası örnek döngüsüne yüklenmiş ve valf, okla belirtilen 5. saniyede enjeksiyon konumuna getirilmiştir. Floresan sinyal değişimi 10-30 saniyeler arasında tespit edilmiş ve sonrasında azalmıştır.

Stimülasyon yanıt analizi ve veri seti genel bakışıyla birlikte mikroskopide görüntü kaydı ve ROI işleme.
Şekil 4 Görüntü işleme hattı. A. Bir kesite ait tüm görüntü kareleri bir referans kareye göre kaydedilir. B. Bir yığının minimal projeksiyonunun ham karelerinden çıkarılması. Çıkarma işleminden sonra yanıt veren hücreler belirginleşir. C. ROI'ler seçilir ve koordinatları ana listede derlenir. D. Ham yığındaki ROI ana listesi kullanılarak yanıt veren hücrelerin ölçümü.

ΔF/F analizini gösteren ısı haritası ve çizgi grafikler; nöral aktivite üzerinden FVB, CBA, BL6 veri karşılaştırması.
Şekil 5 Temsili bir G-CaMP2 VNO görüntüleme deneyi. A. Münferit erkek ve dişi idrarı ile stimüle edilen bir kesitten elde edilen ΔF/F yanıt ısı haritası. İdrar örnekleri münferit erkek ve dişi farelerden toplanmıştır. X-ekseni, kesitten tanımlanan yanıt veren hücreler. Y-ekseni, deneyde kullanılan idrar örnekleri. Renk çubuğu ΔF/F değerini göstermektedir. B. A'da işaretlenen 3 temsili hücrenin yanıt zaman seyri. Oklar stimülasyon uygulama zamanını göstermektedir. F-FVB, dişi FVB; F-CBA, dişi CBA; M-FVB, erkek FVB; M-BL6, erkek C57BL/6.

Spesifik reaktifler ve ekipman tablosu:

Reaktif adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
perfüzyon odasıSiskiyouPC-Hyatay
kesit sabitleme aparatıWarner InstrumentsSHD-22CL 
perfüzyon portu tutucuALA scientific, Inc.MPIOH-S 
şırınga pompasıNew Era Pump Systems, Inc.NE-300 
düşük basınçlı enjeksiyon valfiChromtechV-451 
PEEK tüpChromtech15311/16" OD, 0.25mm ID
PEEK örnek döngüsüChromtech180320 μL
Hamilton şırıngaChromtech80630100 μL

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Vomeronasal reseptörlerin (VR'ler) çoğunluğu, Dulac ve Axel tarafından keşfedildiklerinden beri 5 orfan reseptörler olarak kalmıştır. Bu kemosensör reseptörlerin feromon ligandları ve hayvan davranışlarını yönetmedeki rolleri henüz yeterince anlaşılamamıştır. Şimdiye kadar yalnızca bir ligand/reseptör çifti, ESP1 peptidi ve bunun eş reseptörü Vmn2r116 (V2Rp5), tanımlanmış ve spesifik sosyal bilgileri ilettiği gösterilmiştir 19,23. Bir başka reseptör olan V1rb2'nin, muhtemelen dişi fare idrarında zen...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Teşekkürler

Hayvan bakımı ve teknik hizmetler konusundaki mükemmel destekleri için Andrea Moran'a ve Stowers Institute bünyesindeki Laboratuvar Hayvan Hizmetleri Tesisi (LASF) üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Stowers Institute ve NIH (NIDCD 008003) tarafından CRY'ye sağlanan finansmanla desteklenmiştir. İçerik tamamen yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal İşitme ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini yansıtmak zorunda değildir. tetO-G-CaMP2 fareleri için Stowers Institute, CRY ve LM adına ABD patent başvurusu sürmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Kaynaklar

  1. Birch, M. C. Pheromones. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).
  2. Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).
  3. Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141, 692-703 (2010).
  4. Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
  5. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
  6. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
  7. Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
  8. Ryba, N. J., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Neuron. 19, 371-379 (1997).
  9. Pantages, E., Dulac, C. A novel family of candidate pheromone receptors in mammals. Neuron. 28, 835-845 (2000).
  10. Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies. Genomics. 83, 802-811 (2004).
  11. Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
  12. Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
  13. Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
  14. Rodriguez, I., Punta, D. el, Rothman, K., Ishii, A., T,, Mombaerts, P. Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors. Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).
  15. He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ. Science. 320, 535-538 (2008).
  16. Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
  17. Chamero, P. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450, 899-902 (2007).
  18. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
  19. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437, 898-901 (2005).
  20. Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
  21. Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
  22. He, J. Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).
  23. Haga, S. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466, 118-122 (2010).
  24. Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).
  25. Hendel, T. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in. 28, 7399-7411 (2008).
  26. Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators. J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).
  27. Jayaraman, V., Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).
  28. Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kalsiyum G r nt lemeDoku Kesit Haz rlamaFeromon UyaranlarGCaMP2 EkspresyonuPerf zyon SistemiZaman At ml G r nt lemeG r nt AnaliziN ronal Yan t ProfillemeVomeronazal Duyusal N ronlar
Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.