Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Özet

Protokol herpes virüs tip 1 (HSV-1) gecikme ve reaktivasyonu simpleks incelemek için etkin ve tekrarlanabilir model sistemi anlatılmaktadır. Assay homojen sempatik sinir kültürler kullanmaktadır ve RNA etkileşimi ve rekombinant proteinlerin ifadesi de dahil olmak üzere çeşitli araçlar kullanılarak virüs nöron etkileşimlerin moleküler Diseksiyon için olanak sağlar.

Özet

Herpes simpleks tip 1 (HSV-1) periferik nöronlarda bir ömür boyu gizli bir enfeksiyon oluşturur simpleks virüsü. Bu gizli rezervuar iletimi sağlamak ve klinik hastalığı katkıda tekrarlayan reaktivasyon olayların kaynağıdır. Şu antiviral gizli rezervuar etkisi yoktur ve hiçbir aşılar vardır. Litik replikasyon moleküler ayrıntıları iyi karakterize iken, nöronlarda gecikme kontrol mekanizmaları zor kalır. Gecikme Bizim bugünkü anlayış viral gen gereksinimleri ve immün yanıtın rolü tanımlamak için vazgeçilmez olan küçük hayvan modelleri kullanılarak in vivo çalışmalar türetilmiştir. Bununla birlikte, canlı hayvanlarda bağışıklık veya non-nöronal destek hücreleri tarafından aracılık enfeksiyon daha genel sonuçlarından virüsü-nöron ilişkiyi spesifik etkileri ayırt etmek imkansızdır. Buna ek olarak, hayvan deney ev sahibi manipüle edilmesi için, masraflı zaman alıcı ve seçenekler açısından sınırlıdırsüreçleri. Bu sınırlamaları aşmak için, bir nöron sadece sistem umutsuzca gecikme ve reaktivasyonu in vivo özellikleri üretir ama homojenlik ve erişilebilirlik açısından doku kültürü faydalar sunduğunu gereklidir.

Burada uyan HSV-1 gecikme ve reaktivasyonu okumaya sıçan üstün servikal gangliya (SCG) (Şekil 1) kültürlerinde birincil sempatik nöronlar kullanan bir in vitro model sunmak en değil, istenen tüm kriterleri eğer. Non-nöronal hücrelerin ortadan kaldırarak sonra, yakın homojen TrkA ⁺ nöron kültürleri litik çoğaltma bastırmak için asiklovir varlığı (ACV) HSV-1 ile enfekte olmaktadır. Aşağıdaki ZMA kaldırılması, sadakatle gecikme kabul işaretlerinden verimli kurulan sergilemek üretken olmayan HSV-1 enfeksiyonları. Özellikle, litik mRNA, protein ve bulaşıcı virüsün bile seçimi yokluğunda, farkedilmezler.Örneklerini, ancak gecikme ile ilişkili transkript (LAT) ekspresiyon nöronal çekirdeklerinde devam. Viral genomu nöron başına ortalama 25 kopya sayısında korunur ve verimli PI3-Kinaz / Akt sinyal veya sinir büyüme faktörü ¹ basit çekilmesi ile müdahale ederek çoğaltmak için bağlı olabilir. Viral proteini litik Us11 füzyonlu bir rekombinant HSV-1 kodlama EGFP kolaylıkla ölçülür kaynaklanan replikasyon aktive için işlevsel, gerçek zamanlı işaretleyici sağlar. Kimyasal işlemler ek olarak, bu tür lentiviral vektörler aracılığıyla RNA-etkileşim veya gen aktarımının gibi genetik metodolojiler başarılı bir şekilde çok zordur, imkansız olmasa, hayvanlarda olan mekanik çalışmalar izin sistemine uygulanabilir. Özetle, SCG tabanlı HSV-1 gecikme / reaktivasyon sistemi nöronlarda HSV1 gecikme ve reaktivasyonu olan çözüm bu yeni tedavilerin geliştirilmesi taze bakış açısı sunabilir viroloji köklü bir bulmaca kontrol eden moleküler mekanizmalar çözülmeye güçlü, gerekli bir araç sağlar hedef tdiye herpesvirus rezervuar gizli.

Protokol

1. Sıçan Embriyolar gelen SCG Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Bu protokol anlamak için yararlı bir bağlam sağlamak ve daha önce kapsamlı bir literatür tartışması için bu in vitro kültür, plaka kaplama yüzeyler ve serumsuz medya bileşenleri SCG temelini dahil SCG nöron kültürü kurulan yöntemleri, okuyucunun referanslar ^2-4 anılır.

1. SCG nöronlar için bir kaynak olarak sıçanların kullanımı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış etkin bir protokol çerçevesinde NIH esaslara uygun olarak yürütülmüştür.
2. Diseksiyon başlamadan önce, kollajen ve laminin kaplı 96 doku kültürü yemekleri hazırlamak. Bir çok-kanallı pipetleme cihazı kullanılarak, 0.66 mg / ml fare kuyruk kolajeni içeren bir çözelti ile bütün 96 kuyucuklu doldurun. Hemen kurtarıldı ve 8 diseksiyonlara için kullanılabilir kollajen, kaldırın. T çıkardıktan sonradiye kollajen, bir laminer akış başlık altında kuyu kuruması için çok önemlidir. Kurutmak için gereken zaman miktarı çanak kuyu sayısı bağlıdır. Örneğin, tipik olarak yaklaşık 5-10 dakika alır. kuruması için 96 tabak içinde kuyu, ancak 30 kadar sürebilir - 40 dk daha büyük bir biçimi 24 sıra çanak kullanılırsa. Düzgün yoksul SCG ekinde kuyuları sonuçları kurumaya başarısızlık. Daha sonra 2 mg / ml laminin bir çözüm kullanarak işlemi tekrarlayın. Eğer plaka sizin nöronlar (adım 1.14) hazır olana kadar 37 ° nemlendirilmiş bir _CO2 inkübatör C en az 2 saat ve laminin çözümü inkübe edin.
3. Ticari olarak elde hamile dişi sıçanlarda CO ₂ kullanılarak ötenazi edilir. % 70 etanol ile kadavranın püskürtme sonra, U-şeklinde bir kesi karın etrafında yapılır. Cilt geri soyma sonra, ikinci bir U-şekilli bir kesi karın kas duvarı aracılığıyla yapılır. Rahim karın kas tabakası yukarı kaldırarak üzerine görünür. 15 yılında rahim ve yeri kaldırcm çanak. Dikkatle içinde yavrular zarar vermemek için künt makas kullanılarak rahim açın. Her yavru kendi embriyonik kese serbest bırakılmalıdır, göbek kordonu kopmuş ve yavru% 70 etanol ve Kimwipes ile temizledi.
4. Bir diseksiyon kaput çalışan, gövde gelen kafa kesme tarafından doğmamış E21 sıçan yavrularına kurban. Sadece omuzlar üstünde, boyun dibinde makas yöneltin. Ganglia göstermek için, üç yerde 23 G iğne kullanarak başını (yukarı boyun tarafı) aşağı pin: ii) anterior cilt burun üzerinde yukarı çekti ve tutturulmuş; i) spinal kord ve iii) yemek borusu / trakea uzak tutturulmuş olmalıdır Boynun tabanından.
5. Karotis arter bifurkasyon (embriyo başına iki SCGs) her iki tarafında konumlandırılmış iki SCG * arayın. SCG sadece dalı altında yer almaktadır. Dışında çatallanma çekerek arterlerden SCG ayırın. L15-ortam buz üzerinde 15 ml konik tüpe (% 0.4 D (+)-glikoz ile desteklenmiş) 12 ml içine gangliya yerleştirin.

* SCG çatallanma çevreleyen opak, sarımsı yağ dokusu göre saydam ve renksiz. Ganglia toplamaya önce, kalan yağ dokusu ve kan damarlarının kadar çıkarmaya çalışın.

6. Tüm SCGs embriyoların hasat kadar 1.4 ve 1.5 tekrarlayın.
7. Yavaşça 600 rpm'de 1 dakika santrifüj ganglionlar ve aşırı medya aspire.
8. L15-ortam ihtiva tripsin (0.25%, EDTA olmadan) ve kolajenaz (1 mg / ml): 1 ml içinde yeniden süspanse gangliya. 37, 30 dakika boyunca inkübe ° C, 10 dak, her ajitasyon.
9. 600 rpm'de 1 dakika boyunca santrifüj tripsin ile inaktive etmek için C-ortam (1x MEM,% 0.4 D (+)-glikoz, 2 mM L-glutamin,% 10 FBS) 10 ml ilave edilir.
10. Mümkün * olarak tripsin / kollajenaz medya çıkarın ve C-medya 10ml ile ganglion yıkayın. 600 rpm'de 1 dakika santrifüjleyin. Bir kez bu adımı yineleyin.

* Artık kollajenaz etkileşimler olacakkültür plaka üzerinde hücre eki için gerekli kollajen tabaka ile yeniden.

11. Yıkama ortamı çıkarın ve C-media 1 ml yeniden askıya ganglionlar ve hücrelerin * büyük kümeleri ayırmak için bir 5 ml şırınga bağlı 21 G iğne kullanılarak öğütmek. Görünür kümeleri disosiye kadar 23 G iğne ile triturating bitirin.

* Bu hücreler zarar verir gibi değil, aşırı öğütmek için dikkatli olun. Tripsin ve kollajenaz tedavi başarılı olursa, bir onbeş maksimum yukarı ve aşağı 21 G iğne ile döngüleri ve 23 G iğne ile üç kür yeterli olacaktır.

12. 70 mikron naylon filtre [BD Biosciences hücre süzgecinden] aracılığıyla disosiye nöronlar filtreleme kalan topaklar atılması için 50 ml konik tüp içine.
13. Filtre hücre süspansiyonu ve canlı hücrelerin sayısını belirlemek için tripan mavi karışımı bir 10 ul tablet çekin. Aktif hariç hücre sayısını hesaplamaBir hemasitometre kullanarak Ude boya.
14. 37 ° C inkübatör (STEP 1.2) bekleyen 96 yemeklerinden laminin çözüm çıkarın. Laminin çıkarıldıktan sonra çanak kuru etmeyin, kaplama hücreler için hemen kullanılabilir. Kollajen ve laminin önceden kaplanmış 96 doku kültürü kabına - * 5,000-6,000 toplam canlı hücreler (kuyu başına 100 ul 50) dağıtın. C-ortamı içinde 50 ng / ml sinir büyüme faktörü (NGF) içerir.

Antibiyotik büyüme ortamı çıkarılmıştır çünkü * Çok iyi steril doku kültürü tekniği istihdam açısından çok önemlidir. Ayrıca, farklı tedarikçilerden kaynaklı kollajen arasında önemli farklılıklar olabilir. Biz Millipore, sıçan kuyruğu kollajen kullanarak toplu tutarlı sonuçları olmuştur.

15. Glukoz, 2 mM L-glutamin, 50 ng / ml NGF içeren B-27 takviyesi, - DIV (in vitro gün) 1 olarak, 50 ul NBM (% 0.4 D (+) ile plakası hücreleri için kullanılan C-ortam yerini 5uM aphidicolin ve 20 uM 5-fluorourasil [5-floro-2'-deoksipsödoüridin]. 5 gün süre ile inkübe kültürler *. Bu noktada, tripsinize ve birkaç kuyu kalan hücre sayımı anti-mitotik ajanı tedavisi kalan nöronların numarasını belirleyebilir. Tipik olarak, yaklaşık 1.000 nöronlar 96 plaka iyi başına kalır.

Mantar veya bakteri kontaminasyonu ile * Sorunları kültürünün ilk 24 saat içinde genellikle belirgindir. Önce kaplama medya değiştirmektir mikrobiyal büyüme için dikkatle de her inceleyin. Kuyuları, sadece sınırlı sayıda etkilenir, bunlar PBS ile yıkanır ve deneyi ile devam etmek üzere kurutulur seyreltilmiş ağartma çözeltisi ile muamele edilebilir. Biz kuyuların bile sınırlı sayıda mikrobiyal kirlenme vardı herhangi bir deney tekrar öneririz. Kapsamlı mikrobiyal kontaminasyonu 96 çanak gözlenmesi durumunda, deney sonlandırılmalıdır.

2. Kült SCG EnfeksiyonGecikme HSV-1 Us11-EGFP ve Kuruluş ile ures

Temel virüs yayılımı, belirleyici virüs titresi, ve enfeksiyon (İB) çokluğu dahil virolojik teknikler hakkında yararlı arka plan için, okuyucu ⁵ başvurmak anılır. Herpesvirus biyoloji ile ilgili bir tartışma için, okuyucu ⁶ başvurmak anılır. Son olarak, okuyucunun SCG nöronların alfa-herpesvirus litik enfeksiyonu ile ilgili olarak önceden örnekleri, diğer protokolleri ve ek bir arka plan ve gecikme ve aktive incelemek için bizim protokolü uyarlamaları ile karşılaştırma için ^7-10 referansları da adlandırılır.

1. DIV 6, her iyi * mevcut medya asiklovir (ZMA), son konsantrasyonu 100 uM ekleyin. Her bir kuyunun 50 ul içeriyorsa Örneğin, 300 uM ZMA stoku 25 ul ekleyin. Tipik olarak, ACV enfeksiyondan önce gece ilave edilir, fakat, aynı zamanda enfeksiyonundan önce, 6-8 saat eklenebilir.

* Bu exher zaman nöron gereksiz fiziksel manipülasyonu en aza indirmek için ceedingly önemlidir. Basitçe çıkarmadan ve medya değiştirilmesi veya virüs stokları ile enfekte çok nazik ve yavaş yapılmalıdır. Aksi takdirde, ortaya çıkan mekanik stres olumsuz nöron canlılığı üzerine etkileyebilir.

2. DIV 7, 1 -2 arasında bir enfeksiyon çokluğu (İB) (optimal MOI belirlenmesinde aşağıda önemli yorumu bakın) HSV-1 Us11-EGFP (ref ¹¹ tarif) ile SCG kültürlerin enfekte *. Doğrudan yanı içerisinde mevcut medya seyreltilmiş virüsü ekleyin. Bir mock-enfekte kontrolü ve ZMA yoksun ortamda bir litik enfeksiyon pozitif kontrol içerir. Enfeksiyonuna 37 az 2-3 saat boyunca ilerlemesine izin ° C.

* İçişleri Bakanlığı Vero hücreleri ¹² ve adım 1.14 iyi başına ekilmiş kaplı, canlı hücrelerin sayısında bir plak testi yapılarak belirlenir virüs titresi kullanılarak hesaplanır. Bu hesaplamada, sadece bir işlevsel açıdan yararlıtoplam hücre sayısı gibi tohumlu kirlenmesine glia ve fibroblastlar ile birlikte nöronlar içerir. Bu tehlike bölünen hücreleri anti-mitotik ajanlar ile muamele ile öldürülür olarak, kalan nöronlar için MOI etkili aslında büyüktür. 5000 ilk başlangıç ​​miktarı Nereden - 6,000 canlı hücreler, yaklaşık 1.000 nöronlar anti-mitotik ajanlar (as tripsinize ve doğrudan hücre sayımı ile değerlendirilen) ile tedavi sonrası kalır. Nöronal kültürlerin bulaşmasını kullanmak üzere İçişleri Bakanlığı optimum bir virüs hamur hazırlama diğerine biraz değişebilir. Virüs her yeni hazırlanması ile, farklı MOI Kullanıcı 1 2 sınırlı sayıda test etmenizi öneririz. Burada amaç nöron canlılığı ve indüklenebilir reaktivasyonu olaylar (3. bölümünde tanımlandığı gibi) en fazla sayıda sonuç üzerine en az etkisi olan bir belirlemektir. Us11-EGFP virüs hızla koşullarının optimize özellikle yararlıdır ama aynı zamanda plak testi veya quanti gibi diğer readouts kullanabilirsiniztative PCR. Bu gerekli ve rutin olarak olmasa da, hücre canlılığı azaltmak kirleri ortadan kaldırmak için bir sükroz yastık ile saflaştırılmış virüs kullanmak yardımcı olabilir.

3. 50 ng / ml NGF ve 100 uM ZMA * içeren taze NBM ile enfeksiyon medyanın dikkatli bir biçimde yerleştirin.

* Bu enfeksiyon ortam değiştirirken ÇOK nazik olmak çok önemlidir. Kuyunun duvarında yerine kuyunun dibinde pipet ucu Amacı ve medya hafifçe hücreleri üzerine aşağı kaydırın sağlar. Pipet medya bile hızlı ejeksiyon substrattan aksonları ayırmak ve hücreler bir yaprak gibi normalde hücrelerin ve kir neden olmak için yeterli gücü oluşturabilir. Nöronlar detach (% 20-30) ve yalnızca sınırlı sayıda olursa, sonuçları hücrelerin sağlıklı görünen kaydıyla en az düzeydedir. Müstakil nöronların zamanla iliştirmeniz muhtemeldir, ancak aksonlardan güzel bir şekilde, artık, bir uzatılırd yeni aksonlar regrow olacaktır. Iyi olmasa da kuyuların sadece sınırlı sayıda etkilenir da, deney devam edebilirsiniz. Nöronların geniş dekolmanı (% 70-80) varsa, biz deneyde etkilenen iyi (ler) de dahil olmak üzere önermiyoruz. Kuyuların çoğunda% 70-80 müstakil nöronlar içeriyorsa, deney sonlandırma öneririz. Nöronlar hala yatıştırıldı karşın, genellikle büyük öbekler şeklinde olacaktır. Bu bireysel yeniden nöronların düzgün bir değerlendirmesini zorlaştırmaktadır. Biz müstakil nöronlar ile kuyu reaktivasyon oranlarının kuyulara nöronların diferansiyel bağlılık etkisi olmadığını sağlamak için gözlenmiştir herhangi bir deney tekrar öneririz.

Buna ek olarak, her zaman yavaşça gibi muhtemel olarak kültürler işlemek için kritiktir. Gereksiz, ani hareketlerden (tekrar açılması dahil olmak üzere ve bir kuluçka odasının kapısının kapatılması) veya güçlü medya uygulama c Mekanik stresould uzlaşma muhtemelen belirli bir deneyde spontan reaktivasyonu kabul edilemeyecek kadar yüksek oranları ile sonuçlanan, HSV-1 gecikme desteklemek için kültürler yeteneği.

4. Virüs gecikme kuracak ve bu süre içinde 6 gün boyunca kültürleri koruyun. Bu dönemde, litik replikasyon göstergesi olarak nöron sağlık ve Us11-EGFP ifade izlemek için bir floresan mikroskop kullanın. Us11-EGFP başarılı primer enfeksiyon ve üretken litik replikasyon gösteren, SADECE ZMA tedavi eksik kontrol kuyuları tespit edilmelidir. Nöronlar daha verimli bir viral büyüme yokluğunda sitopatik etkiler gösterebilir. Enfekte kültürleri yakından izlenmeli ve mock-enfekte nöronlara göre olmalıdır.

3. Yeniden ve Değerlendirme

1. DIV 14 yaşında dikkatle ZMA yoksun taze medya ile ACV içeren medya değiştirin. Eğer uygunsa, bu zamanda farmakolojik (veya biyolojik) değişkenleri içerir. Be s2.3 'de belirtilen önlemlerin takip ure.
2. Bir 5 ila 6 günlük süre içinde, reaktivasyon geçiren nöronlar algılamak için bir floresan mikroskop kullanılarak canlı kültürler izlemek. Alternatif analizler diğer türleri (protein, nükleik asit, plak testi vb) için örnekler toplamak.
3. EGFP-pozitif nöron içeren kuyu sayısı sayarak reaktivasyonu frekansı hesaplamak ve örnek kuyu sayısı bir oranı olarak bu ifade. Bir kişide EGFP ifadesi de bir ilköğretim reaktivasyon olay ve viral yayılması nedeniyle sonraki enfeksiyonu ayırt etmez unutmayın. Bulaşıcı yayılma de, tek bir kültür bulunmadığı için, çok iyi bir veya daha fazla EGFP-pozitif nöronlar işlevsel olarak bu koşullar altında aktive bir olay olarak tanımlanır.

^{1 'de} tarif edildiği gibi * Çoklu aktive olayları, bir kültür oluşabilir. Reaksiyon kaynaklanan viral yayılma bir birincil reaktivasyon olayı ayırt etmek için tivation, encapsidation inhibitörü WAY-150138 eklenebilir. Encapsidation engelleyerek, bulaşıcı virüsün ürettiği ile aktive kaynaklanan geçmez mümkün değildir. Böylece, WAY-150.138 varlığı tespit EGFP sinyali iyi ^1,13-15 bir singe kültürü içinde bağımsız reaktivasyon olayların sayısını yansıtır. WAY-150138, ticari olarak mevcuttur, sadece HSV-1 Patton suşu karşı etkili ve olmadığına dikkat edin. WAY-150138 bir alternatif olarak, aşağıdakilerden herhangi biri kullanılarak göz önüne: i) komşu hücreler yayılmış kabiliyetini bozulmuş bir mutant virüs kullanılabilir; EGFP sürekli varlığında bir IE promotörü ile ifade edilir ii) bir haberci virüsü Bir IE gen ürünü yöneltilmiş immünofloresan kullanarak antikorlar tarafından takip geç gen ekspresyonu (ve bulaşıcı bir virüs üretimi) önlemek için PAA veya ZMA ile iii) tedavi; ZMA'nın.

4. Test kullanarak Yeniden Değerlendirmek için Alternatif Yöntem

Bir birey, tek bir deneyden ontent "> Sonuçlar SCG tek bir preparat elde edilmelidir. her kopyalayan bir tek SCG kesikli kullanılarak gerçekleştirilmiştir olarak Replicate deneyler sürece, bağımsız SCG preparatları ile gerçekleştirilebilir.

1. HSV-1 litik transkript değerlendirilmesi. Reaktivasyon farklı deneysel indükleyicileri varlığı ya da yokluğu ZMA çıkarıldıktan sonra istenilen zamanlarda RNA toplayın. 96 kültür plakları kullanırken, (RNA numune başına kabaca 10 ⁵ hücreleri) her bir örnek için birlikte en az 20 kuyu havuzu öneririz. Alternatif olarak, SCGs (24 sıra plaka için, / hem 4-5 x10 ⁴ hücrelerin kullanımı gibi) daha büyük kuyu kaplama yapılabilir. Bu az 20 kuyu, küçük hacimlerde yersiz örnek-to-örnek değişkenliği dahil sonucu RNA tespit etmek kesinlikle mümkün olsa da.
2. HSV-1 litik proteinlerin tespiti. Reaktivasyon indüksiyonundan sonra istediğiniz saatte lizatları toplayın. 10 w her birine lizis tamponu, 7.5 ul eklemebir 96 plaka arşın ve SDS-PAGE ve immunoblotting tarafından analiz. Alternatif olarak, viral protein indirekt immunfloresan mikroskop ile tespit edilebilir. İlk kaplama (1,10 bakınız) gibi Kolajen ve laminin uygulanmasından önce poli-D-lizin (0.2 mg / ml, Sigma) ile önceden kaplanmış oldu steril bir cam coverslip gibi görüntüleme için bir yüzey üzerine monte yapılmalıdır .
3. Bulaşıcı maddelerin tespiti. Reaktivasyon üzerine kültür süpernatant toplayın. Üstte kalan sıvı kısmın seri seyreltiler kullanılarak Vero hücrelerinin tek katmanlarını bir plak assay gerçekleştirmek. Buna ek olarak, plak deneyleri titresi belirlemek için hücre içerecek şekilde ilgili parçacıkların dondurularak-çözülmüş kültürlerin lizatları kullanılarak gerçekleştirilebilir.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 2A 1 uM trichostatin A (TSA), aktive ^16-18 arasında bilinen bir indükleyici, yaban-tip H ile enfekte latent kültürler SCG uygulanan bir örnek gösterilmiştirSV1 EGFP-Us11 muhabiri süzün. TSA ile reaktivasyon 2 gün içerisinde maksimum% 50 ulaşır ve 5 gün kuyuların yaklaşık% 60 az reaktivasyonu platolarla. Baz hattı ('spontan') reaktivasyonu bu deneyde yaklaşık% 10 ve genellikle in vitro sistemde bu kullanarak% 10-20 arasında değişir. Maksimum reaktivasyon seviyeleri reaktivasyonu indükleyici kullanılmaktadır bağlı olarak değişir. Birçok reaktivasyon indükleyicileri üretken viral replikasyon karışmaz gibi deney süresince uygulanan, ancak bu ampirik olarak tespit edilmesi gerekiyor olabilir. Nöronların canlılığını etkiler veya viral üretken yaşam döngüsünün tamamlanması engelleyen herhangi bir reaktif dahil diğer indükleyiciler, geçici bir darbe uygulamasını etkinleştirme provoke etmek isteyebilir.

Şekil 2A tasvir deney her iyi EGFP-Us11 birikimi gecikme gelen reaktivasyon göstergesi iken, ayrım yapmaz mıBireysel nöronlarda Us11-EGFP sinyali, bağımsız bir aktive olay veya kültürü ile bir aktive virüs spread türetilmiştir. Her bir yanı içerisinde bağımsız aktive olaylar geçiren nöronların numarası değerlendirmek için, kültürler WAY-150138, özellikle viral genom DNA ^13-15 arasında encapsidation önleyerek engeller viral yayılma bir bileşik ile ön-muamele edilmiştir. Enfekte sempatik nöron kültürleri WAY-150.138 ve TSA ile uyarılan reaktivasyonu ile tedavi edildi. EGFP-pozitif nöron önemli sayıda tek bağımsız reaktivasyon olayların bir numara (Şekil 2B) bireysel kültür başına meydana gösteren, DMSO ile tedavi edilen kontrol kültürleri ile karşılaştırıldığında, TSA-tedavi kuyu tespit edildi.

Bizim deneyde, Us11-EGFP raportör endojen Us11 promotör ¹¹ den ifade edilir. Us11 olduğu bir "gerçek-geç" ya da γ ₂ viral litik gen, viral DNA replikasyonu sağlam expressi için gereklidirüzerinde. EGFP-Us11 birikimi PI3-kinaz inhibitör LY294002 ile yeniden üzere uyarılan kültürlerde viral DNA polimeraz inhibitörü phosphonoacetic asit (PAA) tarafından etkilenmektedir olarak, Şekil 3 'de gösterilmiştir.

Şekil 1.. HSV-1 ve gecikmeli aktive incelemek için in vitro sisteminde kültüre nöron kullanılarak tipik bir deneysel protokol gösteren şematik. 1) E21 sıçanların üstün servikal gangliya (SCG) kesme sonra, ayrışmış nöronlar 96 tabaklarında kaplanmış olan ve anti-mitotik ile muamele ajanlar nöronal olmayan hücreleri çıkarmak için. 2), in vitro (DIV) içinde 6 gün sonra kültür varlığında asiklovir (ACV), bir antiviral madde in virus-kodlanmış Us11 geç geni (EGFP-HSV-1) ile kaynaşmış EGFP içeren rekombinant HSV-1 ile enfekte olduğu bloklar litik çoğaltma. 3) 14 günlük olarak (DIV 14), asiklovir kaldırılır ve EGFP-ifadesialgılanmaz. Kültürler stably 1 ay veya daha fazla bu şekilde muhafaza edilebilir, veya bir test değişken gecikme ile aktive provoke kabiliyetini değerlendirmek için ilave edilebilir. Değişken ya bir genin spesifik shRNA veya bir ektopik ifade proteini ifade eden bir küçük molekül kimyasal inhibitörü, bir çözünür nörotrofin veya hücre yüzey proteinine karşı bir antikor ya da bir lentivirüs şeklinde olabilir. Yeniden sonra gerçek zamanlı olarak EGFP pozitif kuyuları puanlama tarafından izlenir.

Şekil 2. TSA SCG kültürlerde HSV-1 reaksiyona. Şekil 1 'de tarif edildiği gibi SCG kültürler latent enfekte edilmiştir. DIV 14 yaşında ZMA medya 1 uM trichostatin içeren kaldırıldı ve yerine A (TSA). (A) kültürleri görüntülendi ve 5 gün süreyle ilaç tedavisinden sonra her gün floresan mikroskobu kullanılarak skorlandı. Tekrar aktif geçiren kuyuların yüzdeDeney boyunca iyon DMSO kontrolü ile tedavi edilen kültür göre gösterilmiştir. Reaktivasyon yüzdesi, bir 96 bölümlü kültür plakasının 20 kuyu dışarı EGFP-pozitif kuyu sayısına göre hesaplanmıştır. Hata çubukları ortalama standart hata belirtir. (B) latent enfekte kültürler TSA ve viral DNA encapsidation bir inhibitörü, WAY-150138 (20 ug / ml) ile muamele edildi. EGFP + nöronların sayısı DMSO ve WAY-150138 ile muamele kontrolü için ilaçlar ile tedaviden sonra 48 saat karşılaştırılmıştır. Her veri noktası iyi bir kültürde 1000 nöronların EGFP + nöronların dışarı oranını temsil eder. Çubuk, iyi EGFP ortalama yüzde + nöronlar gösterir.

Şekil 3. EGFP detecion viral DNA replikasyonu bağlıdır. SCG kültürler latent sonra LY29004, aktive ^1, bilinen bir indükleyici ile 10 uM ile muamele enfekte edilmiştir. LY (mavi) wa tarafından uyarılan Yenidens viral DNA sentezi inhibitörü, phophonoacetic asit, PAA (300μg/ml, kırmızı) ve iki birlikte bileşikler (yeşil) ile tedavi edilenlere göre.

Tartışma

Bu primer nöron kültürü ve enfeksiyon sistemi HSV-1 gecikme ve reaktivasyonu altında yatan moleküler mekanizmaları keşfetmek için basit ve etkili bir yöntem sağlar. Sistem sadakatle özetlediği insan enfeksiyonları hem de hem canlı hayvan modellerinde belirlenen gecikme kabul özellikleridir. Virüs SCG kültürlerinde gizli olduğunda, bulaşıcı parçacıklar ve viral litik gen ürünleri tespit edilemez. Latent enfekte nöron tespit sadece viral gen ürünü çekirdeklerin içinde birikir kodlamayan LAT transkript var...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif	Şirket	# Kataloğa	Yorumlar
70μm naylon filtre (hücre süzgecinden)	BD Biosciences	352350
1x Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS - / -)	Invitrogen	14175	w / o CaCI2 ve MgCl2
1x Minimum Essential Medya (MEM)	Invitrogen	11095-080
5-Fluoro-2'-deoksipsödoüridin	Sigma	F0503	-20 ° C'de mağaza, 1x MEM 20 mM stok hazırlamak
96-düz sıra alt TC plakaları	Corning	3599
Asiklovir	Calbiochem	114798	-20 ° C'de mağaza; DMSO içinde 31 mM stok hazırlamak
Aphidicolin	Calbiochem	178273	-20 ° C'de mağaza; DMSO içinde 10 mM stok hazırlamak
B-27 Ek	Invitrogen	17504-44
Kollajenaz	Sigma	C2674	-20 ° C'de mağaza; - / - HBSS 10 mg / ml stok hazırlamak
D-(+)-glikoz	Sigma	G6152	H 2 O% 40 hisse senedi hazırlamak; filtre 4 de sterilize & saklamak ° C
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Laminin	Sigma	L2020	Hızlı dondurma 20 ul; H2O 1 mg / ml stok hazırlamak-80 at aliquats & mağaza ° C; seyreltilir 2 mcg / ml çalışma kons. Steril H 2 O
Leibovit'z L-15 ortam	Invitrogen	11415
Sinir Büyüme Faktörü	Harlan Laboratuvarları	BT.5017	- / - HBSS içinde 50 mcg / ml stok hazırlamak; -80 ° C de mağaza
Neurobasal orta	Invitrogen	12348
Phosphonoacetic asit (PAA)	Sigma	P6909	-20 ° C'de deposu; H2O içinde 75 mg / ml stok hazırlanması
Poli-D-lizin hidrobromür	Sigma	P0899	-20 ° C'de deposu; H2O içinde 20 mg / ml stok hazırlanması
Rat-tail kollajen	Millipore	08-115	Konsantrasyon kaynağı sürü ile değişir; 4 de mağaza ° C ve seyreltik için 0.66 mg / ml çalışma kons. Steril H 2 O
Trichostatin A	Sigma	T8552	-20 ° C'de mağaza; DMSO 1 mM stok hazırlamak
Tripsin% 2.5	Invitrogen	15090-04