Burada açıklanan lipopolisakkarid meme iltihabı simüle etmek için meme, genellikle bakteriyel enfeksiyon tarafından neden olduğu bir durum ile laktasyondaki fare meme bezi içine enjekte edildiği bir tekniktir. Artan nükleer faktör kappa B (NF-kB) sinyalizasyon, içinde lipopolisakkarit enjeksiyonu sonuçlarını bir NF-KB lusiferaz muhabiri fare bioluminescent görüntüleme yoluyla görüntülendi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mastitis Fare Model olarak LPS Intradüktal Enjeksiyon: Sinyal bir NF-KB Reporter Transgenik aracılığı ile görsel
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan hastalıklarının hayvan modelleri klinik öncesi modellerde müdahaleler test olarak titizlikle, sonuçta hastalığın ilerlemesi ve ilişkili mekanizmaları aşamalarında eğitim ve için gereklidir. Bu yöntemler olarak, lipopolisakkarit (LPS) bezinin meme, etkili bir modelleme mastitis, ya da iltihap yoluyla laktasyondaki fare meme bezi içine enjekte edildiği bir yöntem açıklanmaktadır. Artan nükleer faktör kappa B (NF-kB) sinyalizasyon, bu simüle enfeksiyon sonucu olarak NF-KB lusiferaz muhabiri fare 1 bioluminescent görüntüleme yoluyla görüntülendi.
Bu yöntemlerin geliştirilmesinde Nihai hedefimiz emziren genellikle kızarıklık içerir bezi, şişlik ve immün hücre infiltrasyonu 2,3 mastitis ile ilişkili enflamasyon incelemektir. Bu nedenle, biz kesi veya sipariş deri, meme veya bezin yaralama herhangi bir tür olabilir LPS tanıtmak olduğunu farkındaydılaryaklaşımın büyük olasılıkla inflamasyon okuma-out bulandırabilir zira bizim yöntemleri kullanılan olamaz. Biz de özel yapılmış elle çizilmiş pipetler veya yerde bu özel araçlar tutmak için mikromanipülatörler kullanımı gerektiren vermedi bir düz-İleri yöntemi istenen. Böylece, ticari olarak temin edilebilen insülin şırıngası kullanmak için ve sağlam bir meme meme kanalının içine enjekte ajan ile belirlenir. Bu yöntem başarılı oldu ve bize enjeksiyon işlemi tarafından örtülmektedir herhangi bir ek etki olmaksızın LPS enjeksiyonu ile ilişkili iltihaplanma incelemek için izin verdi. Buna ek olarak, bu yöntem, aynı zamanda görsel ve sayısal olarak NF-KB LPS enjekte edilen bez 4 içinde sinyalleme artış göstermek için bir NF-KB lusiferaz raportör transjenik fare ve biyolüminesans görüntüleme teknolojisi kullanılmıştır.
Bu yöntemler, sonuçta olduğu gibi, emzikli meme bezinde modeli hastalığa tekniği isteyen birçok disiplinlerden araştırmacılar ilgilendirenBurada açıklanan bir dizi madde enjeksiyonu için kullanılan olabilir, ve sadece LPS ile sınırlı değildir.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Transgenik Fare hazırlanması
- NGL (N-KB'yi F-G-L uciferase FP) raportör transgeni (daha önce tarif 1) için pozitif dişi fareler, bu işlem için kullanılır. Kadın yaşı en az 6 hafta olduğunda, bir FVB vahşi tip erkek ile çiftleşir. Yetiştiriciliği (1 erkek ile bir kafese 4 kadın) kullanılabilir Harem. (Lütfen dikkat:. FVB ırkı fareler gibi C57Bl6 gibi Koyu ırkı fareler de kullanılıyor olabilir mevcut çalışma için kullanılan, ancak bu farelerin önceden görüntüleme için traş olması gerekir).
- 15 gün sonrası çiftleşme başlayarak, gebelik belirtileri (büyük çıkıntılı çevresi) için düzenli dişiler kontrol edin. Her kadın bir kez gebe ayrılmış ve son dişi gebe kalmaz ve bir kez erkek üreme kafesten çıkarılmalıdır.
- Bir ayrılmış kadın izled bir çöp görünen doğum tarihini not edin. En az 6 yavruların bir çöp yeterli laktasyon için gereklidir. Çöp doğumdan sonra sekiz gün, protokolü (zaman çizelgesi şeması için Şekil 1'e bakınız) devam edin.
2. Enjeksiyon için Hazırlık
- E. eritin 0.1 ug / ul nihai konsantrasyonu PBS içinde coli LPS. Bu çözelti, ya da 5 mcg bir toplam 50 ul, meme bezi içine enjekte edilecektir. Kontrol enjeksiyon için kullanılacak PBS tek başına ikinci bir tüp hazırlanır.
- Diseksiyon kapsamı ve izofluran anestezisi ekipmanları Set-up. Bir burun-koni cihaz fare yer alacak kesme kapsamı aşama için güvenli olmalıdır. İyi bir ışık kaynağı, kapsam kendisinden veya ilave ışıklarından olup olmadığını da hazırlanmış olmalıdır.
- Kurulum tamamlandıktan sonra, izofluran makine ve hava akışını başlatmak.
3. LPS Intradüktal Enjeksiyon
- LPS çözeltisi 50 ul ile kısa bir iğne enjektör yerleştirin. Kenara ayarla.
- İlk kez solunum yavaşlar sonra izofluran dolu kutuya kadın yerleştirerek ve enjekte edilmesi için fareyi uyuştur, sahneye çıktığı taşımak ve burun konisi içinde burnunu yerleştirin. Fare tamamen uyuşturulduktan onaylamak için bir ayak tutam kullanın. Prosedür boyunca farenin solunum izleyin ve buna göre izofluran seviyesini ayarlayın. Baraj işlemden sonra iade edilebilir kadar dişi alınmış olduğunu yavruların çöp içeren kafesi dikkatle ayırmak gerekmektedir.
- Kat düz koymak yapmak ve farenin alt karın sağ 4. inguinal meme bezi bağlı meme görselleştirmek yardımcı olmak için% 70 etanol küçük bir damla kullanın.
- Meme optimal bir görünüm için diseksiyon kapsamı odaklanın. Dikkatlice daha uzakta deriden meme dışarı çekmek için ince forseps bir dizi kullanabilirsiniz, ancak ponksiyon yok veya herhangi bir şekilde meme yaralayabilir.forseps sıkı doku işlenirken birlikte kenetlenmiş, ancak meme üzerinde stres az miktarda gerektiren bir ışık tutmak ile asla kullanılmamalıdır.
- Yavaşça yerine meme tutmak için sol elinde forseps kullanın. Yavaşça sağ ellerini kullanarak görüş alanı içine önceden yüklenmiş şırınga getirmek. Şırınga hiçbir konumlandırılması içeriği enjekte etmek için ortaya sahip olacak şekilde düzenlenmelidir.
- Bir kez şırınga görünümünde olan, meme merkezi içinde küçük duktus açıklığının dikkatle hedefliyoruz ve şırınga takın.
- El konumlandırılması olmadan, şırınga içeriği enjekte ve meme gelen iğne çıkarılır.
- Kontrol enjeksiyon için 50 ul PBS ile ikinci bir şırınga yerleştirin. Sahnede ve fare alt karın diğer tarafta sol 4. inguinal meme bezi meme en iyi görünüm için fare yerleştirin. PBS-yüklü şırınga kullanarak adımları 3,4-3,7 tekrarlayın.
- Hem enjeksiyonlar compl olunca, ETE anestezi kesilmeli ve bir kurtarma kafes için fareyi hareket ettirin. O 5 dakika içinde mobil hale sigortalamak için dişi izleyin. Fare, 1 saat boyunca kurtarma kafes kalmasını sağlayın. Kurtarma 1 saat sonra, yavrular onun çöp ile kafese kadın geri yerleştirin. Görüntüleme geçmeden önce Fare aralıklarla 6 saat sonrası enjeksiyon için izlenmelidir. Bizim deneyim, hiçbir olumsuz sonuçlara enjeksiyon ve görüntüleme arasındaki dönemde kadın ya da yavrular da kaydedildi. Distres belirtileri (ısırma veya enjeksiyon yerinde, genel uyuşukluk koruyan, örneğin kambur duruş) ya da yavrular (herhangi bir hareket, deri mavimsi renk) kadın gözlenen Ancak, deney kesilmelidir.
4. Bioluminescent Görüntüleme NF-KB Aktivite Visualize'a
- Sonra farelerin görüntüleme tesisine taşınmıştır, yazılımını açmadan ve makine başlatılırken tarafından görüntüleme işlemi başlar. Olduğunu açınanestezi kutusu ve görüntüleme odasının hem akan sağlayarak oflurane makinesi ve hava akışı.
- Net anestezi kutusunda izofluran anestezisi altında fare yerleştirin. Solunum yavaşladı sonra, fare tamamen uyuşturulduktan onaylamak için bir ayak tutam kullanın. Sonra steril bir şırınga kullanarak retroorbital enjeksiyonu 5 tarafından fare içine luciferase substrat 100 ul enjekte.
- Hemen görüntüleme odasına fare aktarmak ve orada bulunan burun konisi izofluran altında burnunu yerleştirin. Fare sırt üstü yatar olmalıdır. Bant ile sahneye her ayak sabitleyin.
- IVIS yazılım Girdi uygun ayarları bir beyaz ışık fotoğrafik görüntü ve bioluminescent faaliyetin bir görüntü hem de almak. Pozlama süresi 10 saniye olmalıdır. Görüntü elde edin.
- Sonra görüntüleri elde edilmiştir, fare kurtarmak için izin ve sonra onu yavruların kafeste onu geri koyun ve periyodik izlenmesi.
- Fotoğrafik ve Işıklıgörüntüler otomatik olarak bindirilmiş ve Şekil 2'deki gibi, ekranda görüntülenir. Farenin alt karın bölgesinin her iki tarafında (PBS-enjekte bezi üzerinde bir ve LPS enjekte bezi üzerinde bir) fazla ilgi bölgesi veya eşit büyüklükte "ROI" çevreler koyarak elde edilen görüntü analiz. Fotonlardan okuması ayarlayın. Bir dizi (Şekil 2B), her bir ROI içinde tespit ışıldama gösteren görüntülenir. İstatistiksel analizde bu numarayı kullanın.
- Optimum görüntü görüntülemek için, daha fazla görüntülenen sinyal eşik ayarlayın. Bu toplam lüminesans okuması değiştirmez ama kontrol ve LPS-tedavili bezi arasındaki farklar arka plan sinyali çıkarın ve görselleştirmek için izin verecektir. PBS-enjekte bezinin arka sinyal çıkana kadar gösterilen lüminesans miktarını azaltın. Bu, Şekil 2'de görüldüğü gibi görüntü içinde hala belirgin LPS ile muamele bezinin daha yüksek sinyal bırakmak gerekir.
- Additionaprotein ve RNA testleri de dahil olmak üzere l analizi, 6 post-mortem kadın toplanan meme dokusu ile tamamlanabilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Bu yöntemler, tefsir edilebilir sonuçlar elde etmek için, LPS (ya da PBS) bitişik doku bozulmamış bırakarak, sadece meme kanalına infüze edilmesi gerekir. Meme çevreleyen subkutan doku içine enjeksiyon yerine simüle enfeksiyon daha yaralanmadan dolayı iltihap ile sonuçlanacaktır. Tekniği öğrenirken PBS içinde seyreltilmesi tripan mavi boya enjeksiyonu. Yararlı Şekil 3A PBS içinde tripan mavisi 100 ul aşılanmış bir başarıyla enjekte bezi gösterir. Gösterildiği gibi, sadece ağaç duktal enjekte edilen çözelti ile doldurulacak, ve enjeksiyon bölgesinde herhangi bir büyük hap olmalıdır. Bu bağlamda bir "bolus" bir meme ya duktal ağaca infüzyonu almayan meme çevresindeki doku enjekte sıvı birikmesi olduğunu. Bu shŞekil 3B kendi. Şekil 3'te gösterilen uygulama enjeksiyonları emzirme günü 21 yaşında bir kadın tamamlanmıştır unutmayınız. Laktasyon yükseklik (gün 8-10, LPS akım protokolü kullanılarak enjekte edildiği aşama) sırasında, süt bol ve bu kanallar görselleştirmek ve enjeksiyon doğru olarak doldurulmuş olup olmadığını belirlemek zordur. Bu nedenle emzirme döneminde daha sonraki zaman noktalarında uygulama enjeksiyonları için daha iyidir.
Bulunan meme kanalı sonuçlara LPS ile başarılı bir şekilde enjeksiyon bezi içinde NF-KB aktivitesi artmıştır. Bu IVIS görüntüleme üzerinde haberci fare içinde açık olmalıdır, ve LPS enjekte bezi (ortalama olarak, Şekil 2'de gösterildiği gibi, PBS bezi-şırınga göre önemli ölçüde daha yüksek bir lusiferaz aktivitesi (foton sayımı ile ölçülür) sahip olması, LPS bezi okur PBS kontrol sinyali, 200%). Comp gibi LPS-tedavili bezleri içinde lüminesans istatistiksel olarak anlamlı bir artışKontralateral kontrol etmek ared 4 fareler 4 bir grup tamamlanmasından rağmen elde edildi. Bir ek çalışma ayrıca E. birinin intraduktal meme enjeksiyon kullanmıştır NF-KB haberci transgenik içine coli veya LPS. Kendi çalışmalarına benzer şekilde, bu yazarlar E. sonra muhabirin aktivite 6 saat içinde önemli bir artış gördüm coli enjeksiyon 2.
Önce herhangi bir manipülasyon hatta başlangıçta, görüntülü zaman beyin ve diğer karın içi organların bünye NF-KB etkinliği nedeniyle dikkat ediniz, bizim muhabir farelerin başları ve karınları sürekli bir sinyal göstermiyor. Böylece, bu sinyale bu deney ile ilgili olarak göz ardı edilmemelidir. Bariz bir sinyal görüntü okuması PBS bezinin arka plan lüminesans aza indirmek için ayarlandıktan sonra LPS enjekte meme bezi içinde kalmalıdır. Şekil 2 arka azaltılmış görüntüleri gösterir.
Bezinin Başarısız enjeksiyonu olacakmeme hasar en muhtemel sonuç. Bu görüntüleme sırasında belli olacak sivri, deri düzeyinde inflamasyona neden olur. Yaralama sinyal Bu tür kanallara başarılı LPS enjeksiyonundan sonra görüldüğü gibi, bezi boyunca yayılan değil, çok güçlü ve hasar oluştu meme alanı sınırlı olacaktır.
Şekil 1. Prosedür şematik.
Şekil 2. Arka azaltılmış IVIS bioluminescent görüntüleme. Temsilcisi sonuçları (A) LPS enjekte bezinin artmış lusiferaz aktivitesini gözler, görüntü Edinilmiş. (B) Image ilgi niceleyiciler bölgesi eklenmiş. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3 Uygulama enjeksiyonu:.. Meme bezi intraduktal enjeksiyon yoluyla boya enjekte meme üzerinden teslimat doğruluğunu sınamak için, emzirme günü 21 yaşında bir fare PBS içinde seyreltilmesi tripan mavi boya 100 ul ile enjekte edildi. Kurban ardından bezi görselleştirme için ortaya çıkmıştır. (A) başarılı bir enjeksiyon ve meme de boya (B) bolus.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada bir transgenik NF-KB muhabiri fare ve model mastit iyileştirilmiş bir enjeksiyon tekniği kullanmak, meme dokusunun iltihabı en sık bakteriyel enfeksiyon neden. Bu prosedürde en kritik adım intraduktal enjeksiyon kendisidir.
Uygulamada, duktal enjeksiyon başarılı olup olmadığını genellikle açıktır. Ajanların enjeksiyonu (LPS veya PBS) sıvı hissetmeniz gerekir ve şırınga boşaltılır olarak hiçbir direniş orada küçük olmalıdır. En yaygın hatadır bezine engel geçit yol açan meme hasar oldu...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu iş F Yull ve Gazi İşleri Bakanlığı (TS Blackwell) verilir NIH hibe CA113734 tarafından finanse edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| Escherichia coli lipopolisakkarit (LPS) | Sigma | L 2880 | serotip 055: B5 |
| PBS | Mediatech, Inc | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insülin enjektörü | Becton Dickinson | 328438 | Kısa iğne |
| Forseps | Dünya Hassas Aletler | 15908 | |
| Kapsamı Diseksiyon | Leica | M3Z | |
| Terrell İzofluran, USP | Rx Elite MINRAD A.Ş. | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 görüntüleme sistemi | Kaliper (eski Xenogen) | N / A | |
| Luciferase enjeksiyon Şırınga | Becton Dickinson | 309597 | 1 cc; 26G5 / 8 |
| D-lusiferin Ateşböceği, sodyum tuzu monohidrat (Luciferase substrat) | Biosynth Kimya ve Biyoloji | L-8240 | 10 mg / ml 'ye seyreltilir |
Kaynaklar
- Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury. The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).
- Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E. In vivo imaging of NF-κB activity during Escherichia coli-induced mammary gland infection. Cellular Microbiology. 10, 1249-1258 (2008).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Neutrophil recruitment in endotoxin-induced murine mastitis is strictly dependent on mammary alveolar macrophages. Veterinary Research. 41, 10(2010).
- Connelly, L., Barham, W., Pigg, R., Sait-Jean, L., Sherrill, T., Cheng, D. S., Chodosh, L. A., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Activation of nuclear factor kappaB in mammary epithelium promotes milk loss during mammary development and infection. J. Cell. Physiol. 222, 73-81 (2010).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40, 155-160 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. (21), e2828(2011).
- Behbod, F., Kittrell, F. S., LaMarca, H., Edwards, D., Kerbawy, S., Heestand, J. C., Young, E., Mukhopadhyay, P., Yeh, H., Allred, D. C., Hu, M., Polyak, K., Rosen, J. M., Medina, D. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Research. 11, R66(2009).
- Zheng, J., Watson, A. D., Kerr, D. E. Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model. Infection and Immunity. 74, 1907-1915 (2006).
- Nguyen, D., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Intraductal Injection into the Mouse Mammary Gland. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. 259-270 (2000).
- Lee, J. W., Paape, M. J., Zhao, X. Recombinant bovine soluble CD14 reduces severity of experimental Escherichia coli mastitis in mice. Veterinary Research. 34, 307-316 (2003).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis. Veterinary Research. 41, 53(2010).
- Bannerman, D. D., Paape, M. J., Hare, W. R., Sohn, E. J. Increased levels of LPS-binding protein in bovine blood and milk following bacterial lipopolysaccharide challenge. Journal of Dairy Science. 86, 3128-3137 (2003).
- Gonen, E., Vallon-Eberhard, A., Elazar, S., Harmelin, A., Brenner, O., Rosenshine, I., Jung, S., Shpigel, N. Y. Toll-like receptor 4 is needed to restrict the invasion of Escherichia coli P4 into mammary gland epithelial cells in a murine model of acute mastitis. Cellular Microbiology. 9, 2826-2838 (2007).
- Notebaert, S., Demon, D., Vanden Berghe,, Vandenabeele, T., P,, Meyer, E. Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice. Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases. 31, 551-565 (2008).
- Osterman, K. L., Rahm, V. A. Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk symptoms, treatment, and outcome. Journal of Human Lactation. 16, 297-302 (2000).
- Sordillo, L. M., Streicher, K. L. Mammary Gland Immunity and Mastitis Susceptibility. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7, 135-146 (2002).
- Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS. Chest. 116, 73S-74S (1999).
- Stathopoulos, G. T., Sherrill, T. P., Cheng, D. S., Scoggins, R. M., Han, W., Polosukhin, V. V., Connelly, L., Yull, F. E., Fingleton, B., Blackwell, T. S. Epithelial NF-kappaB activation promotes urethane-induced lung carcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 18514-18519 (2007).
- Blackwell, T. S., Hipps, A. N., Yamamoto, Y., Han, W., Barham, W. J., Ostrowski, M. C., Yull, F. E., Prince, L. P. NF-κB signaling in fetal lung macrophages disrupts airway morphogenesis. The Journal of Immunology. 187, 2740-2747 (2011).
- Chiang, S. H., Bazuine, M., Lumeng, C. N., Geletka, L. M., Mowers, J., White, N. M., Ma, J. T., Zhou, J., Qi, N., Westscott, D. The protein kinase IKKepsilon regulates energy balance in obese mice. Cell. 138, 961-975 (2009).
- Singh, M. V., Kapoun, A., Higgins, L., Kutschke, W., Thurman, J. M., Zhang, R., Singh, M., Yang, J., Guan, X., Lowe, J. S. Ca2+/calmodulin-dependent kinase II triggers cell membrane injury by inducing complement factor B gene expression in the mouse heart. The Journal of Clinical Investigation. 119, 986-996 (2009).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
