Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Pankreas Adenokarsinom Doku B7-H1 immünohistokimyasal boyanma (PD-L1) parafin Slaytlar

22.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/4059

⸱

3 Ocak 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

Bu makalede

Özet

B7-H1 (PD-L1) ve PD-1 olarak bağlayıcı tümörün mikroçevresindeki önemli bir tümör kaynaklı immünsüpresif sinyal verin. Ifade ve pankreatik adenokarsinoma B7-H1 lokalizasyonu karakterize etmek için immünohistokimyasal boyama tekniği burada tanımlanmıştır.

Özet

B7-H1/PD-L1, bağışıklık düzenleyici bir hücre yüzey proteinlerinin B7 ailesinin bir üyesi, (PD programlanmış ölüm-1, reseptörü ile etkileşim yoluyla hücre-aracılı bağışıklık tepkilerini negatif düzenlenmesi önemli bir rol oynar -1) 1,2. Tümör hücreleri tarafından B7-H1 aşırı ekspresyonu melanom, glioblastom, ve akciğer, meme, kolon, yumurtalık, böbrek ve hücre karsinomları da dahil olmak üzere insan kanserleri, bir dizi belirtildiği gibi, ve anti-tümör zarar gösterilmiştir T- Hücre bağışıklık 3-8.

Son zamanlarda, pankreatik adenokarsinoma dokular tarafından B7-H1 ekspresyonu potansiyel bir prognostik belirteçtir 9,10 olarak tespit edilmiştir. Buna ek olarak, pankreas kanseri, bir fare modelinde, B7-H1 blokajı, bir anti-tümör cevabı 11 üretmek için gösterilmiştir. Bu veriler potansiyel bir terapötik hedef olarak B7-H1 önemini göstermektedir. Anti-B7-H1 blokajı antikorlar nedenle mul için klinik deneylerle test ediliyormelanom ve akciğer, kolon, böbrek, mide ve pankreas kanserleri de dahil olmak üzere 12 tiplemeleriyle insan solid tümörler.

Sonunda tedaviler hedefleme B7-H1 yararlanacak hastaların tespit edebilmek için, bu ifade ve B7-H1 ve B7-H1 blokajı antikorlar ile hastanın tedaviye yanıtı lokalizasyonu arasındaki korelasyonu araştırmak için kritik öneme sahiptir. Immünhistokimya ile insan pankreas adenokarsinomu dokularında B7-H1 ekspresyonu incelenmesi bu co-inhibitör sinyal molekülü tümör mikroçevresindeki antitümör bağışıklık baskılanması nasıl katkıda bulunduğunu daha iyi bir anlayış verecektir. Chen ve arkadaşları tarafından geliştirilen anti-B7-H1 monoklonal antikor (klon 5H1) insan neoplastik doku 4,8 çok tip cryosections güvenilir boyama sonuçları üretmek için gösterilmiştir, ancak parafine gömülü slaytlar leke kadar zor olmuştu Son zamanlarda 13-18. Biz dev varpankreatik adenokarsinoma dokuların parafine gömülü slaytlar için kaçtı B7-H1 boyama protokolü. Burada anlatılan B7-H1 boyama protokolü biraz arka plan ile B7-H1 tutarlı membranöz ve sitoplazmik boyanma üretir.

Protokol

B7-H1/PD-L1, bağışıklık düzenleyici bir hücre yüzey proteinlerinin B7 ailesinin bir üyesi, (PD programlanmış ölüm-1, reseptörü ile etkileşim yoluyla hücre-aracılı bağışıklık tepkilerini negatif düzenlenmesi önemli bir rol oynar -1) 1,2. Tümör hücreleri tarafından B7-H1 aşırı ekspresyonu melanom, glioblastom, ve akciğer, meme, kolon, yumurtalık, böbrek ve hücre karsinomları da dahil olmak üzere insan kanserleri, bir dizi belirtildiği gibi, ve anti-tümör zarar gösterilmiştir T- Hücre bağışıklık 3-8.

Son zamanlarda, pankreatik adenokarsinoma dokular tarafından B7-H1 ekspresyonu potansiyel bir prognostik belirteçtir 9,10 olarak tespit edilmiştir. Buna ek olarak, pankreas kanseri, bir fare modelinde, B7-H1 blokajı, bir anti-tümör cevabı 11 üretmek için gösterilmiştir. Bu veriler potansiyel bir terapötik hedef olarak B7-H1 önemini göstermektedir. Anti-B7-H1 blokajı antikorlar nedenle birden çok insan için klinik deneylerle test ediliyormelanom ve akciğer, kolon, böbrek, mide ve pankreas 12 kanserleri dahil olmak üzere solid tümörler.

Sonunda tedaviler hedefleme B7-H1 yararlanacak hastaların tespit edebilmek için, bu ifade ve B7-H1 ve B7-H1 blokajı antikorlar ile hastanın tedaviye yanıtı lokalizasyonu arasındaki korelasyonu araştırmak için kritik öneme sahiptir. Immünhistokimya ile insan pankreas adenokarsinomu dokularında B7-H1 ekspresyonu incelenmesi bu co-inhibitör sinyal molekülü tümör mikroçevresindeki antitümör bağışıklık baskılanması nasıl katkıda bulunduğunu daha iyi bir anlayış verecektir. Chen ve arkadaşları tarafından geliştirilen anti-B7-H1 monoklonal antikor (klon 5H1) insan neoplastik doku 4,8 çok tip cryosections güvenilir boyama sonuçları üretmek için gösterilmiştir, ancak parafine gömülü slaytlar leke kadar zor olmuştu Son zamanlarda 13-18. Biz, B7-H1 staini geliştirdikpankreatik adenokarsinoma dokuların parafine gömülü slaytlar için ng protokolü. Burada anlatılan B7-H1 boyama protokolü biraz arka plan ile B7-H1 tutarlı membranöz ve sitoplazmik boyanma üretir.

1. De-parafinization

  1. Fırınlama 20 dakika süreyle 55 ° C'de kayar.
  2. 10 dakika için ksilen içinde bir kimyasal Hood, batırmak kayar.
  3. 10 dakika için taze ksilen içinde Immerse kayar.
  4. Daldırın 5 dakika için% 100 etanol içinde kayar.
  5. Daldırın 5 dk için taze% 100 etanol içinde kayar.
  6. Daldırın 5 dakika için% 95 etanol içinde kayar.
  7. Daldırın 5 dakika için% 80 etanol içinde kayar.
  8. Daldırın 5 dk için deiyonize su içinde kayar.

2. Antigen Retrieval

  1. Daha sonra 125 ° C'de 30 saniye için Tris-EDTA tampon maddesi (pH 9.0) ve bir düdüklü tencere içinde sıcaklık, 90 ° C 10 sn için sokmak kayar.
  2. 60 dakika için slaytlar soğumasını bekleyin.
  3. 5 dakika TBST yılında batırın slaytlar; repeiki kez.

3. Lekelenme

  1. Slaytlarda dokusunun etrafında çözümler siliniz. Hidrofobik bir kalem ile doku etrafında bir çember işaretleyin.
  2. Bir nem odasında slaytlar yerleştirin ve tüm boyama işlemi boyunca slayt üzerinde doku kurumayı önlemek. 5 dakika peroksidaz blok slayt ve inkübe slaytlar üzerinde hidrofobik daire içinde peroksidaz blok Sıra bir damla (tamamen doku alanı kapsayacak şekilde yaklaşık 200 ul veya daha fazla).
  3. 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın.
  4. BLOK ACE Yeri bir damla 15 dakika boyunca her slayt ve inkübe tampon engelleme.
  5. 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın.
  6. 15 dakika boyunca her slayt ve inkübe üzerinde Avidin çözüm yeri bir damla.
  7. 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın.
  8. 15 dakika boyunca her slayt ve inkübe üzerinde Biotin çözüm yeri bir damla.
  9. Sli durulayınTBST ile des, 5 dakika TBST sonra yer.
  10. Fare anti-B7-H1 monoklonal antikor seyreltme 1:1,000 (klon 5H1) ya da bir fare IgG1 ile slaytlar inkübe 4 de 200 ul TBST içinde κ izotip kontrol ° C'de 22 saat + / için bir gecede - 1 saat. TBST içinde son antikor konsantrasyonu 2.57 ug / ml 'dir.
  11. 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın. Iki kez tekrarlayın.
  12. 30 dakika boyunca bir 1:500 yoğunlukta bir biyotin konjuge sıçan anti-fare IgG1 ikincil antikor (200 ul% 2 keçi serumu içinde çözelti) ile slaytlar inkübe edin.
  13. 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın. Iki kez tekrarlayın.
  14. Streptavidin-Biotin Complex Sıra bir damla 15 dakika boyunca her slayt ve inkübe üzerinde (kullanımdan önce en az 30 dakika hazırlıklı olmalıdır).
  15. 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın. Iki kez tekrarlayın.
  16. 4 dakika için her slayt ve inkübe üzerinde Amplifikasyon Reaktif Sıra bir damla (TBST ile 02:01 seyreltilmiş).
  17. T ile slaytlar durulayınBST, 5 dk TBST sonra yer. Iki kez tekrarlayın.
  18. 15 dakika boyunca her slayt ve inkübe üzerinde Streptavidin-HRP Yeri bir damla.
  19. 5 dk için TBST içinde yer sonra, slaytlar TBST ile yıkayın. Iki kez tekrarlayın.
  20. Her bir slayt üzerinde bir 3,3-diaminobenzidin damla (DAB) substrat ve kromojen koyun ve 2 dk için renk geliştirmek.
  21. Hemen renk geliştirme sonra, 1-2 dakika GKD 2 O ile slaytlar yıkayın.
  22. 90 sn için hematoksilen bir damla ile slaytlar inkübe edin.
  23. 1-2 dk GKD 2 O ile yıkayın.
  24. 1-2 dakika sabunlu musluk suyu ile yıkayın.
  25. 1-2 dk GKD 2 O ile yıkayın.

4. Dehidrasyon ve Montaj

  1. 3 dakika için% 80 etanol içinde slaytlar bırakın.
  2. 3 dakika boyunca% 95 etanol içinde slaytları daldırın.
  3. 5 dakika için% 100 etanol içinde slaytlar bırakın. Tekrarlayın.
  4. 5 dk için ksilen içinde slaytlar bırakın. Tekrarlayın.
  5. Bir damla eklemeSlayt ve yer lamel Cytoseal 60.

Tablo 1'de, yukarıda anlatılan prosedürlerde kullanılan reaktifler listelenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

B7-H1 başarılı immunhistokimyasal pankreatik adenokarsinoma B7-H1 (kahverengi işaretleri DAB renk geliştirilmesi) heterojen ifadesi gösterecektir. Diğerleri B7-H1 veya B7-H1 (Şekil 2 ve 3) az ifade ya ağırlıklı sitoplazmik ifade var ancak bazı pankreatik adenokarsinoma hücreleri B7-H1 ağırlıklı membranöz ekspresyonu (Şekil 1A) var. Normal pankreatik kanal epitel (Şekil 4) B7-H1 biraz ifade eder. Bir fare IgG1 κ izotip kontrol antikor ile lekelenmesi yerine anti-B7-H1 an...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Cryosections B7-H1 immünohistokimyasal boyama Kanseri 3,4 çeşitli önceki çalışmalarda rapor edilmiştir. Bununla birlikte, klinik tümör örnekleri genellikle sadece parafine gömülmüş blok şeklinde kullanılabilir. 5H1 monoklonal antikor daha yakın başarıyla renal hücreli karsinom, serviks kanseri, mesane kanseri ve melanom 13-18 gibi parafin tümör dokularının boyama uygulanmıştır. Parafine gömülü 9,19 veya kriyostat diğer monoklonal antikorlar ile pankreatik adenokarsinoma dokuların 20...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

EB, KMB, ve HX eşit katkıda bulunurlar. Bu çalışmada, gastrointestinal kanserler P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten Vakfı, Viragh Vakfı, ASCO Genç Araştırmacı Ödülü, NIH 5T32 CA0090701-28 Eğitim Bursu, Sol Goldman Pankreas Kanseri Merkezi ve Ulusal Pankreas Vakfı NCI SPORE tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
CSA Sistemi Dako K1500 Peroksidaz blok, streptavidin-biotin kompleksi, amplifikasyon reaktifi, streptavidin-HRP ve DAB substrat ve kromojen: Aşağıdaki protokolde belirtilen reaktifler içerir
Avidin / Biotin Engelleme Kiti Vektör SP-2001
Blok ACE Serotec BUF029
Biotin anti-fare IgG1 BD 553441
Fare IgG1 K izotip kontrol eBioscience 14-4714-85
10X TBS (salin Tris tamponlu), Cellgro 46-012-CM 10xTBS 80 g / L NaCl ve 24.2 g / L tırlar içerir;
Yıkama için ddH2O ile 1X seyreltilir;
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 1 ml TBST yapmak için 1X TBS 1 L eklendi
Hedef Alma, 20x Celerus Dalga 014-3000-000 GKD 2 O ile 1x Seyreltilmiş
190 Proof Etil Alkol Pharmco-Aaper 111000190
200 Proof Etil Alkol PHARMO-Aaper 111000200
Ksilen VWR 95057-827
Hematoksilen Richard-Allan Bilimsel 72804
Cytoseal 60 Richard-Allan Bilimsel 8310-4
Lameller Corning 2940-245
Nem odası Sigma H6644
Tablo 1. Reaktifler ve cihazlar.

Kaynaklar

  1. Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
  2. Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
  3. Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
  4. Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
  5. Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
  6. Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
  7. Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
  8. Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
  9. Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
  10. Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
  11. Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
  12. Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
  13. Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
  14. Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
  15. Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
  16. Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
  17. Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
  18. Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
  19. Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
  20. Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
  21. Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Antijen Eri imiDAB Renk Geli tirmeAntikor BoyamaDoku DehidrasyonuMikroskopi AnaliziSinyal Amplifikasyonu
Pankreas Adenokarsinom Doku B7-H1 immünohistokimyasal boyanma (PD-L1) parafin Slaytlar
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.