Method Article

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

DOI:

10.3791/3884

⸱

June 8th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Microbiology and Preventive Medicine, Iowa State University, 2Amnis Corporation, 3Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, RAW 264.7 hücreleri tarafından polianhidrid nanopartiküller veya bakteri içselleştirilmesi ölçmek için multi-spektral görüntüleme sitometrisi kullanan bir metodu tanımlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanopartikül sistemleri antijen sunan hücreler 1-5, verimli proteinler de dahil olmak üzere kargo, sağlama yeteneklerine aracılığıyla aşı teslim değerli araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Antijen sunan hücreler tarafından nanopartiküllerin içselleştirilmesi (NP) kapsüllü antijen için etkin bir bağışıklık yanıtı elde edilmesinde kritik bir adımdır. Nanoparçacık formülasyon etkisi işlevi nasıl değişiklikleri belirlemek için, biz içselleştirilmiş nanopartiküller yanı sıra bakteri tespit ile uyumlu olan bir yüksek verimlilik, nicel deneysel protokol geliştirmeye çalıştılar. Bugüne kadar, iki bağımsız teknikleri, mikroskobu ve akım sitometri, nanopartiküllerin fagositoz incelemek için kullanılan yöntemler olmuştur. Flow sitometri ile yüksek verimlilik doğa sağlam istatistiki veriler üretir. Ancak, düşük çözünürlük nedeniyle, doğru bir hücre bağlı nanopartiküller karşı içselleştirmiş ölçmek için başarısız olur. Mikroskopi yüksek uzaysal çözünürlüklü görüntü üretir; however, zaman alıcı ve küçük örneklem büyüklüğü 6-8 içerir. Çoklu-spektral görüntüleme akım sitometri (MIFC) laminar çekirdek ile eş zamanlı olarak çoklu renk spektral floresans ve parlak saha görüntüleme gerçekleştirir mikroskobu ve akım sitometri hem de yönlerini birleştiren yeni bir teknolojidir. Bu yetenek floresan sinyal yoğunluğu ve değişik yapıda ve yüksek hızda cep telefonu özellikleri arasındaki mekansal ilişkilerin doğru bir analizi sunar.

Bu yazıda, polianhidrid nanopartiküller veya Salmonella enterica serovar Typhimurium içselleştirmiş olmaları hücre popülasyonu karakterize etmek MIFC kullanan bir metodu tanımlar. Ayrıca nanoparçacık süspansiyonları, hücre etiketleme, bir ImageStream X sistemi üzerinde elde edilmesi ve IDEAS uygulamasını kullanarak veri analizi hazırlanmasını açıklar. Ayrıca interne p ayırt etmek için kullanılan bir tekniği uygulaması gösterilmektediraktin-aracılı fagositozunu bir inhibitörü olarak Sitokalazin-D kullanılarak nanopartiküller ve bakteriler için athways.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. RAW 264.7 Hücre Kültürü

  1. Kendilerinin bir hücre kazıyıcı ile onları hafifçe kazıyarak konfluense ulaşmak onların şişeleri ile Hasat RAW 264.7 hücreleri. % 10 ısı-inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS), 2 mM Glutamax; 5 x 10 5 hücrelik bir yoğunlukta / kuyu 0.5 mL komple Dulbecco Modified Eagle Medium (cDMEM içinde bir 24-kuyucuklu hücre kültürü çanağı içine sayısı ve plaka bunları ve 10 mM HEPES) ve% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.

2. Patojenik Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028 Dönüşüm ve Kültür

  1. S yeşil floresan protein (GFP)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışmalar poli (laktik-co-glikolik asit (PLGA) veya polyanhydrides dayalı biyolojik olarak parçalanabilir nanopartiküller Hedef hücrelere kapsüllenmiş antijenler ya da ilaçlar sağlamak için de kullanılabilir olduğunu göstermiştir. Fagositik hücreleri tarafından bu Nanopartiküllerin Uptake böylece niceliksel verme, etkinliğinin için önemlidir . roman nanoparçacık dağıtım sistemlerinin tasarımında kritik içselleştirme analizi bu yöntemi kullanarak, çeşitli hücre tipleri tarafından nanopartiküllerin diferansiyel alımı kol.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sherree L. Arkadaş ImageStream X sistem üretmektedir Amnis Corporation tarafından istihdam edilmektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar için mali ONR-MURI Ödülü (NN00014-06-1-1176) ve ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı (Grant Numaraları W81XWH-09-1-0386 ve W81XWH-10-1-0806) teşekkür etmek istiyorum destekliyoruz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
RAW 264.7 hücre hattı American Type Culture Collection'dan (ATCC) TIB-71
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Cellgro 10-013-CV
Fetal sığır serumu Atlanta Biologicals S 11150 Premium Grade
Glutamax Gibco 35050-061
HEPES Gibco 15630-080
24-kuyulu plakalı DYP 92024
Hücre kültürü şişeler DYP 90151
Hücre kazıyıcı DYP 99002 24 cm
Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028
BTX ECM630 Elektro Hücre Manipulator BTX Harvard Apparatus
MOPS Fisher Scientific BP308
Fosfat (PBS) tamponlu Cellgro 21-040-CV
Ultrasonik sıvı işlemci Misonix S-4000
Sitokalazin-D Sigma-Aldrich, C8273
Formaldehit Polysciences 04018
Tampon yıkayın % 2 ısı inaktive FBS, PBS içerisinde% 0,1 sodyum azid.
Tampon yıkama / Perm BD Biosciences 554714
Ek kap mikrotüplerdeki Temizle-görüntülemek Sigma T4816
Alexa Fluor Phalloidin 660 Invitrogen A22285
ImageStream X Amnis CorporaTION 100200 Seçenekler: 658nm lazer, otosampler'li
Sodyum azid Fisher Scientific S 227I-500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases. PLoS One. 6, e17642(2011).
  2. Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jac....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multispectral Imaging Flow CytometryNanoparticle InternalizationBacterial PhagocytosisActin dependent InternalizationCytochalasin D InhibitionImageStreamX SystemIDEAS Analysis SoftwareFluorescent Signal IntensitySpatial Resolution AnalysisInternalization Feature Quantification

Related Articles