Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Özet

Asetat kinaz aktivitesinin belirlenmesi için bir yöntem açıklanmıştır. Bu testte, asetat oluşturan yönde asetat kinaz enzim aktivitesi ve kinetiği farklı fosforilasyonunu alıcıları belirlemek için doğrudan bir tepki kullanır. Ayrıca, bu yöntem diğer asetil fosfat ya da asetil-CoA kullanan enzimler assaying için kullanılabilir.

Özet

Asetat kinaz, asetat ve şeker kinaz-HSP70-aktin (ASKHA) enzim süperailesinin ^1-5 bir üyesi, bir substrat olarak ATP kullanan asetil fosfat asetat geri dönüşümlü fosforilasyon için sorumludur. Asetat kinazlar Archaea bir cins bulundu, Bakteriler her yerde, ve aynı zamanda ökaryotlarının ⁶ mikroplar bulunmaktadır. En iyi karakterize asetat kinaz olduğunu metan üreten archaeon Methanosarcina thermophila ^7-14. Sadece asetil fosfat oluşturan yönde ATP _i PP yararlanmak ancak bir asetat kinaz Entamoeba histolytica, amip dizanteri etkeni izole edilmiş ve şimdiye kadar sadece bu cinsin ^15,16 olmuştur.

Asetil fosfat oluşum doğrultusunda, asetat kinaz aktivitesini genellikle ilk Lipmann tarafından açıklanan, hydroxamate tahlil kullanarak ölçülür.^17-20, enzimler piruvat kinaz ve laktat dehidrogenaz ^21,22 ADP ATP dönüşüm NAD NADH oksidasyonu birleştiğinde olduğu bir birleştiğinde tahlil ⁺ veya asetil fosfat ürün reaksiyon sonra inorganik fosfatın serbest ölçen bir test hidroksilamin ^23. Etkinlik tam tersi, asetat oluşturan yönü ADP NADP azaltılması ⁺ enzimler heksokinaz ve glukoz 6-fosfat dehidrogenaz ²⁴ NADPH, ATP oluşumu birleştirilmesi ile ölçülür .

Burada kaplin enzimler gerektirmez asetat oluşumu yönünde asetat kinaz aktivitesinin tespiti için bir yöntem tarif, ama onun yerine asetil fosfat tüketimi doğrudan belirlenmesi üzerine dayanır. Enzimatik reaksiyon sonra, kalan asetil fosfat hydroxamate tayini için spektrofotometrik olarak ölçülmüş olabilir ferrik hydroxamate karmaşık dönüştürülür. Böylece, I. aksineADP ATP üretimine bağımlı bu yönde andard birleştiğinde tahlil, doğrudan bu testi ATP veya PP _i üretmek asetat kinazlar için kullanılabilir.

Protokol

Bu protokolün genel şeması Şekil 1'de özetlenmiştir.

1. Standart Eğriler ve Tahliller Çözüm Hazırlığı

1. Hidroksilamin-HCl 2 mol / L çözelti 100 mL hazırlayın. Hidroksilamin hidroklorür 13,9 g (MW 69.49 g / mol) tartılır ve yaklaşık 50 ml distile deiyonize su (GKD ₂ O) içinde çözülür. Potasyum hidroksit pelet veya konsantre bir çözüm kullanarak 7.0 pH ayarlayın. Son hacim 100 mL 'ye getirin. Çözüm 30 gün kadar ya da 4 ° C'de 90 gün öncesine kadar oda sıcaklığında saklanabilir.
2. 100 mL demir klorür / hidroklorik asit solüsyonu hazırlayın. 13.5 gr ferrik klorür (MW 270,32 g / mol) tartılır ve yaklaşık 50 ml GKD ₂ O içinde çözülür 41.3 ml konsantre hidroklorik asit (12.1 mol / L) ekleyin ve bir son hacim 100 mL getirmek. Ferrik klorür son konsantrasyonu 0,5 mol / L ve hidroklorik asit konsantrasyonu son 5 mol olacak olacak/ L. Çözüm oda sıcaklığında saklanır.
3. Trichoroacetic asit 1.84 mol / L çözelti 100 ml hazırlayın. Trikloroasetik asit (MW 163,39 g / mol) 30.0 gr tartılır, GKD ₂ O içinde çözülür ve son hacim 100 mL getirmek. Çözüm oda sıcaklığında saklanır.
4. 5 ml 0.1 mol / L asetil fosfat çözüm hazırlayın. Tartılır, 0,092 gr asetil fosfat (MW 184,06 g / mol) GKD ₂ O içinde çözülür ve son hacim 5 ml getirmek. Kısım mikrosantrifüj tüpler (tüp başına 0.25 ml) çözüm ve kullanıma kadar -20 ° C'de dondurma. Çözülmüş bir çözüm buz konulmalıdır ve yaklaşık 1 saat için de kullanılabilir. Çözülmüş oldu Asetil fosfat çözüm refrozen ve yeniden kullanılan olmamalıdır.
5. ADP 0.1 mol / L çözelti 5 ml hazırlayın. ADP 0.24 g (MW 472,5 g / mol) tartılır, GKD ₂ O içinde çözülür ve son hacim 5 ml getirmek. -20 Kısım mikrosantrifüj tüpler çözeltisi (tüp başına 0,5 ml) ve donma ° C 'ye kadarkullanın. Kullanana kadar buz çözülmüş çözüm tutun.
6. Tris, 1 mol / L çözelti 50 mL hazırlayın. 6.06 g Tris (MW 121,14 g / mol) tartılır ve 40 ml GKD ₂ O. içinde çözülür Çözeltinin pH 7.0 hidroklorik asit kullanarak ayarlayın ve son hacim 50 ml getirmek. Oda sıcaklığında saklayın çözüm.
7. 10 ml, 1 mol / L magnezyum klorür solüsyonu hazırlayın. 2.03 gr magnezyum klorür (MW 203,31 g / mol) tartılır, GKD ₂ O içinde çözülür ve son hacim 10 ml getirmek. Çözüm oda sıcaklığında saklayın.
8. Ferrik klorür / hidroklorik asit çözeltisi ve trikloroasetik asit çözeltisi eşit hacimlerde karıştırılması ile 25 ml geliştirme çözümü hazırlayın. Geliştirme çözümü, her gün taze olarak hazırlanır ve oda sıcaklığında muhafaza edilmelidir.

2. Asetil Fosfat Standart Eğrisi hazırlanması

1. Asetil fosfat standart eğri bilinen miktarda asetil fosfat kullanılarak oluşturulur. Ha altı standart eğrit noktaları uygundur. Standartları 0.03 μmoles 0.9 μmoles son 0,1-3 mmol / L konsantrasyonları ile ilişkilidir başına 300 mcL, aralık 300 mcL son hacim 100 mM Tris çözüm uygun konsantrasyonlarda asetil fosfat stok solüsyonu sulandırınız. Asetil fosfat içermeyen bir kontrol örneği de hazırlıklı olmalısınız.
2. Her standart ve kontrol için 37 ° C ısı bloğu 1 dakika inkübe edin.
3. Her bir standart hidroksilamin hidroklorür çözüm ve üç kez sallayarak kontrolü ve mix 50 mcL ekleyin. Standart 60 ° C ısı bloğu içine yerleştirin ve beş dakika boyunca inkübe edin.
4. 100 standartlarına geliştirme çözümü mcL ve kontrol, üç kez sallayarak karıştırmak ekleyin ve renk oda sıcaklığında en az bir dakika geliştirmek için olanak sağlar.
5. 1 dakika 18.000 xg mikrosantrifüj tüm standartları ve kontrol santrifüjleyin.
6. Spektrofotometrik bir örnekleri ölçünspektrofotometri için boş olarak kumanda kullanılarak, 1 ml plastik küvetler kullanılarak t 540 nm.
7. Uygun veri analizi ve grafik yazılımı (örn. Kaleidagraph, Sinerji Yazılım) kullanarak standart bir eğri oluşturur. R ² değerleri 0.99 ya da daha fazla arzu edilir. Veri asetil fosfat mevcut μmoles karşı 540 nm'de absorbans olarak çizilir.

3. Asetat Kinaz Aktivitesi için Testi

1. Açıklanan çözümlerini kullanarak, nihai konsantrasyonu 0,1 mol / L Tris tampon, 10 mmol / L magnezyum klorür, 5 mmol / L ADP ve 2 mmol / L asetil fosfat içeren bir reaksiyon karışımı hazırlayın. 10 ml reaksiyon karışımı 8.2 ml GKD ₂ O, 1.0 ml Tris çözüm, 0.1 ml magnezyum klorür çözeltisi, 0.5 mL ADP çözüm, ve 0.2 mL asetil fosfat çözümü gerekecektir. Mikrosantrifüj tüpleri ile 300 ul alikotları reaksiyon karışımı dağıtın. Kinetik parametreleri ve optimizasyon substrat konsantrasyonlarının belirlenmesi için, bir substratçeşitli ve diğer reaksiyonlarda bir sabit konsantrasyonda düzenlenen.
2. 37 az 1 dakika süreyle reaksiyonlar Ön-inkübe ° C ısı bloğu.
3. İstediğiniz bir reaksiyon enzim miktarını ekleyin ve tüp 37 ° C ısı bloğu hemen dönün. Ayrıca, herhangi bir enzim eklenir kontrol reaksiyon içerir. Çeşitli reaksiyonlar yapılır ise, belirli zaman aralıklarında tüplerine enzim ekleyin. Zaman takip etmek için emin olun. (NOT: kullanılacak enzim miktarı asetil fosfat veya ADP substrat tükenmiş olmayacaktır sağlamak için optimize edilmiş olması gerekecektir - Tartışma bölümüne bakın)
4. 5 dakika sonra, her bir reaksiyon ve kontrolü, mix hidroksilamin hidroklorür çözüm 50μl ekleyin, ve tüpler 60 ° C ısı bloğu. Çeşitli reaksiyonlar yapılmaktadır enzim eklendi, bu aynı zaman aralığında olmalıdır.
5. 5 dakika reaksiyonlar ve kontrol inkübe, 60 ° C
6. 100 & ekleyinizmu, her tepki ve kontrol laboratuarlarında tüp rafa, mix, yer ve geliştirme çözümü L. Renk, en az 1 dakika geliştirmek. Sağlayın
7. 1 dakika 18.000 xg mikrosantrifüj bütün tüpler santrifüjleyin.
8. Ölçü örnekleri 1mL plastik küvetler kullanılarak 540 nm'de spektrofotometrik ve asetil fosfat standart eğri ile karşılaştırıldığında, asetil fosfat mevcut miktarını belirlemek.
9. Tükenmiş asetil fosfat substratı miktar kontrolü enzim eksikliği bulunan asetil fosfat miktarı enzimatik reaksiyon sonra kalan asetil fosfat miktarı çıkarılarak tespit edilebilir. Uygun veri ve grafik yazılımı (örn. Kaleidagraph, Sinerji Yazılım) kullanarak veri analizi yapın. R ² değerleri 0.97 'den daha fazla arzu edilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Bu testin amacı, doğrudan asetat kinaz aktivitesini ölçmek içinasetat oluşumu iyon. Bu asetat üretimi için hiçbir kolay, doğrudan ölçüm, asetil fosfat substratı tüketimi ölçerek yapılır. Asetil fosfat enzimatik reaksiyon sırasında belirli bir zaman sonra kalan asetil hydroxamate ve daha sonra 540 nm dalga boyunda ölçülür (Şekil 2) kırmızımsı bir renk olan ferrik hydroxamate kompleksi, dönüştürülür. Standartlarda μmoles asetil fosfat mevcut komplo karşı absorbans standart eğri Her reaksiyon kalan asetil fosfat miktarını belirlemek için kullanılır. Standart eğri sıfır noktası üzerinden doğrusal olmalıdır. Şekil 3'te gösterildiği bir temsilci standart eğrisi verileri de lineer denklem uygun belirten μmole asetil fosfat bugünü ve R ² değeri 0.99 başına 1,2332 absorbans birimi bir eğime sahiptir. Lineer oturması için standart eğri veri denklemi reaksiyon kalan asetil fosfat miktarını hesaplamak için kullanılır. Μmolestüketilen asetil fosfat kontrol reaksiyon enzim ve enzimatik reaksiyon sonra kalan asetil fosfat μmoles yoksun bulunan asetil fosfat μmoles arasındaki fark olarak belirlenir.

Saflaştırılmış, rekombinant M. thermophila asetat kinaz açıklanan protokolü kullanılarak analiz edildi. Şekil 4'te gösterildiği deney için 5 mmol / L, ADP konsantrasyonu sabit tutulur ve reaksiyon asetil fosfat konsantrasyonu asetil fosfat için K _m belirlemek için farklı oldu. Beklendiği gibi, bu deney her substrat enzim için standart Michaelis-Menten gibi kinetiği takip eder ve hiperbolik bir doyma eğrisi asetil fosfat konsantrasyonu karşı komplo faaliyet göstermektedir. Asetil fosfat için görünür K _m değeri 0.27 ± 0.47 yayınlanan K _m değeri ile karşılaştırıldığında olumlu 0.01 mmol / L ± akuple olarak kullanarak 0.01 mmol / L¹³ söylüyorlar.

Doğrudan analiz aynı zamanda, standart birleştiğinde tahlil kullanarak mümkün değildir ATP daha başka yüzeylerde kullanmak asetat kinaz aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. Rekombinant E. Saf asetat oluşturan yönde PP _i yerine ATP üretir histolytica asetat kinaz ^16, sodyum fosfat ADP yerine kullanarak bu testte maruz kaldı. Reaksiyon sodyum fosfat konsantrasyonu 0.2 mol / L olarak sabit tutuldu ve asetil fosfat konsantrasyonu çeşitlilik oldu. M. thermophila asetat kinaz, E. histolytica asetat kinaz asetil fosfat için Michaelis-Menten gibi kinetiği takip ve hiperbolik bir doygunluk eğri (Şekil 5) gözlendi. Asetil fosfat için görünür K _m değeri 0.50 ± 0.006 mmol / L Reeves ve Guthrie ¹⁵ doğal enzim asetil fosfat için 0,06 mmol / L K _m değeri tespit; hiç enzim sadece kısmen saflaştırılmış ve tahlil da sadece kısmen arıtılmış dört kaplin enzimler dahil oldu. Bu nedenle, doğrudan bu değerleri karşılaştırmak zordur.

Protokol Programı

1. Asetil fosfat standart eğri oluşturma
2. Istenen konsantrasyona enzim sulandırınız
3. Mikrosantrifüj tüpler için reaksiyon karışımı ve kısım 300 ul hazırlayın
4. 1 dakika için 37 Preincubate reaksiyonlar ° C
5. Reaksiyonlar, belirli zaman aralıklarında enzim ekleyerek başlatın
6. Reaksiyonları durdurmak ve 60 yaşında inkübe aynı aralıklarla hidroksilamin ° C 5 dakika
7. Ferrik klorür / renk gelişimi için trikloroasetik asit çözeltisi ekle
8. 1 dakika 18.000 xg tüpler Santrifüj
9. 540 nm dalga boyunda absorbansı ölçülür
10. Standart eğrisine göre tüketilen asetil fosfat miktarını belirlemek.

tp_upload/3474/3474fig1.jpg "/>
Şekil 1: Protokol Programı

Şekil 2: Asetil fosfat standartları . Artan konsantrasyonlarda asetil fosfat ile reaksiyona açıklandığı gibi hidroksilamin ve renk geliştirilmiştir. Asetil fosfat eksik kontrolü, parlak sarı, ve asetil fosfat artan miktarda içeren reaksiyonlar gittikçe koyu renkli. Bu renk değişimi, 540 nm dalga boyunda ölçülür.

Şekil 3. Örnek asetil fosfat standart eğri. Asetil fosfat değişen miktarlarda hidroksilaminle tepki ve renk geliştirme çözümü ve absorbans 540 nm'de ölçüldü. Μmoles asetil fosfat karşı 540 nm'de absorbans çizilen ve veri doğrusal bir uyum uygulanmıştır./ P>

Şekil 4 ATP üreten M. asetil fosfat kullanımı thermophila asetat kinaz. Asetil fosfat değişen konsantrasyonları ile 5 mmol / L ADP varlığı asetat oluşumu yönünde enzimatik aktivite tespit edilmiştir. Asetil fosfat tüketilen miktar tepki asetil fosfat başlangıç ​​tutarı ve enzimatik reaksiyon sonra kalan asetil fosfat miktarı arasındaki fark olarak tespit edildi. Tahliller gösterilen hata barları ile üç nüsha halinde yapılmıştır.

Şekil 5 PP asetil fosfat kullanımı _i üreten E. histolytica asetat kinaz. Asetat oluşumu yönünde enzimatik aktivite 0 varlığı tespit edildi.Asetil fosfat konsantrasyonları değişen 2 mol / L sodyum fosfat. Asetil fosfat tüketilen miktar tepki asetil fosfat başlangıç ​​tutarı ve enzimatik reaksiyon sonra kalan asetil fosfat miktarı arasındaki fark olarak tespit edildi. Tahliller gösterilen hata barları ile üç nüsha halinde yapılmıştır.

Tartışma

Bu testte asetil fosfat algılama hidroksilamin hidroklorür yeterli konsantrasyon ve ferrik klorür çözeltisi konsantrasyonu ve asit bağlıdır. Bu bileşenlerin her iki testin hacmi değişiklik yeniden gözden geçirilmesini gerektirebilir. Enzimatik reaksiyonları burada açıklanan 37 ° yapıldı ° C, 5 dakika 60 ° C hidroksilamin sonlandırma. Bu yüksek sıcaklık asetil hydroxamate kalan asetil fosfat hızlı dönüşüm için izin verecek kritik öneme sahiptir. Absorbans renk geliştirme adım ve ölçüm zamanlaması daha az kritik olduğunu ...

Malzemeler

Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Asetil fosfat	Sigma Aldrich	01409	Lityum tuz (% 97)
Sodyum fosfat tekbazlı (kurutmak)	ThermoFisher	S381
Sodyum fosfat dibazik (susuz)	ThermoFisher	S374
Magnezyum klorür (hekzahidrat)	ThermoFisher	M33
Tris Base	ThermoFisher	B152
Ferrik klorür (hekzahidrat)	ThermoFisher	I88
Trikloroasetik asit	ThermoFisher	A324
Hidroksilamin hidroklorür	ThermoFisher	H330
Adenozin 5'-difosfat sodyum tuzu	Sigma Aldrich	A2754
Biomate III Spektrofotometre	ThermoFisher	142982082	Standart UV / Vis spektrofotometre