Yöntem makalesi

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/4165

⸱

4 Aralık 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Center for Molecular and Tumor Virology, Louisiana State University Health Sciences Center, 3Department of Microbiology and Immunology, SUNY Upstate Medical University, 4Feist-Weiller Cancer Center, Louisiana State University Health Sciences Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phagokinetic motilite parça tahlil hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle, tahlil, bir nicel bir şekilde, zaman içinde chemokinesis (rastgele hücre hareketliliğinin) ölçer. Tahlil, koloidal altın kaplama lameller üzerine onların hareket ölçülebilir bir parça oluşturmak için hücrelerinin yeteneği yararlanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel motilite tek hücreli ve çok hücreli canlılar için önemli bir biyolojik süreçtir. Bu besinlerin veya uzak uygun koşulların yanı sıra doku gelişimi, bağışıklık gözetim ve yara iyileşmesi için çok hücreli organizmalarda olduğu gibi, sadece birkaç rolleri 1,2,3 söz kaynağı doğru tek hücreli organizmaların hareketi için gereklidir. Bu işlemin önemli Deregülasyon, nörolojik kardiyovasküler ve immünolojik hastalıkların yanı sıra, şiddetlenir tümör oluşumuna yol açan ve 4,5 yayılabilir. Moleküler, aktin polimerizasyonu ve reseptör geri dönüşüm hücre 6,7,8 öne hareketini götürmek hücresel uzantıları (lamellipodia), yaratmada önemli rolleri olduğu gösterilmiştir. Ancak, hücre göçü ile ilgili birçok biyolojik sorular yanıtsız kalıyor.

Insan sağlığı ve hastalık hücresel hareketlilik açısından merkezi bir rol özgü mec anlamanın önemini vurgularhanisms bu süreç içinde yer alan ve özellikle önemli hücre hareketi değerlendirilmesi için doğru yöntem sağlar. Mikroskop genellikle hücre hareketi görselleştirmek için kullanılır. Ancak, hücre hareketli hücrelerin nicel zaman lapsed filmleri oluşturmak için pahalı kameralar ve yazılım gerektiren bir kaynak-alıcı bir süreç hücre göçü kantitatif ölçümü yapmak, oldukça yavaş hareket ettirin. Bu nedenle, maliyet-etkin olmayan zahmetli ve bu ortak laboratuvar ekipmanı kullanan bir hücre göçü bir kantitatif ölçümü gerçekleştirmek için yeteneği birçok araştırmacı için büyük bir ihtiyaçtır.

Phagokinetic parça motilite tayini kolloidal altın kaplamalı cam lamel 9,10 ölçülebilir bir parça oluşturmak için onun yolundan altın parçacıkları temizlemek için hareketli bir hücre yeteneğini kullanır. Serbestçe kullanılabilir yazılım kullanımı ile, birden fazla parçayı istatistiksel gereksinimleri gerçekleştirmek için her tedavi için değerlendirilebilir. Tahlil değerlendirmek için kullanılabilecekBu tür kanser hücrelerinin 11,12, fibroblastlar 9, nötrofiller 13, iskelet kas hücreleri 14, keratinositler 15, trofoblastlar 16, endotel hücreleri 17 ve monositler 10,18-22 gibi birçok hücre tipleri, motilitesi. Protokol sodyum sitrat ile chloroauric asit (Au 3 +) bir azalma ile oluşturulan nanoparçacıkların (Au °) ile kaplanmış slaytlara oluşturulmasını içerir. Bu yöntem, 1951, 23. Turkevich ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve sonra Frens ve diğerleri tarafından 1970 de geliştirilmiştir. 24,25. Bu kimyasal indirgeme aşamasının bir sonucu olarak, altın parçacıkları (çap: 10-20 nm), tepkime karışımından, çökelti ve hücre göçü analiz 9,26,27 kullanıma hazır sonra cam lameller üzerine tatbik edilebilir.

Genel olarak, phagokinetic parça motilite hücresel tahlil motilite hızlı, basit ve kantitatif ölçüsüdür. Buna ek olarak,Zaman lapsed görüntüleme, hem de, araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak başka kullanım için müsait olmayan hücre tipleri ile birlikte kullanım için, basit bir yüksek hacimli tahlil olarak kullanılabilir. Birlikte, kantitatif pahalı mikroskoplar ve yazılıma gerek olmadan birden fazla hücre tipleri hücresel motilite ölçme yeteneği, ortak laboratuvar ekipman ve kimyasalların kullanımı ile birlikte, hücresel anlamada phagokinetic parça motilite tayini ile ilgilenen bilim adamları için sağlam bir seçim yapmak motilite.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Jelatin-kaplanmış lameller hazırlanması

  1. Bir steril plastik 100 mm çanak (es) yerleştirin asitle yıkanmış cam lameller (çapı 15 mm). Tabak başına 8-9 lamelleri yerleştirin ve birbirlerine dokunmadan veya yemeğin tarafında değil emin olun ..

Not: lameller, iğneler ve cımbız muhtemel kirletici mikroorganizmaların, hem de hareketliliği de dahil olmak üzere hücresel fonksiyonlar, endotoksinler etkiler ortadan kaldırmak için steril olması gerekmektedir.

  1. Jelatin toz tartılır ve 0.5 g/300 ml 'lik nihai bir konsantrasyon ile bir jelatin solüsyonu yapmak için deiyonize su içinde tekrar süspansiyon toz. Daha sonra, jelatin solüsyonu otoklava gerekmektedir.
  2. Pipet 2-3 her bir lamel üzerine jelatin (~ 100-150 ml) damla.

Not: Jelatin çanak dokunmak veya çanak lamelleri kaldırmak mümkün olmayacaktır izin vermemek için dikkatli olun.

  1. 10 dk için 90 ° C sıcaklıkta bir fırında 100 mm tabak jelatin kaplı lamelleri pişirilir.
  2. Nazik pipetleme tarafından aşırı jelatin çıkarın.
  3. 45 dk için 70 fırın içinde 100 mm tabak ° C lamelleri kurutun.
  4. Kuruduktan sonra, steril, endotoksin ücretsiz iğne ve cımbız (iğne hafifçe kaldırmak için yavaşça cımbız için erişilebilir yapmak için lamel kadar dürtmek için kullanılan) kullanarak 100 mm çanak lamelleri çıkarın.
  5. 24-iyi çanak ayrı kuyulara bireysel jelatin kaplı lamelleri yerleştirin.

2. Kolloidal Altın kaplı lameller hazırlanması

  1. Chloroauric asit (tetrakloro asit trihidrat; HAuCl 4 · 3H 2 O) uygun bir miktarı tartılır ve sonra bir nihai 14.5 mM solüsyonu (zehirli) maddesinin hazırlanması için steril deiyonize su içinde tekrar süspansiyon haline getirin. 8-9 lamelleri başına çözelti 1.5 ml hazırlayın.

Uyarı: Chloroauric asit hkucak dolusu yutulduğunda, Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur ve alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir. Yutulması halinde toksiktir.

  1. Sodyum sitrat, uygun bir miktarda tartılır (trisodyum dihidrojen 2-hydroxypropane-1 ,2,3-tricarboxylate, Na 3 C 6 H 5 O 7) ve daha sonra son bir% 0.5 çözelti yapmak üzere deiyonize su içinde tekrar süspansiyon toz. 8-9 lamelleri başına 1 ml çözelti hazırlayın.

Uyarı: Sodyum sitrat göz ve cilt tahrişine neden olabilir. Ayrıca solunum ve sindirim yollarında tahrişe neden olabilir.

  1. Steril, endotoksin ücretsiz beher içinde steril 14.5 mM HAuCl 4 solüsyon ve steril deiyonize su 13.5 ml 1.5 ml birleştirmek sonucu soluk sarı bir çözelti elde edilmelidir. Adı geçen hacimleri için 8-9 koloidal altın lamelleri için izin verir.
  2. Sürekli karıştırarak ederken bu b başlayana kadar, bir sıcak plaka üzerinde çözüm ısıtmakyağ.

Uyarı: buharları toksik / zararlı olabilir gibi çözüm ısıtma, davlumbaz yapılmalıdır. Buharlar mukoza ve üst solunum yolu dokusu için yıkıcı vardır.

  1. Sıcak plaka gelen beher çıkarın.
  2. Karıştırma sırasında,% 0.5 sodyum sitrat solüsyonu 0,7 ml eklenir. Söz konusu hacim yapılacak 8-9 koloidal altın lamelleri için izin verir.
  3. Yaklaşık 2 dakika için bu birleşik çözüm karıştırarak tutun (Not: çözüm rengi yavaş yavaş nihayet bir kırmızı şarap ulaşmadan önce, derin mor, mor, gri, açık veya, tercihen, pas rengi, soluk sarı değişecektir) . Bu ürün kolloidal altın çözümdür.
  4. 1-2 dk (koloidal altın çözeltisi eklendiğinde, erime lamel jelatin tabaka tutmak için) için 10 ml lik bir pipet, koloidal altın çözelti soğutulur ve daha sonra colloida bir 1.0-2.0 mLbakınız - önceden bir 24-kuyu çanak (ler) (bu, jelatin kaplı lamelleri eklediği koloidal altın çözelti miktarı altın parçacıkları çözelti içinde çökeltilmiştir ne kadar iyi bağlıdır yerleştirilmiş her bir jelatin kaplı lamel üzerine l altın çözelti aşağıdaki yorum).

Not: altın partikül Yağış verimliliğinde farklılıklar olabilir Çünkü, ilk jelatin kaplı lamelleri için koloidal altın çözeltisi 0.5-1 ml ekleyin ve sonra 0.5 saat boyunca inkübatörde 24-iyi çanak koymak için tavsiye edilir . Bu inkübasyon süresinden sonra, lamelleri lameller üzerine altın parçacıkları uygun yoğunluk için hafif mikroskop altında kontrol edilmelidir. Altın parçacıkları çok düşük ve çok yüksek bir konsantrasyon örnekleri 20x mikroskobu görüntüleri için Şekil 1'e bakınız. Altın parçacıkları (en azından monositler ile kullanmak için) ideal bir konsantrasyon 40x mikroskopi görüntü elde etmek için Şekil 2'ye bakınız. Optfarklı hücrelerin özellikleri lamelleri üzerine hareketin kendi gücünü dikte edecek gibi slayt üzerinde altın nanopartiküller olmuş bölgeler yoğunluğu deneysel, kullanılan her bir hücre tipi için tespit edilmelidir. Altın partiküllerinin konsantrasyonu yetersiz ise, jelatin kaplı lamelleri ile koloidal altın çözeltisi ilave 0.5-1 ml eklenir.

Hücre boyutuna bağlı olarak, altın partiküllerinin uygun konsantrasyonu değişebilir ve bu, bunun bir sonucu olarak hareketlilik açısından incelenmiştir hücre boyutuna bağlı olacaktır. Örneğin, küçük ölçekli hücreleri (~ 10-20 mikron 28) insan monosit ile, altın parçacıkları daha yüksek bir konsantrasyon analizlerimiz gerek duyuldu. Nanoparçacıkların uygun dağılımını kolayca ve verimli bir hücresel parçaların kenarları ayırt edebilme becerisi ile araştırmacı sağlar. Çok yüksek altın parçacıkları bir konsantrasyon doğru bir şekilde ölçmek için dolayısıyla hareket etmek için ve hücrelerin yeteneğini engellemektedirhareketliliğini iken motilite doğru bir parça çizmek için çok düşük limitler olanları yeteneğidir altın parçacıkları bir konsantrasyon.

Önemli Not: nanoparçacıkların sentez soruna neden olan, sentez nanoparçacıkların 5 nm ile 400 nm boyutlarda ticari olarak temin edilebilir. Buna ek olarak, floresan mikroküreler hücre hareketi 29 çalışmalarda aynı zamanda kullanılmıştır. Ancak, bu mikrosferler kullanımı hücre göçü ve analizi için bir floresan mikroskobu gerektirir.

  1. 37 küvözde kolloidal altın kaplı lamelleri ile 24 sıra tabak koyun 1 saat gecede ° C ve inkübe.
  2. Inkübasyondan sonra, durulama / (PBS, pH 7.4) tamponlu salin steril fosfat içine lamelleri (3x) batırarak ilişkisiz altın kaldırın.
  3. PBS içeren temiz 12-iyi çanak (es) bu kolloidal altın kaplı lamelleri yerleştirin.
  4. 4 ° C 'ye kadar olan bu lamelleri depolamak için hazır(parafilm buzdolabında yerleştirmeden önce plaka) kullanın.

Önemli Not: Her zaman altın parçacıkları lamelleri gelen soyulmaz kurumasına izin verirseniz olabildiğince sıvı / medya bazı tür kolloidal altın kaplı lamelleri tutmak. Kolloidal altın lamelleri yapıldığı tarihten itibaren 2-3 ay içinde kullanılmalıdır.

Kalite Kontrol: tek bir parça phagokinetic motilite tahlil olarak, altın parçacıkları benzer bir konsantrasyon ile karakterize edilir lamelleri kullanmak için çok önemlidir. Bu basit nokta muamele ile değil, koloidal altın kaplı lamelleri fiziksel özelliklerinin doğası sadece bağlı olduğu örnekleri arasında hücre hareketliliği de kantitatif farklılıklar için izin verir. Bu nanoparçacıkların yoğunluk sürece eşit olduğunu göstermiştir olmakla beraber, ayrı deneyler, aynı anda yapılan tek lamelleri kullanarak lehine, lamelleri kullanımıFarklı hazırlıkları uygundur.

3. Hücresel Motilite Analiz

  1. İlgi hücreleri için uygun bir hücresel ortamda, koloidal altın kaplama lamelleri yerleştirin.
  2. 24-iyi çanak (es) yerleştirilir kolloidal altın kaplı lamelleri üzerine uygun şekilde tedavi hücreleri aktarın

Not: tek bir iyi transfer hücrelerin sayısı, her bir hücre tipinde çalışma için tespit edilmesi gerekmektedir. İdeal olarak, hücrelerin eşit sırayla tek bir hücre tarafından oluşturulan tek parça istatistiksel analiz için izin verecektir kolloidal altın kaplı lamel üzerinde dağıtılması gerekir. Hücrelerinde çok yüksek bir konsantrasyonda kaplama durumunda, birden fazla hücre çakışan rota görülecektir ki son derece olası hale gelir. Örtüşen parça doğru nicelendirildi edilemez ve dolayısıyla bunlar, test edilen hücre hareketi, sonuç olarak dikkate alınması mümkün değildir. Bir sonucu olarak parça Örtüşenbirden fazla hücre tutulum genellikle kolayca gözlenir; iki ya da daha fazla hücrenin aynı bitişik temizlenmiş bir alana görülebilir olan parça (analizi alanında) birleştirilmiş ya da çapraz olarak.

  1. 37 inkübe ° 24 hr C /% 5 CO 2 (veya herhangi uygun bir zaman, biz 6 saat ve 12 saattir tedavi sonrası 24 saat sonrası tedavi ve endotel hücreleri arasında monosit motilitesini analiz ettiler örneğin). Hücre tipi çalıştı ve böylece deneysel her bir hücre türü (- 12 saat sonrası tedavi iyi bir başlangıç ​​noktası, ancak, 6, olduğu) için tespit edilir ile hücre hareketliliği belirlenmesi ve ölçülmesi için optimum süre çerçevesi değişecektir.

Not: Deneysel kolloidal altın kaplı lamelleri daha sonraki bir zamanda depolanan ve / veya analiz edilmesi gerekiyorsa, hücreleri ve altın nanopartiküller lamelleri üzerine sabit olması gerekir. Bu tespitin adımı gerçekleştirmek için; aşağıdaki Adım 3.3, ilk yıkamada 1x ile dikkatlice 2 kez lamelleriPBS (lamelleri altın nanopartiküller bir kaldırma kaçınılmalıdır gibi lamelleri daldırma, tercih edilir), daha sonra bu oda sıcaklığında 3% paraformaldehit ile inkübasyon gibi standart bir cep fiksasyon yöntemi kullanın. 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra,% 3 paraformaldehid çıkarılmalı ve lamelleri 1 x PBS ile dikkatle 3 kez yıkandı. Lamelleri sabit bir buzdolabında saklanır.

  1. Bir ışık mikroskobu kullanarak, tek bir hareketli hücre (: Kesinlikle soruşturma altında hücre türüne bağlı olarak değişir hücresel parçalarının fotoğraflarını çekmek için kullanılan büyütme Not) tarafından oluşturulan parça görüntüleri yakalayabilir. Koloidal altın kaplanmış lameller üzerine olmayan hareketsiz ve hareketli hücreler tarafından oluşturulan hücre parçaları örnek olarak Şekil 2 'de gösterilmiştir.

Not: phagokinetic parça motilite ölçüm içinde kullanılabilir boyutu nanoparçacıkların hücre 30 için tamamen toksik olduğu tespit edilmiştir. Gerekirse, Incelenen hücre canlılığı tripan mavisi ile boyanarak değerlendirildi veya hücresel canlılığı diğer belirteçleri için incelenebilir. Bir bu adımı taahhüt gerekiyorsa, dikkate sabitleme vb fiksasyonu, türü için ihtiyaç almak zorunda kalacak.

  1. Böyle ImageJ yazılımı (olarak serbestçe kullanılabilir yazılım kullanma http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) veya NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ geliştirilen), hem Ulusal Sağlık Enstitüleri, veya ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ) San Antonio, Texas Sağlık Bilimleri Merkezi tarafından temizlenmiş, kolloidal altın ortalama alanı (keyfi birimler olarak) Üniversitesi'nde geliştirilen 10-20 veya daha fazla hücre (örnek başına) çekilen görüntülerin her deneysel kol için belirlenir. İstatistikler ardından t yapılabilirO sonuçlar toplanır. Örneğin, sonuçlar gelir olarak çizilebilir ± örnekler arasında istatistiksel anlamlılık ölçütü olarak kullanılan Student t yapılan testler ve bir P değeri <0.05 olan (SEM) ve standart hataları. Şekil 3 ve 4 gösteri adımları hücre tarafından temizlenir koloidal altın alan analizi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gösterilen tek bir hücre (bizim deneyler bir monosit Şekil 2 'de gösterilmiştir) tarafından temizlenir bir izi alanı gösteren bir ışık mikroskobu altında alınan resimlerin bir örnektir. Non-motil hücrelerin karakteristik küçük, oval veya bu uyarılmamış hücreleri (Şekil 2A ve 2B) için hareket düşük bazal seviyesini gösteren kendi etrafında daire şeklinde yolları oluşturmak. Bunun aksine, yüksek derecede hareketli hücreler [Sistemimizde, insan sitomegalovirüs (HCMV) ile e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede sunulan phagokinetic parça motilite tayini hücre göçü kantitatif analiz için basit ve son derece etkili bir yöntemdir. Birden fazla hücre tipleri 9-17 analiz edilebilir, çünkü bu yöntem farklı disiplinlerde potansiyeline geniş bir kullanıma sahiptir. Koloidal altın kaplı cam lameller kullanımı, bir hareket eden bir hücre ile temizlenmiş bir izi alanı ölçümü sağlar. Test hücresi motilitesi üzerine (ECM ligandlar, virüsler, bakteriler saflaştırılmış yani büyüme faktörleri,) farklı uyaranlar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI050677, HD-051998 ve GM103433), bir Malcolm Feist kardiyovasküler araştırma bursu ve bir Amerikan Kalp Derneği predoctoral bursu (10PRE4200007) hibe tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
Cam lameller (15 mm) Fisher Scientific 12-545-83
Jelatin 300 Bloom Sigma-Aldrich G-1890
Tetrakloro Asit Trihidrat Fisher Kimyasal G54-1 14.5 mM (nihai bir çalışma çözeltisi)
Sodyum Sitrat Fisher Scientific BP327-500 % 0.5 (bir son çalışma çözeltisi)
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042 % 3 (nihai çalışma çözeltisi)
100 mm Doku Kültürü Bulaşık Sarstedt 83.1802
12-Peki Tabaklar Fisher Scientific 08-772-29
24-Peki Tabaklar Fisher Scientific 07-200-84
Techne Fırın Hybridiser HB-1D LabPlanet 2040500 Standart laboratuvar fırın yeterli olacaktır
10 ml Serolojik Pipetler Sarstedt 86.1254.001
Pipet-Aid Dolgu / Dispenser Drummond 13-681-15
P200 Tek Kanal Manuel Pipet Rainin PR-200
200 ml Bariyer ipuçları CLP BT200
ImageJ yazılım http :/ / rsb.info.nih.gov / ij / Lisans: Public Domain
Bir photometrics CoolSNAPfx Nikon Eclipse TE300 12-bit CCD kamera monokrom Nikon Durduruldu; en karşılaştırılabilir şartname Nikon Eclipse Ti sahiptir, ancak alt uç Nikon 80i de uygun olacaktır. Diğer markalar da karşılaştırılabilir mikroskoplar sağlamak.
Not: Aşağıda listelenen reaktifler ve ekipman bizim çeşitli çalışmalarda bize tarafından kullanılmıştır. Diğer malzemeleri, tedarikçi, reaktifler ve ekipman sürece onlar benzer özelliklere sahip olarak, kullanılabilir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
  2. Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
  3. Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
  4. Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
  5. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  6. Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
  7. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  8. Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
  9. Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
  10. Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
  11. Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, Humana Press. 379-392 (2010).
  12. Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
  13. Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
  14. Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
  15. Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
  16. Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
  17. McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
  18. Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
  19. Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
  20. Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
  21. Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
  22. Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
  23. Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
  24. Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
  25. Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
  26. Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
  27. Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
  28. Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
  29. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14(2005).
  30. Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
  31. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
  32. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  33. Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
  34. Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
  35. Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cellular Motility MeasurementGold Nanoparticle CoatingChloroauric Acid ReductionGelatin Coated Cover SlipsLight Microscopy AnalysisImage J SoftwareCell Migration QuantificationColloidal Gold PreparationMotility Track Analysis

İlgili makaleler