Yöntem makalesi

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

18.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/3995

⸱

3 Aralık 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Howard Hughes Medical Institute, University of Utah

Bu makalede

Özet

Biz elektron mikrograflarında fluoresan ışığı ile işaretlenmiş proteinler yerelleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Floresans ilk ince kesitler üzerinde fotoğraf ile aktive localisation mikroskopi kullanılarak yerelleştirilmiştir. Bu görüntüler daha sonra aynı bölümde elektron mikroskop ile hizalanır.

Özet

Proteinlerin dağıtım eşlenmesi, bir hücre içinde proteinlerin işlevine anlaşılması için gereklidir. Floresan mikroskobu yaygın Protein lokalizasyonu için kullanılan, ancak Subselüler bağlamda floresans görüntülerde genellikle yoktur edilir. Immuno-elektron mikroskopisi, diğer taraftan, proteinler lokalize olabilir, ancak en fazla antijen numune yüzeyine maruz değildir çünkü tekniğin uygun antikorlar, morfoloji ve zayıf korunmuş yokluğu yüzünden kısıtlıdır. Korelatif yaklaşımlar da immüno-floresans veya genetik tagged proteinler, önce bir bütün hücre floresan görüntü elde edebilirsiniz. Örnek sonra sabitlenir ve elektron mikroskobu için gömülü ve görüntülerin 1-3 ilişkilidir edilir. Bununla birlikte, düşük çözünürlüklü fluoresans görüntü ve indirgeme belirteçlerin olmaması proteinin tam olarak lokalize engellemektedir.

Alternatif olarak, floresan görüntüleme plastik olarak numune korunması sonrasında yapılabilir. IçindeBu yaklaşım, blok kesitli ve floresans görüntüler ve aynı bölümün elektron mikroskop 4-7 ilişkilidir. Bununla birlikte, görüntü içinde ilintili ışık kırınım sınırı bireysel moleküllerin yerleri gizler, floresans ve sık sık hücre sınırlarının ötesine uzanmaktadır.

Nano-çözünürlüklü floresan elektron mikroskobu (nano-FEM) foto-aktive localisation mikroskobu (PALM) ve elektron mikroskopi kullanılarak görüntüleme aynı kesimler tarafından nano-ölçekte proteinleri yerelleştirilmesine için tasarlanmıştır. PALM görüntüleme bireysel floresan proteinleri tarafından kırınım sınırı aştı ve daha sonra her floresan nokta 8-10 Centroid haritalama.

Biz beş adımda nano-FEM tekniği özetlemektedir. İlk olarak, örnek sabit ve etiketlenmiş proteinlerin floresan korumak koşullar kullanılarak yerleştirilmiştir. İkinci olarak, reçine bloklar monte edilmiştir ultra-ince bölümler (70-80 nm) olarak bölünmüştürBir kapak camına. Üçüncü olarak, floresans Zeiss PALM mikroskop kullanarak bu bölümlerde görüntülenmektedir. Dördüncü, elektron yoğun yapıları taramalı elektron mikroskobu kullanılarak bu aynı bölümlerde görüntülü. Beşinci olarak, floresans ve elektron mikroskop indirgeme belirteçleri olarak altın parçacıkları kullanılarak hizalanır. Özet olarak, fluoresan etiketli proteinlerin hücre altı lokalizasyonu yaklaşık bir hafta içinde nm çözünürlükte tespit edilebilir.

Protokol

1. Yüksek basınçlı Donma

  1. Da numune için uygun bir ortamda (örneğin, hücre kültürleri için kültür ortamı, C. elegans için M9) 1 ml BSA içine 0.2 g eklenmesi ile kriyo-koruyan hazırlayın. Her BSA eriyene kadar 37 ° C su banyosu içinde tüp inkübe edin.
  2. Dondurma öncesinde, sıvı nitrojen ile otomatik donma-ikame cihazı (Leica AFS) doldurun
  3. AFS programı ayarlayın: -90 ° C 5-30 saat *, 5 ° C / saat -60 ° C, -60 ° 2 saat (ya da Leica AFS 2 kullanıyorsanız "pause" seçeneğini seçin) için C, 72 saat için 5 ° C / saat için -30 ° C ve -30 ° C. AFS makinenin fazla beş adım olma özelliğine sahip ise, -30 ° C adım 0 saat ayarlanmış bir "duraklama" seçeneği ile değiştirilmesi gerekir, ve iki ileri adımlar eklenmelidir: 10 ° C / -20 ° sa -20 ° C de 24 saat ve C Makinenin beş adım ile sınırlı ise, aşağıdaki gibi farklı bir bellek yuvasına başka bir program kurmak: 10 ° C ile -20 / sa ° C ve 24 saat-20 ° C'de r
    Burada * saat -60 ° C adımı sabah erken başlayan şekilde ayarlanabilir.
  4. Susuz aseton (EMS, # RT10016) 10 ml 0,1 g osmiyum tetroksit kristaller (EMS, RT19134) karıştırılması ile% 1 osmiyum tetroksit stok çözelti hazırlayın. Aşağıdaki gibi, bir 50 ml'lik konik bir tüp içinde fiksatif hazırlayın. Birincisi, milliQ su 1 ml ekleyin ve sonra potasyum permanganat 0.02 g (EMS, RT20200) çözülür. Aseton 19 ml ekleyin ve iyice karıştırın. Son olarak, tüp içine% 1 osmiyum stok solüsyonu 20 ul ilave edin. Aseton, bir serbest-radikal süpürücü 11 olduğunu ve bu nedenle plastik polimerizasyon önler, ancak dondurularak-ikame ortamı olarak aseton kullanımı nedeniyle lipid ile etkileşimi morfolojisini muhafaza etmek için gereklidir. Aseton plastik sızma önce etanol ile ikame edilir. Tablet 1 Her cryovial için ml ve sıvı azot içinde tüpler depolayarak donmuş fiksatif tutun.
  5. % 20 BSA veya bakteri ile bir numune taşıyıcı doldurun.% 20 BSA ve bakteri Hem kriyo-koruyucuları olarak hizmet vermektedir. Örnek taşıyıcının tipi için tercih numune bağlıdır. C. için elegans, iyi bir 100 mikron kullanın.
  6. Taşıyıcıya örneği yerleştirin ve bir yüksek basınç dondurucu kullanarak dondurma.
  7. Dondurma işleminden sonra ve sıvı azot altında, fiksatifler içeren cryotube içine örnek aktarın. Numunenin her zaman sıvı altında kalır emin olun.
  8. ) 1.5 Tekrar - 1.7) tüm örneklerin donmuş kadar.
  9. AFS biriminin içine tüm cryotubes aktarın ve program kaldığı yerden devam.

2. Freeze-ikame

  1. Sıcaklık -60 ° C'ye ulaştığı zaman, AFS olarak% 95 aseton ihtiva eden 20 ml yer kapsüller.
  2. Sıcaklığı -50 ° C ulaştığında, altı kez 2 saatlik dönemi boyunca% 95 aseton ile fiksatif değiştirin.
  3. Odasına% 95 aseton içinde% 0.1 'lik uranil asetat, 20 ml (Polysciences, # 21447-25) içeren bir şişe yerleştirin veön-serin -50 ° C
  4. Yıkama aşamasının sonunda, her bir şişeye uranil asetat solüsyonu ~ 1 ml eklenir. Gerekirse programı unpause.
  5. Sıcaklığı -30 ° C ulaştığında, altı kez 2 saatlik dönemi boyunca% 95 etanol ile uranil asetat değiştirin.
  6. Bu arada, 22.3 ml GMA, 10ml n-bütil metakrilat, 1 ml milliQ su ve 0,2 g benzoil peroksit karışımı ile% 97 glikol metakrilat rezin (GMA, SPI Malzemeleri / Yapı Probe, Inc # 02630-AA) makyaj (katalizör). (EMS, # 72632) cam şişe içinde saklayın ve% 95 etanol ile karıştırılarak% 30 GMA hazırlamak. Polimerizasyon kaliteli polietilen bazlı plastik uzun süreli depolama düşürür çünkü plastik tüplerde GMA medya tutmayın. -30 ° C'ye Pre-serin GMA çözümü
    Onlar susuz ve floresan proteinleri doyurur hangi asidik olduklarından böyle Araldite ve EPON gibi geleneksel epoksi reçine protokolde kullanılamaz. Böyle LR Beyaz, c Akrilik reçineler,bir su ve küçük bir miktar tolerans ve floresan protein korumak, ancak onun asidik pH fluorofor 12 gidermek eğilimindedir. GMA aslında, su gerektiren bir miktar ve (PH8) 12 alkalidir, tolere eder. GMA ne yazık ki biraz kırılgandır. Ayrıca, GMA geleneksel epoksi reçine yok gibi dokuları ile çapraz bağ değil. Kaliteli kesit GMA neden tutarsızlık Bu özellikler özellikle 80 nm den daha ince kesitli.
    GMA raf ömrü yaklaşık bir yıl olmasına rağmen, GMA kalitesini sağlamak için satın alma 3 ay içinde kullanılmalıdır.

3. Sızma ve Polimerizasyon

Adımlar 3.1-3.3 dondurularak-ikame için kullanılan aynı cryovials içinde gerçekleştirilmektedir. Sızma ve polimerizasyon floresan protein korumak için AFS olarak -30 ° C 'de yapılmaktadır.

  1. % 95 etanol ile GMA stok solüsyonu karıştırılarak infiltrasyon ortam hazırlayın. Örneklerin inkübe3-5 saat boyunca% 30 GMA.
  2. 4-6 saat boyunca% 70 GMA numune inkübe edin.
  3. Gecede% 97 GMA numune inkübe edin.
  4. Bir sonraki gün, taze% 97 GMA oluşturmaktadır.
  5. Bir gömme kalıp (EBSciences, # TC) örnekleri aktarın. "DİSK Delgi (Ted Pella Inc) bir 3/8 ile Aclar filmin bir disk (EMS, # 50425-10) hazırlayın ve BEEM kapsül altındaki diskin yerleştirin.
  6. Değişim -30 ° C'de% 97 GMA üç kere 6 saat boyunca
  7. Üçüncü değişimden sonra, 1.5 ul / 1 ml GMA 'lik bir konsantrasyonda GMA için başlatıcı N, N-dimetil-p-toluidin (Sigma-Aldrich, # D9912) eklenir ve her bir numune için kalıp bu çözüm uygulanır. Hemen AFS gömme kalıp örneği yerleştirin.
    Benzoil peroksit kadar karıştırma gerekli değildir katalizör ve her sızma adımlar boyunca mevcut olduğuna dikkat edin. Bu kimyasal başlatıcı N, N,-dimetil-p-toluidin maruz kalınca benzoil peroksit plastik Polimerize değildir. Başlatıcı pol etkinleştirirymerization derhal ve 1 saat içinde bile dokularda reçine Polimerize olacaktır. Bununla birlikte, doku kopmalar eksik polimerizasyon dolayı dokularda neden olabilir. Ayrıca, GMA, iyi blok numune çapraz kalmaması bakterilerin matris üzerine dokunarak kriyoprotektan gelen numune ayırın.
    Polimerizasyon bir AFS dışında gerçekleştirilir, gömme kalıp oksijene maruz kalmasını engellemek için bir Aclar diski ile örtülmesi gerekir. Oksijene maruz kaldığında GMA tamamen polimerize değildir.
  8. O 1 saat içinde polimerize olsa plastik gecede dinlenmeye bırakılmalıdır.
  9. Floresan proteinleri oksijene maruz kalmayacakları şekilde işlenmesi kadar dondurucuda bir nitrojen gazlı vakum torbası (Ziploc) (-20 ° C) örnek saklayın.

4. Kesit

  1. GMA-gömülü örneklerinin Kesit EPON-gömülü numuneler için benzer bir şekilde gerçekleştirilebilir. Ekstra dikkat çekmek olmalıdırGMA çok hidrofilik ve onlar her iki tarafta ıslatılmış halinde şeritler su banyosu içine tahrik olacak, çünkü n kesit yüzeyi ıslatmaya değildir.
  2. Bir TIRF mikroskop lokalizasyonu için kullanılmakta ise bir cam lamel üzerine bölümler (50-80 nm) kurdeleler toplayın. Aksi takdirde, transmisyon elektron mikroskobu için yapılmış bir ızgara kullanın. Kesme hızı at1.6 mm / sn veya daha yüksek olarak ayarlanması gerekir. Aksi takdirde, bir şerit oluşturur olabilir.
  3. -20 ° C'de saklayın bölümler hemen olmasa görüntülendi. Alüminyum folyo ile bölüm sahipleri kaplayarak UV ışınlarından floroforlar koruyun.

5. PALM Görüntüleme

  1. Üretici tavsiyelerine göre PALM mikroskobu ayarlayın. Bir EMCCD Kameranın sıcaklığı ° C veya altında -70 ayarlanmış olmalıdır.
  2. Görüntülenecek örnek çözeltisi (yaklaşık 50 ul) - altın parçacıkları (2x konsantre, mikroküreler-nanospheres.com # 790122-010) uygulayın. Çözüm kapaklarına 30 saniye bekletinsiyah bir örtü halinde altında iken dudak.
  3. Lamel kenarına üfleme ve Kimwipe ile emerek altın çözeltisi çıkarın.
  4. Dairesel lamel yuvasına lamel yerleştirin. Gerekirse, yerinde lamel tutmak için jant için vakum gres de geçerlidir.
  5. Doğrudan örnekleri aşağıda, lamel alt kısmına immersiyon yağı uygulayın.
  6. Mikroskop sahnede yuvaya numune tutucusunu yerleştirin. Hedefleri dokunmamaya özel dikkat gösterin.
  7. Sıkı ve nesnel yukarıdaki bölümlerde ortalar yüzden tutucu ayarlayın.
  8. 10x objektif lens kullanarak bölümlerini bulun.
  9. 100x objektif lens değiştirin.
  10. Numune odaklanın.
  11. Flöresan sinyalleri gücü gözlenmesi ile, ilgilenilen bir bölge bulun. 488 nm lazer kullanın ve% 10 Kanallar menüsünden yoğunluğunu artırır. Parlak floresan alanlara odaklanın. Bu adım gerekli değildir unutmayın bölgede o takdirdef ilgi göz tarafından parlak saha içinde tespit edilebilir.
  12. 561 nm lazer açın ve arka plan otofloresans dışarı ağartıcıya% 100 yoğunluğunu artırır. ~ 2 dk Bleach örnek.
  13. Bleaching sırasında odak değişirse, odak ayarlayarak ve görüntü yakalamak önce geçmesi gereken 5 dakika bekleyin. Bu duraklatma ısı stabilize etmek için olanak sağlar. PALM kapsamı kuluçka odası ile donatılmış ise, 20 sıcaklığını ayarlamak ° C ve odasında sıcaklık stabilize etmek ~ 2 saat bekleyin.
  14. Ağartma işlemi tamamlandığında, 405 nm lazer etkinleştirmek ve düşük yoğunluk ayarlayın.
  15. Saniyede 20 kare görüntü toplamaya başlayın. Bu deney, genellikle 5,000-6,000 kare başına toplamak, ancak kare sayısı, deneyin amacına bağlı olarak ayarlanması gerekmektedir. Ilgi çekici bir bölgedeki bütün proteinler yansıması gerekmesi halinde, örneğin, kare sayısı arttırılmalıdır.
  16. Sinyalleri seyrek veya soluksa, yavaş increase 405 nm lazer yoğunluğu.
  17. Satın alma işlemi sırasında, dikkatli gerekli düğmesini ayarlayarak odak örnekleri tutmak için emin olun.
  18. Görüntüler elde edildiğinde, PALM analiz yapılmalıdır. TdEos için, bu sinyalleri olasılıkla otofloresans nedeniyle çünkü 500 milisaniye daha uzun floresan herhangi sinyaller filtre.

6. SEM Görüntüleme

  1. SEM görüntüleme öncesi ve 4 dakika için% 2.5 uranil asetat (sulu) kullanılarak bölümlere leke. Filtrelenmiş milliQ su ile iyice uranil asetat yıkayın.
  2. Bölümleri kurutulur sonra lamel oldukça koyu hale gelene kadar, bir karbon kullanarak karbon-ceket lamel sputter. Lamel yüzeyi üzerinde birikir elektron topraklı metal, böylece saplama üzerinde lamel ve diğer uç kenarında karbon iletken bant bir ucunu uygulanır.
  3. SEM bölmesine (FEI Nova Nano) içine numune monte edin.
  4. VCD dedektörü yerleştirin.
  5. Odanın kapatın ve yüksek vakum ayarı kullanarak pompalayacak.
  6. Bu elektron demeti bir örnek uygulanır böylece sonra tahliye, sütun vanasını açın.
  7. Elektron demeti bir rutin hizalama gerçekleştirin.
  8. Örnek bulun.
  9. Odak ayarlanmış sonra, numune aşama bağlantı ve kutup parçasının altına 5 mm için sahne getirmek.
  10. Numunede (~ 5,000 x) düşük bir büyütme görüntü çeker.
  11. Ilgi bölgeye Zoom ve (50,000 x) görüntüler yüksek büyütme elde.
  12. Sonraki bölüme taşıyın ve tüm bölümleri görüntülü kadar adım 6.10) ve 6.11) tekrarlayın.

7. Hizalama PALM ve EM Görüntüler

  1. Açık Photoshop ve kazanılmış SEM görüntüleri.
  2. 5,000 x 5,000 piksel ve 300 piksel / inç çözünürlüğü boyutları ile yeni bir pencere oluşturun.
  3. Yeni pencerede (Şekil 1A) içine düşük büyütmeli SEM görüntüsü kopyalayın.
  4. O kadar doldurur, böylece görüntü Scaledönüşümü manipülasyon (Command + Mac için T) kullanarak tüm pencere.
  5. SEM görüntüleri yüksek büyütme kopyalayın ve bunları gerektiği gibi büyütmek.
  6. Açılan resim menü çubuğundan görüntü döndürme seçerek yatay toplamı TIRF Resmi çevirin.
  7. Toplamı TIRF görüntü (PALM itibaren) yeni bir katman içine kopyalayın ve yapıştırın.
  8. SEM görselleştirilmiş ilgili yapılar (Şekil 1B) ile altın parçacıkları (Şekil 1A beyaz oklar) floresans maç gerekli döndürerek dönüşüm manipülasyon kullanarak görüntü ölçekleme ve.
  9. Yeni bir tabaka haline PALM görüntüyü kopyalayın ve aynı dönüşümü (Şekil 1C) uygulanacaktır. Daha yüksek bir büyütme Bu resim (Şekil 2) elde edilebilir.
  10. Sunum için, yeni bir tabaka haline dönüştürdü PALM görüntü kopyalayabilirsiniz. "Select" açılır menüsünden "renk aralığını" kullanarak PALM sinyalleri ancak arka plan seçin. Sel emin olunbir referans piksel olarak bir arka plan pikseli ect ve "invert" seçeneğini etkinleştirin.
  11. İstediğiniz PALM sinyaller kesin ve yeni bir katmana yapıştırın.
  12. Arka plan katmanı şeffaflık uygulayın ve% 10 olarak ayarlayın. Bu, yoğunluk (Şekil 2B) bozmadan arka plan saydam hale getirerek PALM sinyallerinin görüntülenmesi için olanak sağlar.

8. Temsilcisi Sonuçlar

TdEos ile etiketlendi Histon stably nematod C. ifade edilebilir elegans ve transjenik hayvanlar yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak işleme tabi tutulmuştur. PALM ve elektron mikroskop aynı bölüm (Şekil 1) elde edilmiştir. Görüntüleri hizalamak için, tüm zaman boyunca floresans özetliyor toplamı TIRF görüntü, elektron mikrografı üzerine örtülmektedir. Altın nanopartiküller floresans ve elektron mikroskop hem görünür ve 'transf kullanarak iki görüntü hizalamak için kullanılabilirPhotoshop orm 'fonksiyonu (Şekil 1A ve B). Daha sonra, aynı 'transform değer PALM resim (Şekil 1C) uygulandı. Bu büyütme anda, yapısal detay ayırt edilemez, bu yüzden mikrografı (Şekil 2) üst sonuna yakın bir bölgeye yakınlaştırılmış. Yüksek büyütme görüntü, böyle bir çekirdek, bir çekirdekçik, nükleer gözenekler ve endoplazmik retikulum gibi hücre içi detayları gözlenebilir. Ayrıca, Histon etiketli moleküller sadece çekirdek için lokalize olan ancak çekirdekçik için, beklendiği gibi. Korelatif PALM ve elektron mikroskobu böylece yüksek çözünürlükte protein lokalizasyonu için izin verir.

Beş sorunları görüntülerin kalitesini bozabilir. Birincisi, buz kristali hasar (Şekil 3A ve B) ultrastrüktürel deforme edebilirsiniz. Buz kristallerinin yayılımı azaltır gibi kriyo-Koruyucu bakteri, numune vermek, bu hasarı azaltabilir. Bununla birlikte,hala elektron mikroskobu ile örneklerin taranması ve donma eserler ile bu atmalı. İkincisi, GMA epoksi reçineler gibi dokulara bağlantı geçmez, ve böylece örneklerinde genellikle çevredeki plastik ve streç kurtularak, küçültmek ya da bölüm (Şekil 3C ve D) dışındadır. Uzaklıkta kriyo-Koruyucu gömmeden önce bakteriler veya diğer gelen örnek Diseksiyon örneği (Şekil 3C) plastik daha fazla yapışma sağlar. Benzer şekilde, bağırsak dokusunda lipid damlacıkları gibi yapılar genellikle çapraz bağlama yokluğunda (Şekil 3E) nedeniyle dokulardan ayrışmak. Üçüncü olarak, doku ya da germe katlama plastik nedenlerden eksik polimerizasyonu (Şekil 3F), örnek olarak oksijen varlığı da GMA polimerizasyonu engellemektedir. Dördüncü, GMA yoksul kesit kalitesi genellikle tutarsız bir morfoloji (Şekil 3G ve H) ile sonuçlanır. GMA bölümlerde kesilmelidir70 nm veya daha kalın ve çevresinde 1,6 mm / s hızında eserler Kesit en aza indirmek için. Beşinci olarak, lamel veya bölüm tozla plan otofloresans kaçınılmazdır. Tozdan Otofloresansı önceden temizlenmiş lamelleri kullanarak ve protokol açıklandığı gibi Kimwipes ve filtre kağıdı toz kirlenmesini önlemek minimize edilebilir. PALM analiz programı floresan proteinleri tipik sinyalleri (Şekil 2 A ve B) daha uzun floresan örnek veya plastikten sinyalleri düzenleyebilirsiniz. Son görüntü bu nedenle bu eserler ücretsiz olacaktır.

figure-protocol-1
Şekil 1. Altın nanopartiküller kullanılarak floresans ve elektron mikroskop hizalama. C. bir kesiti (A), düşük bir büyütme elektron mikrografı tagged histon tdEos ifade elegans :: HIS-11. Beyazrrows elektron-yoğun altın öncesinde konvansiyonel işaretleri olarak hizmet PALM görüntüleme uygulandı nanopartiküller 100 nm göstermektedir. (B) altın boncuk ~ 580 nm ışık maruz kalma üzerine floresan ve floresan görüntü indirgeme işaretleri oluşturmak. Toplamı TIRF görüntü indirgeme işaretlerinin yere göre bir elektron mikrografı üzerine hizalanır. Toplamı TIRF görüntü deney süresi boyunca kamera tarafından algılanan tüm fotonları temsil eder. Üst sol (beyaz ok) üzerinde parlak noktalar altın parçacıkları kümeleri ortaya dikkat ediniz. (C) Bir PALM görüntü sonra elektron mikrografı ve döndürülmüş eklendi ve (B) toplamı TIRF görüntünün hizalamasını belirlenen değerlere dayalı çevrilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-protocol-2
Şekil 2. TdEos arasında Histon füzyon proteinleri kullanarak nano-FEM Korelatif. (A) Sum TIRF görüntü :: HIS-11 ince kesit (70nm) elde. TdEos (B) Sorumlu PALM görüntü :: HIS-11. Otofloresans (beyaz ok) süren uzun 500 msn PALM programı tarafından süzüldü. (C) Bir çekirdeğin elektron mikrografı Aynı bölümde elde. (D) Korelatif PALM görüntü ve tdEos elektron mikrografı :: HIS-11. Floresans sıkıca çekirdeğinde kromatin lokalize edilmektedir.

figure-protocol-3
Şekil 3. Nano FEM ile ilgili problemler. Bir C (A) elektron mikrografı buz kristali zarar vermeden elegans vücut kas. Buz kristali hasarı olan bir vücut kas (B) Elektron mikrografı. Bunun yerine ayrık kesit, aktin ve miyozin filamentleri buz kristallerinin oluşumu nedeniyle agrega içine yıkılmıştır. (C, D) Düşük büyütme elektron mikrografıs çevreleyen medya solucanlar ayrışma gösteren. Bölümünde numune plastik (C) ile çevrili olduğunda daha kriyo-koruma bakteriler (D) ile çevrili bir örnek daha bozuk. Gallette içinde bakteri kriyo-koruyan bir plastik yerleştirme önce sabit örnek uzak disseke olmalıdır. (D) 'de sağ tarafta hayvan yatay kesitli geldiğini belirtmek gerekir, ve böylece şekil dokuların bozulması nedeniyle değildir. Dokuların bırakması (siyah oklar) gösteren bağırsak bölgesinin (E) elektron mikrografı. Plastik eksik polimerizasyonu (siyah oklar) bağlı bölümlerin katlanması gösteren sinir halka (F) elektron mikrografı. Farklı tarihlerde sectioned Aynı örnekten nöron (G, H) elektron mikroskobu,. Dokuların korunması bir gün (G) süper ama böyle morfolojisi tutarsız kesit kalitesi (H) tarafından kapatmamasını. v için buraya tıklayıniew büyük bir rakam.

Tartışma

Burada plastik, elektron mikroskobu kullanarak ultrastrüktürdeki bölümlerde floresan proteinleri yerelleştirilmesine ve görüntü floresan proteinleri korumak için nasıl açıklar. Proteinler nanometre çözünürlükte PALM mikroskopi kullanılarak kırınım limitinin altına yerleştiği belirlendi. Belirli örnekler için bu protokolü uyarlamak için, aşağıdaki parametreler dikkate alınmalıdır: fluorofor, ölçme ve hizalama.

Floresan protein ya da organik fluorofor seçimi ve uygulama modeli sistemi bağlıdır. Biz EGFP, YFP, Sitrin, mEosFP, mEos2, tdEos, Morange, PA-mCherry ve Dendra 12 gibi floresan proteinleri çeşitli test ettik. Her bir fluorofor gelen fluoresans muhafaza tüm floresan protein anlatılan yöntem kullanılarak korunabilir düşündüren, benzer olmuştur. Bu ifade, çünkü C de tdEos seçti elegans, proteinler tdEos kaynaşmış zaman işlevsel kaldı ve çünkü onunfoto-aktivasyon özellikleri PALM mikroskopi için uygun idi. Ancak, tdEos birleştirilmesi veya başarısız ifadesi bazen 12 gözlenmiştir.

Uygulamaya bağlı olarak, farklı bir florofor daha uygun olabilir. Pek çok durumda, bir foto-aktif fluoresan protein kullanmak için gerekli değildir. Basit korelatif floresans elektron mikroskobu fotoğrafı aktive floresan protein gerektirmez. GFP ya da organik boyalar kırınım sınırın üzerinde bölümlerde etiketlenmiş proteinleri floresan imaj için de kullanılabilir. Örneğin, bir resim, bir floresan mikroskobu kullanılarak bir nöropil akson ve görüntüleme ile bir elektron mikroskobu, belirli bir akson, flöresanlı bir mikroskop üzerinde floresan ile floresan sinyalini ilişkili olabilir. Böyle uyarılmış emisyon azalması mikroskopi (STED) 12, bireysel molekül dönüş (GSDIM) 13 tarafından takip zemin devlet tükenmesi mikroskopi ve gibi diğer süper-çözünürlük teknikleri,yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) 14, foto-aktive floresan proteinleri gerekmez. Ayrıca, organik boyalar 9,15,16 veya floresan probları 17 intrinsik özelliğini kullanın süper-çözünürlük görüntüleme teknikleri kolayca uygulanabilir.

Her bir molekülün flüoresan uzamsal ve zamansal ayrılır çünkü avuç içinde, molekül sayısı belirlenebilir. Oksidasyon, undercounting, overcounting ve ekspresyonu: Ancak, miktar dört nedenden dolayı yanıltıcı olabilir. İlk olarak, floresan protein fraksiyonu doğallığından ya da numune işleme 5,12 esnasında oksidize edilebilir. Floresans sinyalinin ~ 90% Bizim protokolde fiksasyon ve gömme yoluyla korunmuş olmasına rağmen örnek kesitli olmuştur ve yüzey oksijen maruz sonra, floresan protein oksidasyonu oluşabilir. İkinci olarak, foto aktive olan protein aktivasyonu stokastik, ve bu nedenle birden fazla moleküller olabilir,Belirli bir kırınım sınırlı nokta 8 aktive. Birden çok moleküllerin floresans bir nokta olarak görünür, ve proteinlerin bu nedenle toplam sayısı undercounted edilecektir. Üçüncü olarak, benzer bir sorun overcounting yol açabilir. PALM yılında beyazlatma tarafından, her bir floresan protein lokalize ve ardından "silinir". Ancak, floresan proteinleri 18 kalıcı beyazlatılmış olmadan karanlık devlet dönebilirsiniz. Böyle moleküller sonra birden çok kez sayılır. Dördüncü olarak, etiketlenmiş proteinler transgenler olarak ifade edilmiştir ve genellikle aşırı ekspresyonu ile sebep olabilir çoklu kopyalar, mevcut edilir. Bu nedenle, palmiye dan miktarının belirli bir konumda molekül sayısını tahmin ancak tam olarak belirlemek için değil de kullanılabilir.

Bir elektron mikrografı ile PALM görüntünün hizalamasını da çünkü elektron ışını nedeniyle ışık ve elektron mikroskobu ve bozulma içinde çözünürlük farkı zor olabilir. Altın parçacıkları gibi sıkı loc hizmetelektron mikrograflarında indirgeme belirteçler alized. Ancak, altın parçacıklar fluoresecence foto-aktif değildir ve büyük bir kırınım-sınırlı bir nokta olarak görünür. Böylece, elektron mikrografı üzerinde bir floresan imaj yerleştirme bir tahminidir. Çarpıtmalarla ayrıca plastik bölümü ile elektronların etkileşimleri ortaya çıkabilir. Bu tür GMA gibi akrilik reçineler, elektron ışını altında daha az kararlı olan ve plastik boyutları değiştirilebilir. Bu koşullar altında, ince yapı ile floresan hizalayarak, referans işaretleri doğrusal olmayan transformasyon gerektirebilir.

Açıklamalar

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Carl Zeiss, Inc tarafından desteklenen

Teşekkürler

Biz proof-of-prensibi deneyler, fiksasyon protokolleri, reaktifler ve teşvik paylaşmak için Richard Fetter için PALM mikroskop erişim için Harald Hess ve Eric Betzig ederim. Biz DNA yapıları için Michael Davidson, Geraldine Seydoux Stefan Eimer, Rudolf Leube, Keith Nehrke, Hıristiyan Frøkjr-Jensen, Aude Ada-Nguema ve Marc Hammarlund ederim. Biz de Zeiss PAL-M, Zeiss Elyra P.1 PALM mikroskop bir beta sürümüne erişmesini sağlamak için Carl Zeiss Inc ederim.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif veya ekipman Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
Yüksek basınçlı dondurucu ABRA HPM 010 EMPact ve Wohlwend dan Leica veya HPF-01 HPM 100 de kullanılabilir.
Otomatik dondurma ikamesi ünitesi Leica AFS 2 AFS 1 de kullanılabilir.
Zeiss PALM Zeiss ELYRA P.1 Nikon ve Vutara ayrıca ticari PALM mikroskoplar satmak.
Taramalı elektron mikroskobu FEI Nova nano Diğer yüksek çözünürlüklü mikroskobu SEM kullanılabilir.
Aseton EMS RT10016
Etanol Sigma-Aldrich 459844-1L
Osmium tetroxide EMS RT19134
Potasyum permanganat EMS RT20200
Sığır serum albümin Sigma-Aldrich A3059-50G
Uranil asetat Polysciences 21447-25 Bu firma uranil asetat pH biraz daha yüksektir.
Glikol metakrilat (GMA) SPI 02630-AA Düşük asit, TEM notu.
N, N-dimetil-p-toluidin Sigma-Aldrich D9912
Cryo şişeleri Nalgene 5000-0020
Cam şişeler EMS 72632
Aclar filmi EMS 50425-10
BEEM kapsül EBSciences TC Polipropilen
3/8 "DİSK zımbalar Ted Pella 54741
Altın nanopartiküller mikroküreler-nanospheres.com 790122-010 2x konsantre çözelti isteyin

Kaynaklar

  1. Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).
  2. Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers. Front. Neuroanat. 4, 24(2010).
  3. Bishop, D., et al. Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy. Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).
  4. Sims, P. A., Hardin, J. D. Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy. Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).
  5. Micheva, K., Smith, S. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  6. Nixon, S. J., et al. A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos. Traffic. 10, 131-136 (2009).
  7. Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).
  8. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  9. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
  10. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
  11. Weibull, C., Christiansson, A. Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy. J. Microsc. 142, 79-86 (1986).
  12. Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
  13. F lling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).
  14. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
  15. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nature Methods. 7, 717-719 (2010).
  16. Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI). PNAS. 106, 22287-22292 (2009).
  17. Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules. PNAS. , (2011).
  18. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Alt n Par ac kl Referans aretleyicilerUltraince KesitlemePALM G r nt lemeTaramal Elektron MikroskobuFloresan Elektron Mikroskobu Korelatif G r nt lemeHiston TDEos Etiketli Proteinler

İlgili makaleler