Yöntem makalesi

Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

DOI:

10.3791/3794

⸱

9 Mart 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Center for Cell Dynamics, Johns Hopkins University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, University of Tokyo, 3Biomedical Engineering, Johns Hopkins University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Işık tarafından küçük GTPaz aktivitesinin yerleşim-zaman kontrolü için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, rapamisin indüklenen FKBP-FRB heterodimerization ve foto-kafes sistemleri dayanmaktadır. Işık ışınlama Optimizasyonu Subselüler düzeyindeki küçük GTPases bir uzay-zamansal olarak kontrollü aktivasyon sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Büyük zamanmekansal hassasiyetle küçük guanozin triphosphatases (GTPases) ve Rho ailesinin Dinamik yönetmelik çeşitli hücresel fonksiyonları ve olaylar 1, 2 için gereklidir. Onların spatiotemporally dinamik yapısı gerçek zamanlı 3 de, faaliyet ve yerelleşme görselleştirme tarafından ortaya konmuştur. Moleküler düzeyde çeşitli hücresel fonksiyonların rolleri daha derin bir anlayış kazanmak için, bir sonraki adım, kesin Subselüler konum ve zamanlama ile protein faaliyetlerinin pertürbasyon olmalıdır.

(1) rapamisin bağlı FKBP-FRB heterodimerization ve rapamisin (2) Fotoğraf-kafes yöntemi: Bu hedefe ulaşmak için, ışık kaynaklı, iki tekniği birleştirerek küçük GTPases bir uzay-zamansal olarak kontrollü aktivasyon için bir yöntem geliştirdik. Rapamisin aracılı FKBP-FRB heterodimerization kullanımı ile, hızla küçük GTPases includi aktivasyonu veya inaktivasyonu indüklenebilir için bir yöntem geliştirding Rac 4, rapamisin FRB tutturulduğu plazma zarına, FKBP-erimiş GTPases, ya da bunların aktivatörlerinin translokasyonu indüklemektedir hangi Cdc42 4, RhoA 4 ve 5 Ras,. Bu heterodimerization sistemi ile bağlantı için, biz de rapamisin analoglarının bir foto-kafes sistemi geliştirdik. A foto-kafeste bileşiğin aktivitesi olan bir kafes grubu olarak bilinen bir photocleavable koruyucu grup ile bastırılmış, küçük bir moleküldür. Tamamen heterodimerization faaliyetleri bastırmak için, hücrelerin 6 içinde kimyasal bir dimerizer olarak neredeyse hiçbir plan aktivitesi yol, elde edilen büyük ve karmaşık bir plazma zarı geçemez öyle bir makromolekül tethered bir kafese rapamisin tasarlanmıştır. Şekil 1 bizim bir düzeni göstermektedir sistem. Bu iki sistemin kombinasyonu ile, yerel saniyelik bir zaman ölçeği üzerinde plazma membranı bir Rac aktivatörü işe ve Subselüler lev ışık kaynaklı Rac aktivasyon eldeEl 6.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Plazmid DNA transfeksiyon

  1. 37.5 ul dH 2 O kadar floresan proteini tagged: plazmid DNA'lar, 0.5 mikrogram membran-gergin FRB (bundan sonra LDR olarak anılacaktır) ve 0.5 mg FKBP-Tiam1 (Rac aktivatör T-hücreli lenfoma invazyon ve metastaz uyaran protein 1) ekle 1 ul FuGENE HD ekleyin.
  2. 20 dakika için oda sıcaklığında vorteks ile inkübe. Bu arada, adım 1,3-1,8 geçin.
  3. 50 ul poli-D-Lizin içeren bir 8-de haznesinin her oyuğa yıkanır.
  4. DH 2 O her iyi merkezi yıkayın
  5. % 80-85 konfluent NIH-3T3 hücreleri Trypsinize ve 10 ml kültür ortamı (% 10 FBS DMEM) ye tamamlanır.
  6. Süspansiyon 375 ul çıkarın ve 3 dakika 1750 rpm'de santrifüj.
  7. Pelet rahatsız dikkat ederek, medya aspire.
  8. DMEM w /% 10 FBS ve Pastör pipetiyle 750 ul ekleyin.
  9. DH 2 O / DNA / FuGENE HD çözümü için hücre süspansiyonu ekleyin ve hafifçe karıştırın.
  10. 250 ekleHer bir kuyuya hücre / DNA süspansiyonu ul (3 kuyu kadar dolduracaktır).
  11. 37 Transfekte hücreler inkübe ° C ve 15-18 saat boyunca% 5 CO2.

2. KİB-Bir Çözüm hazırlanması

  1. Sentezlemek kafesli rapamisin-biotin adduct (KİB). Ayrıntılar için "KİB Sentetik düzeni" bakınız. Kısaca, kafes ve biyotin yarımlar ayrı olarak hazırlanır. Kafes yarımı sonra rapamisinin (LC laboratuar) ile konjuge olup, ürün daha sonra CRB verecek şekilde tıklama reaksiyonu içinde bir 7 vasıtası ile biyotin yarımına bağlanmıştır.
  2. DMSO içinde CRB bir 1 uM stok çözeltisi hazırlayın.
  3. 0,5 ml Eppendorf tüp PBS 250 ul olarak 1mg avidin eritin.
  4. Çözünmüş avidin için CRB stok solüsyonundan 1 ul ekleyin. Ters tarafından bir kaç kez karıştırın.
  5. CRB-avidin konjugatı (CRB-A verecek şekilde 15 dakika oda sıcaklığında inkübe) Çözümü.
  6. Ilişkisiz küçük moleküller uzaklaştırın ve saflaştırmak KİB-A boyutu-dışlama sütunu kullanarak.

3. Mikroskopi ve Subselüler Düzeyinde Işık Aydınlatma

  1. Serum 12 saat boyunca FBS olmadan DMEM içinde transfekte edilmiş hücrelerin açlık.
  2. Yavaşça hücrelerini medya çekilerek hazırlanmış 400 nM KİB-bir çözüm (adım 2.6 dan itibaren) 250 ul ekleyin.
  3. Işık tedavisi öncesi ve sonrası Subselüler çözünürlükte canlı hücreler protein dinamikleri görselleştirmek için, iplik diski mikroskobu (Şekil 2a) kullanıldı. UV aydınlatma epi-floresan ışığı (Şekil 2b) ile UV LED ışık (365 nm) için optik bağlantı sağlandı.
  4. Metamorph yazılımı Transfekte edilmiş hücrelerin floresans görüntüler, her 15 saniye yakalamak için kullanıldı.
  5. UV ışığı ile heyecanlandım floresan boya ile kaplanmış bir cam levha kullanılarak bir aydınlatma noktanın koordinatları ve boyutu tanımlayın. Boyutu olabilirfarklı büyütmeler objektif lens uygulayarak ve farklı çekirdek boyutu ile optik fiberler seçilerek çeşitlendirilebilir.
  6. Hücre periferinde membran ruffling, saçmak UV ışık arka seviyelerini belirledikten sonra. Aşağıdaki iki adım lokalize etkileri önceki karşılaştırmak vardır.
  7. Küresel bir cıvalı lamba tarafından sağlanan 365 nm ışık hücreleri ışın tedavisi.
  8. , Uncaged DMSO içinde ve sonra PBS (400 nM final) içinde eritilir ve böylece orijinal rapamisin ve küresel etkilere sebep olmak için görüntüleme odasına solüsyonu ilave edin.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Temsili sonuçlar bir örneği, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bir hücresel kenarında küçük bir bölgede UV ışık ışınlama hızla lokalize oluşumu uyarılan ışınlanmış alanında ve yakın sadece katlar. Bu WHI iki, biz o zaman küresel UV ile ışınlanmış hücreleri, aslında yerel etkinlik, ya da toplu medya rapamisin eklendiğini onaylamak içinch membran boyunca küresel fırfır oluşumuna bağlı. Bir kantitatif analiz için, dört parçaya bölünür hedef hücrelere bölünmüş ve fırfır yerel üzerine her çeyrekte oluşumu gibi denetimleri (Şekil 4) dahil olmak üzere, çeşitli koşullar altında küresel uyarılmasını takiben sıklığı sayılır. Sadece bu UV ışınlama kombinasyonu, KİB-A, ve yerel ruffling indükler uygun FKBP-FRB yapıları olduğunu.

figure-protocol-1
Şekil 1. Kafesli rapamisin-avidin konjuge (KİB-A) ve UV ışık kullanılarak mekansal sınırlı protein Dimerleşme şematik. UV ışını kimyasal dimerizer (HE-Rapa, C40-O-(2-hidroksietil) rapamisin) ve yan-ürünün yayın ile sonuçlanan, rapamisin ve biotin ile linker parçalayarak. Serbest dimerizer sonra hücrelerin içine yayılır ve FKBP-POI (ilgi protein) ve plazma memb arasındaki dimerizasyon indüklerRane sadece ışınlanmış bölgesi (mavi daire) yakınında FRB demirledi. UV ışını olmadan, FKBP ve FRB dolayısıyla hiçbir etkisi üreten, (kırmızı çarpı) doçent yok. (Copyright @ ACS2011) 6

figure-protocol-2
Şekil 2. Özelleştirilmiş konfokal floresan mikroskop resmi. Konfokal mikroskop (a) önden görünüşü (Axiovert 200, Zeiss ters). EPI, floresans ve UV aydınlatma için bir kaplin ünitesi (b), Yakın çekim, üstten görünüşü.

figure-protocol-3
Şekil lokalize UV ışını ile indüklenen bir transfekte NIH3T3 hücrede 3. Mekansal sınırlı fırfır oluşumu. YFP etiketli FKBP-Tiam1 (Rac aktivatörü) ve LDR (FRB membran-demirlemiş) ile transfekte bir NIH3T3 fibroblast hücre Konfokal floresan görüntüleri L ile kenarına yakın bir sınırlı alanda ışınlama yapıldı15 sn toplu medyada KİB-A konjugat varlığında 210 sn 'den için 365 nm'de ED ışık. Bu tedavi 1560 sn rapamisin son 400 nM 1063 sn ve küresel Ayrıca az 1 saniye civa lambası ile global aydınlatma izledi. Hücre başında (a) neredeyse hiç ruffling faaliyet gösterdi ancak gösterdi uzaysal lokalize aydınlatma sonra ruffling sınırlı (sarı daire) (b). Hücre yerel fırfır oluşumu Rac olarak uzaysal sınırlı aktivasyonu sonucu olduğunu gösteren, global aydınlatma ve rapamisin (cd) ilavesinden sonra küresel fırfır oluşumu gösterdi. Ölçek çubuğu: 10 mikron. (Copyright @ ACS2011) 6

figure-protocol-4
Şekil 4. Transfekte NIH3T3 hücrelerinin kadranda fırfır oluşumu sıklığı. CRB-A ve aşağıdaki genel UV ışını 13 hücreleri üzerinde yapıldı. CRB-A ile lokal UV ışını KİB-A ile fırfır oluşumu gösterdi. Düşük arka fırfır oluşumu ile hücrelerde verileri toplanmıştır ancak bu rapamisinin (nihai 400 nM) ilavesi sonucu genel oluşması fırfır teyit tarafından her bir deney sonra kontrol rapamisin indüklenen fırfır oluşumu, bir kapasiteye sahip olan. Bu sonuçlar, CRB-A ve yerel UV ışını hücrelerinde yerel fırfır oluşumu için gerekli olduğunu gösterdi. (Copyright @ ACS2011) 6

Kısaltmalar:

FKBP: FK506-bağlayıcı protein
FRB: FKBP-rapamisin-bağlayıcı protein
Tiam1: T-hücreli lenfoma invazyon ve metastaz uyaran protein 1 (Rac GEF)
LDR: Lyn-DSAG linker-FRB (Lyn: Lyn kinaz N-terminal 11 amino asitleri)
HE-Rapa: C40-O - (2-hidroksietil) rapamisin
KİB: biotin grubu ile kafesli rapamisin
KİB-A: avidin için CRB konjuge

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz saniyelik bir zaman ölçeği üzerinde doğru bir hücre içi yerde Rho GTPaz aktivitesi işlemek üzere FKBP-FRB heterodimerization sistemine sahip bir yeni bileşik kafeste birlikte çalıştığı bir yöntem tarif.

Bu yaklaşımın üç sınırlamalar vardır. Metodu plazma membranında dimerizer difüzyonu önlenmesi veya izin bağlı olduğu Birincisi, hedef hücresel plazma membranında konuma yada çevresi olması gerekmektedir. KİB kimyasal yapısı daha ileri optimizasyon bileşik ışık ışınlama kadar dimerizasyon ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH araştırma fonu (DK090868 ve TI GM092930) tarafından desteklenmiştir. Kafesli bir rapamisin analog bir patent var.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif / ekipman Adı Şirket Katalog numarası
Rapamisin Tecoland RAPA99
FuGENE HD Roche 04709691001
Avidin Sigma A9275-10mg
DMSO Sigma D2650-5X5ML
Boyut-dışlama sütun GE Healthcare Spin Tuzak G-25
Cam alt 8-iyi kamara Thermo Scientific 12-565-47
Ters Floresan mikroskop Zeiss Axiovert200M
UV ışık kaynağı LED Rapp Opto Elektronik UVILED
Konfokal dönen disk Yokogawa Electric Corp CSU10
CCD kamera Photonics ORCA-ER
100x Objektif lens Zeiss Planı Apochromat

KİB Sentetik şeması (Copyright ACS2011) 6

figure-materials-1
Sentetik koşullar: (a) BnBr, K 2 CO 3, DMF (b) 3 f.HNO, AcOH (c), TFA (d) propargil-Br, K 2 CO 3, DMF, (e) gliserol, kedi. PTSA, Toluen (f) NaBH3CN, TiCl 4, MeCN (g) Tf 2 O, Piridin (h) metanol HCl, (i) LiAlH 4, THF (j) TsCl, Piridin, CH 2 Cl 2 (k) NaN 3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH 2 Cl 2 (m) 13, CuSO 4, askorbat, 2-propanol, 2 H, O, CH2 Cl2.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
  2. Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
  3. Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).
  4. Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).
  5. Komatsu, T. Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering. Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).
  6. Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity. J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).
  7. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).
  8. Kennedy, M. J. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).
  9. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
  10. Wu, Y. I. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
  11. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).
  12. Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).
  13. Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science. 314, 1454-1457 (2006).
  14. Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells. J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Small GTPase ActivityLight Induced ActivationRapamycin HeterodimerizationPhoto Caged RapamycinSubcellular LocalizationUV Light ManipulationMembrane Ruffling AnalysisSpinning Disc ConfocalFKBP FRB SystemRAC Activator Recruitment

İlgili makaleler