Cilalı ve takviyeli ince kafatası (portlar) kraniyal pencere ve glioblastoma (GBM) hücre enjeksiyonu birleştirerek, glioma inisiyasyon ve uzunlamasına bir canlı fare beynindeki enjekte GBM hücreleri büyüme gözlemleyebilirsiniz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Görüntüleme Glioma Başlatma
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Glioma insan kanser en öldürücü biçimlerinden biridir. Tarih-cerrahi en etkili glioma tedavisi arkasından radyoterapi çoğu hastada glioma relaps 1,2 nedeniyle tanıyı takiben beş yıldan fazla hayatta yok gibi, hastalar sadece mütevazı yararları tedavi sunmaktadır. Insan beyin tümörlerinde kanser kök hücrelerinin keşfi glioma 3 için yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi üzerinde büyük bir etkiye sahip için umut vaat ediyor. Kanser kök hücrelerinin yeteneği-kendini yenilemek ve ayırt etmek her ikisi tarafından tanımlanır ve yeni tümörler 4 başlatmak için kapasiteye sahip bir tümör tek hücreler olduğu düşünülmektedir. Glioma nüks aşağıdaki radyoterapi tedavisine glioma kök hücrelerin direncini (GSCs) kaynaklandığı düşünülmektedir 5-10. İn vivo olarak, GSCs kendi kök hücre benzeri özellikler 11-14 korumak için önemli bir perivasküler niş ikamet gösterilir . Kuruluşlar için MerkezGSC niş kıymetleştirme 12 vasküler endotel hücreleri vardır. Mevcut kanıtlar vasküler endotel hücreleri ile GSCs ve etkileşim tümör gelişimi için önemlidir ve glioma için önemli terapötik hedefler olarak endotel hücreleri ile GSCs ve etkileşimi tanımlamak düşündürmektedir. GSCs varlığı ortotopik nakli 15 üzerine yeni tümörler başlatmak için kendi yeteneği ile deneysel olarak belirlenir. Bu durum, tipik insan tümör ciddi bağışıklık eksikliği olan farelerin beyin ya da congenic ev sahibi farelerin beyin içine fare GBM hücre içine izole GBM hücreleri, belirli bir sayıda enjekte edilerek elde edilir. Tümör büyümesi için Tahliller sonra enjekte GBM hücreleri arasındaki GSCs yeni tümörler-genellikle birkaç hafta veya ay çıkması için izin vermek için yeterli zamanı takip yapılmaktadır. Bu nedenle, mevcut testler in vivo tek GSCs tümör inisiyasyon önemli patolojik sürecin incelenmesi izin vermez. Sonuç olarak, temel iTümör inisiyasyon erken dönemlerinde vasküler endotel hücreleri ile GSCs ve etkileşim belirli rolleri nsights eksiktir. Bu tür anlayışlar glioma için yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için kritik önem taşımaktadır ve hastaların glioma nüksü önlemek için büyük etkileri olacaktır. Burada Limanlar kraniyal pencere yordamı 16 uyarladık ve in vivo iki foton mikroskopi canlı fare beynindeki enjekte GBM hücreleri tümör inisiyasyon görüntülenmesine izin verir. Bizim teknik glioma inisiyasyonu sırasında GSCs ve damar endotel hücreleri arasındaki önemli sinyal mekanizmaları aydınlatmak için gelecekteki çabalara yol açacaktır.
Protokol
1. Protokol
- 0.1 mg ketamin ve vücut ağırlığı başına 1 g xylazine, 0.01 mg arasında bir dozda ketamin ve ksilazin ile fare anestetize. Carprofen (vücut ağırlığının 1 g başına 0.005 mg) analjezi için kullanılır ve ameliyat öncesi uygulanır.
- Diş matkap gibi cerrahi aletler, her otoklavda buharla sterilize vardır. Toplu ameliyatlar yapılacak ise, cerrahi aletlerin ipuçları sonraki her ameliyattan önce bir cam boncuk sterilizatör (Güzel Bilim Araçları FST 250) ile yeniden sterilize edilmelidir.
- Fare ayak tutam yanıt yokluğu ile değerlendirilen anestezi cerrahi bir düzlem, ulaştığında, o zaman ~ 37 ° C arasında bir vücut sıcaklığını korumak için ısıtılmış pad üzerinde yerleştirilen bir pamuk ped üzerine yerleştirilir Anestezi derinliği ameliyat sırasında sıklıkla izlenir.
- Kürk kabaca üçgen alanda dorsal kafa ~ burun için kaudal 3 mm kaldırılır ve ce kaudal uzananrvical omurları. Oftalmik merhem dehidratasyon ve tahrişe karşı onları korumak için gözlere uygulanır.
- Fare karın recumbancy yerleştirilir ve deri cerrahi iyot,% 70 etanol, ve steril çubuklar ile dezenfekte edilir. Kafatasının frontal ve parietal kemiklerin dorsal kapsayan bir deri 0.8 x 1.0 cm flep ince makas kullanılarak kaldırılır.
- Bir topikal analjezik,% 0.5 lidokain, yaranın periferinde periost ve maruz dokulara lokal uygulanır. Periost hafifçe bir neşter bıçağı ile kafatası kazıyarak kaldırılır, bu kemiğe yapışma siyanoakrilat yapıştırıcı yardımcı olacaktır.
- Ilgi kortikal alan bir işaretleyici ile kafatası üzerinde belirtilmiştir. Ilgi alanı yatan büyük damarlara zarar görmesini önlemek için, kafatasının dikiş hatları üzerinde yer olmamalıdır.
- Siyanoakrilat yapıştırıcı ince bir tabaka halinde dışında serosanguinous sıvı sızıntı önlemek için, yara kenar uygulanır ve kafatası için birİlgi alanı.
- Işık aktive diş çimento kafatası sızdırmazlık için protokol kullanılır. Diş çimentosu, kullanımından önce inceltme amaçlı alan hariç tüm maruz kafatası primerler ile ve daha sonra ışık ile aktive olan diş çimento kiti ile bağlayıcı madde ile muamele edilir. Bağlayıcı madde kuruduktan sonra, ışıkla aktive olan diş çimentosu kafatası kapak tatbik edilir. Sonraki cerrahi ve görüntüleme için fare başı sabitlemek için, steril bir # 00-90 altıgen somunu inceltilmesi alanından uzakta diş çimento içine yerleştirilmiştir. Işık aktif diş çimento kullanımı bize tüm prosedürü tamamlamak için acele etmeden kafatası hazırlamanızı sağlar. Kafatası üzerinde diş çimento hazırlık tamamlandıktan sonra, diş çimento görünür ışık ile tedavi edilir.
- Diş çimento tedavi edildikten sonra, stereotaktik cihaz bir başlık tutucu bir # 00-90 vida kullanarak fare kafasına altıgen somunu monte edilir.
- Bir droda sıcaklığında op,% 0.9 steril salin inceltilmesi kafatası bölgeye uygulanır. Bir stereomikroskop yardımı ile, bir yüksek-hızlı mikro-matkap ilgi bölgesi üzerinde (çapı tipik olarak ~ 4-5 mm) kafatasının dairesel bir alanda inceltmek için kullanılır. Sondaj ve delinen bölgeye salin uygulaması yatan serebral dokuya termal yaralanmalardan kaçınmak için inceltme işlemleri sırasında zaman zaman yapılmaktadır. Tuzlu ısı emer ve aynı zamanda kemik yumuşatmak yardımcı olur.
- Fare kafatası süngerimsi kemiğin kalın bir tabaka sandviç, kompakt kemiğin ince iki katmandan oluşmaktadır. Kompakt ve kemik süngersi kemiğin en dış tabaka matkap kullanılarak kaldırılır.
- Süngerimsi kemik çoğunluğu kaldırıldıktan sonra, süngerimsi kemik içinde kalan boşluklar sondaj iç kompakt kemik tabakası yaklaştığını belirten bir diseksiyon mikroskop altında görülebilir. Bu aşamada, hala kafatası kalınlık fazla 50 um olmalıdır. Kafatası inceltme olmalıdırçok ince (~ 20 mikron) ve düzgün hazırlanması elde etmek için dikkatli devam.
- Kafatasının istenilen kalınlıkta (~ 20 mikron) sağlandıktan sonra, kafatası ilk yaklaşık 10 dakika boyunca elmas pasta ile ısmarlama silikon kamçı (6-15 mikron) kullanılarak parlatılır. Elmas pasta cila iki amaca hizmet eder. Birincisi, daha böylece alttaki beyin dokusuna kazara hasar kaçınarak, inceltilmiş kafatası üzerinde baskı uygulamadan kafatası incelir. Ince taneli kalay oksit daha kafatası parlatma için kullanılır önce İkincisi, inceltilmiş kafatası için bir başlangıç parlatma adım olarak hizmet vermektedir.
- Elmas macun parlatma ardından, inceltilmiş kafatası yaklaşık 10 dakika boyunca kalay oksit ile parlatılır. Kafatası cilalı kez inceltilmiş kafatası temiz görünene kadar, kalay oksit salin ile uzak temizlendi.
- Kranyal pencere in vivo görüntüleme uzunlamasına için kullanılacak ise, bu aşamada, temizlenmiş ince kafatası alan kurutulur. Berrak küçük bir damlasiyanoakrilat yapıştırıcı kafatası pencere mühürlemek için uygulanır. Inceltilmiş kafatası ve lamel arasında siyanoakrilat yapıştırıcı tabaka mümkün olduğu kadar ince olmalıdır.
- Bir enjeksiyon bu aşamada, bir bağlantı noktaları kafatası pencere oluşturulduktan sonra yapılacak ise, bir 26-gauge iğne enjektör cilalı ince pencere kafatası bir tarafında küçük bir açıklık oluşturmak için kullanılır. Bu açılış GBM hücre enjeksiyon için kullanılır.
- Çapı yaklaşık 50 mikron açarak ucu olan bir steril cam pipet pipet çektirmesi kullanılarak çekilir. Bu pipet GBM hücre enjekte etmek için kullanılabilir, ve bir micromanipulator üzerine yüklenir. Pipet GBM hücre enjeksiyon yerinde nihai görüntüleme sitesinden uzak olacak şekilde 30 derecelik bir açıyla yüklenir. Pipet ucu bir teşrih mikroskopu altında uzaklaştırılır. GBM hücre süspansiyonu bir şırınga pompası ile emme ile pipeti içine önden yüklemeli olduğunu.
- Enjeksiyon pipet GBM hücreleri ile yüklendikten sonra, fare inci altında geri hareket ettirilire mikroskop. Enjeksiyon pipet kafatası pencere içinde küçük açıklığa doğru indirilir ve son olarak bir micromanipulator kullanılarak açıklıktan beyin içine yerleştirilir. GBM bir hücre süspansiyonu 1 ul beyin yüzeyinden beyin 100-200 mikron (: 0.1 ul / dk, uzun süre 10 dakika hızı) içine enjekte edilir.
- Kafatası kurutulur, berrak siyanoakrilat yapıştırıcı küçük bir damla kuru kafatası ile uygulanır, ve 3 mm boyutu # 1 lamel bir parça ince ve parlak kafatası alanına yapıştırılır. Lamel ve komşu diş çimento arasındaki boşluk siyanoakrilat yapıştırıcı ile mühürlenir.
- Ameliyattan sonra, fare 1 ml ılık steril serum fizyolojik ile cilt altına enjekte edilir ve tam anestezi kurtarıldı kadar vücut ısısını korumak için ek bir ısı ile sağlanır.
- Görüntüleme için, fareler 0.1 mg ketamin ve vücut ağırlığı başına 1 g xylazine, 0.01 mg arasında bir dozda ketamin ve ksilazin ile anestezi uygulanmıştır. Fare özel stereotaktik çerçeve kullanılarak immobilize edilmiştirmikroskop altında. In vivo görüntüleme tekrarlanan günlük bazda yapılırsa farelerin ketamin tekrarlanan kullanımı ile bağımlılık belirtileri gösteriyor gibi, isofluorane, daha iyi bir seçenek olacaktır.
2. Temsilcisi Sonuçlar
Başarılı Limanlar kraniyal pencere ameliyat kraniyal pencere haftalar veya aylar için açık kalmasını sağlar. Backscattered ışık kullanılarak görselleştirilmiş olarak Şekil 1 Limanlar kranial penceresinin altındaki damar gösterir. Bu damar görüntüleri tekrarlanan görüntüleme için aynı beyin bölgeleri bulmak için simgesel olarak kullanılmıştır. Damar endotel hücreleri ve GBM hücreleri hem görselleştirmek için, B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato ile vasküler endotel hücreleri etiketler B6.Cg-Tg (Tek-CRE) 1Ywa / J fare geçti ) Hze / J fare ve kırmızı floresan proteini tdTomato etiketli vasküler endotel hücreleri ile oluşturulan fareler. Biz o zaman bu mil üzerinde portları kraniotomi işlem gerçekleştirildice ve kraniyal pencere tarafında küçük bir açıklıktan beyinlerinin içine GFP etiketli GBM hücreleri enjekte. Daha sonra enjekte edilen fareler üzerinde boylamasına iki-fotonlu görüntüleme in vivo olarak gerçekleştirildi. Lazer dalgaboyu GFP ve tdTomato hem uyarma sonuçlandı 910 nm olarak belirlenmiştir. İki foton görüntüleme eşzamanlı yeşil / kırmızı floresans saptama yeteneği için iki dedektör ile özel yapılmış iki foton lazer tarama mikroskop üzerinde yapıldı. Şekil 2 damar yakınındaki enjekte GBM hücreleri ait glioma inisiyasyon vivo örnek gösterir. Limanlar kraniyal pencere de in vivo görüntüleme time-lapse kronik için mükemmel bir seçimdir. Şekil 3 Limanlar ameliyat olmadan bir fare kortikal bölümden GFAP boyama, Limanlar cerrahisi sonrası bir fare 7 gün ve bir fare 7 gün Limanlar cerrahisi sonrası ve gösterir salin enjeksiyonu. Bu görüntülerden fare olduğunu por cerrahi ve fare olmadan bellidirTS cerrahi beyin penetrasyonu ve salin enjeksiyonu Pipeti nedeniyle, salin enjeksiyonu takiben ise, gliozis fare beyin dokusunda görülür, gliozis yok. Bu sonuç, gliozis kraniyal pencere burada açıklanan bağlantı noktaları genelde bir "açık kafatası" kronik kraniyal pencere ile ilişkili gliozis yol olmadığını bağımsız doğrulama sağlayan, Limanlar kraniyal pencere altında oluşmaz göstermektedir. Şekil 4 yüksek çözünürlüklü gösterir Limanlar pencere de in vivo görüntüleme yüksek çözünürlüklü için mükemmel bir seçim olduğunu gösteren dendritik ameliyat günü aynı fare (Gün 0) dan dikenleri ve Limanlar pencere oluşturulduktan sonra 32 gün (Gün 32), görüntüleme.
Şekil 1. Backscattered ışık kullanılarak parlatılmış ve güçlendirilmiş inceltilmiş kafatası kraniyal pencere altında vaskülatürün Görselleştirme. Gün t temsil Ameliyattan sonra gün o sayı; resimler hemen GBM hücre enjeksiyonu tamamlandıktan sonra ameliyat günü başlayan alınmıştır. Ölçek çubuğu:. 0.5 mm büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. In vivo olarak enjekte GBM hücreleri ve damar Görselleştirme. Tek-Cre ve ROSA26 CAG-tdTomato hem taşıma Fareler GBM hücre enjeksiyon için kullanılmıştır. Vasküler endotel hücreleri tdTomato (kırmızı) ile işaretlendi ve GBM hücreleri GFP (yeşil) ile işaretlendi. Görüntüleri GBM hücre enjeksiyonundan sonra 24 saat başlayarak elde edildi. Bakış 10-12 bitişik alanların toplam alındı ve nihai görüntüleri üretmek için, toplam alanının merkezinde tanımlanan enjekte GBM hücreleri ile, birbirlerine bitişik monte edilmiştir. Gün cerrahi sonrası gün sayısını temsil eder. Ölçek çubuğu: 100 mikron.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/4201/4201fig2large.jpg" target = "_blank"> büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3. Gliozis Limanlar kraniyal pencere ameliyat sonrasında meydana gelmez. Üst paneller: Düşük büyütme altında Fare beynin koronal bölümünde. Sol panel: Herhangi kraniyal pencere ameliyat olmadan bir fare, hiç GFAP aktivasyonu beyin dokusunda görülmektedir. Orta paneli: beynin sağ tarafında oluşturulan bir Limanlar kraniyal pencere ile bir fare, hiç GFAP aktivasyonu beyin dokusunda görülmektedir. Sağ panel: PORTS pencere kenarındaki bir Limanlar kraniyal pencere ve salin enjeksiyonu ile bir fare. GFAP etkinleştirme bağlantı noktaları penceresinin tarafında görülmüştür, ama sağlam beyin dokusunun yan edilir. Ölçek çubuğu: 1 mm. Alt panel: Üst panel görüntülerin beyaz kutu içinde belirtildiği gibi alanlarda beyin dokularında daha yüksek güç görüntüler. Ölçek çubuğu: 100 mikron. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. Yüksek çözünürlüklü Thy-1 YFPH farelerden alınan dendritik diken görüntüleme. Görüntüleri Limanlar ameliyat gününde alınan ve 32 gün Limanlar ameliyat sonrası alındı. Çoğu dikenler gününde sunduğumuz görüntülerden 0 Limanlar ameliyatı takiben açıkça görülebilir 32 gün vardır açıktır. Ölçek çubuğu: 2 mikron.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Başarılı Limanlar kraniyal pencere anahtarı inceltme ve parlatma olduğunu. Incelme ilk hızlı yapılabilir iken, bakım geniş bir alana kafatası incelmesi homojen sağlamak için alınmalıdır. Biz genellikle serum fizyolojik mikrotur kez kafatasının geçti kısa bir süre sonra buharlaşır böyle, kafatasına salin ince bir tabaka uygulayın ve ardından ince kafatası tek geçişte bir anda. Bu kafatası bize yavaş fakat homojen daha ince sağlar. Mikroskop altında Kararlı bir yandan da anahtarıdır. Kafatası-incelme amaçlanan kalınlığı y...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu eser Jackson Laboratuvarı Kanser Merkezi Pilot Hibe ve Maine Kanseri Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| Sodyum piruvat ile DMEM/F12 (1:1) | Termo Sci Hyclone | SH3026101 | |
| B-27 Serum Ücretsiz Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| GlutaMax-1 Ek | Invitrogen | 35050061 | |
| Penisilin-Streptomisin Çözümü | Termo Sci Hyclone | SV30010 | |
| Accutase-Enzim Hücre Dekolmanı Orta | eBiosciences | 00-4555-56 | |
| T25 matara-havalandırma kapağı yeşil | SARSTEDT | 83.1810.502 | |
| % 70 alkol | JAX LAHS | ||
| % 10 povidon-iyot topikal çözüm | JAX LAHS | ||
| Ketamin HCl | Butler Hayvan Sağlığı Kaynağı | NDC # 11695-0550-1 | |
| Ksilazin | Akorn, Inc | NADA # 139-236 | |
| Carprofen | JAX LAHS | ||
| Oftalmik merhem | Dechra Veteriner Ürünleri | 17033-211-38 | |
| % 0.5 lidokain HCl | REGENT, Inc | NDC 0517-0625-25 | |
| Siyanoakrilat yapıştırıcı | Henkel A.Ş. | 46551 | |
| Steril Swablar | Fisher Scientific | 23-400-114 | |
| Elmas pasta | Widget Kaynağı | BBE60 | |
| Kalay oksit | LORTONE, Inc | 591-038 | |
| Liner Bond 2V | KURARAY Medikal A.Ş. | 1921-KA | |
| Clearfil AP-X | KURARAY Medikal A.Ş. | 1721-KA | |
| Tuzlu | JAX LAHS | ||
| Cam Kapak | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Lokma | Küçük Parçalar, Inc | HNX-0090-C | |
| Şırınga Pompası | Syringepump.com | KD-1000 | |
| İki-Foton görüntüleme sistemi | Özel dahili (Herhangi bir ticari sistem olurçalışması) |
Kaynaklar
- Paulino, A. C., Teh, B. S. Treatment of brain tumors. N. Engl. J. Med. 352, 2350-2353 (2005).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Cheng, L., Bao, S., Rich, J. N. Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma. Biochem. Pharmacol. 80, 654-665 (2010).
- Cheng, L., Ramesh, A. V., Flesken-Nikitin, A., Choi, J., Nikitin, A. Y. Mouse models for cancer stem cell research. Toxicol. Pathol. 38, 62-71 (2010).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol. Oncol. 4, 420-430 (2010).
- Ebben, J. D., et al. The cancer stem cell paradigm: a new understanding of tumor development and treatment. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 621-632 (2010).
- Germano, I., Swiss, V., Casaccia, P. Primary brain tumors, neural stem cell, and brain tumor cancer cells: where is the link. Neuropharmacology. 58, 903-910 (2010).
- Park, D. M., Rich, J. N. Biology of glioma cancer stem cells. Mol. Cells. 28, 7-12 (2009).
- Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843-7848 (2006).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11, 69-82 (2007).
- Barami, K. Relationship of neural stem cells with their vascular niche: implications in the malignant progression of gliomas. J. Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).
- Gilbertson, R. J., Rich, J. N. Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche. Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).
- Cho, R. W., Clarke, M. F. Recent advances in cancer stem cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
