Yöntem makalesi

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

DOI:

10.3791/4239

⸱

17 Eylül 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Oncology and Stem Cell Transplantation, University Medical Center Freiburg

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçiş anafaz-teşvik kompleksi (APC / C)-bağımlı ubikuitinasyon ve burada siklin B. sonraki yıkım, biz, darbe-kovalamaca etiketleme sonrasında, bir sistem kurulmuş tüm hücre popülasyonlarında siklin B proteoliz izleme sağlar ve tetiklenir anafaz için metafaz mitotik geçiş noktasından müdahale tespitini kolaylaştırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre bölünmesi sırasında iki yavru hücre arasında kromozomların eşit dağılımı genetik değişmezlik 1 garanti için bir ön koşuldur. Kromozom ayrılması sırasında yanlışlıklar malignite bir işaretidir ve ilerleyici bir hastalık 2-4 ile ilişkilidir. Mili montaj noktası (SAC) her kromozom mitotik iğ 1. istikrarlı bir bipolar eki kurmuştur kadar geri metafaz hücrelere tutan bir mitoz gözetim mekanizmadır. SAC aktive müdahale ederek işlevini uygular APC / C securin ve siklin B proteoliz ve böylece kromozom ayırma ve mitotik çıkış engellemek için subunit Cdc20. Kromozomların yanlış eki SAC sinyalizasyon susturulmalarını engeller ve problemi kromozom missegregation, anöploidi ve malign büyümeleri 1 önlemek için çözülünceye kadar APC / C Cdc20 arasında devam inhibisyonu neden olur.

I ele çalışmaların çoğuAPC / C-bağımlı proteoliz üzerine uygunsuz kromozomal eki nfluence mikrotübüle kromozomal eki ile etkileşime ilaçlar depolimerizasyon veya mikrotübül-dengeleyici kullanarak mili bozulması yararlandı. Mikrotübül kinetiği müdahale ulaşım ve kritik düzenleyiciler lokalizasyonu etkileyebileceğinden, bu prosedürler suni etkileri 5 inducing bir risk taşıyor.

SAC mitoz sırasında APC / siklin B C-bağımlı proteoliz müdahale nasıl çalışma için hücre popülasyonlarının soğukkanlı, biz izin bir histon H2-GFP-tabanlı sistem kurulmuş metafaz mitotik kromozom uyumuna ve siklin B 6 proteolizin eşzamanlı izleme .

Proteolitik profilleri tasvir etmek için, bir C-terminal parçası SNAP 6 (Şekil 1) ile bir kimerik siklin B raportör molekül üretilir. Kendi kendine etiketleme reaksiyonunda, SNAP-parçası ile kovalent bağ oluşturabilenalkylguanine taşıyıcılar (SNAP substrat) 7,8 (Şekil 1). SNAP yüzey molekülleri kolayca kullanılabilir ve değişik florokromlar geniş bir yelpaze taşırlar. Kimerik siklin B-SNAP molekülleri büyüme ortamı 7 (Şekil 1) zar-SNAP geçirgen alt tabakanın ilavesinden sonra etiketli hale gelir. Etiketleme reaksiyondan sonra, siklin B-SNAP floresans şiddetinin bir darbe-kovalamaca reaksiyon benzeri şekilde ve floresan yoğunlukları siklin B bozulması 6 (Şekil 1) düzeylerini yansıtacak düşer. Bizim sisteme paralel hücreleri (veya birkaç hücre popülasyonlarının) çok sayıda mitotik APC / C bağımlı proteolizin izlenmesini kolaylaştırır. Böylece, sistem aracıları / geçiş anafaz için metafaz de proteolitik aktiviteyi bozar edebiliyoruz küçük moleküller belirlemek için değerli bir araç olabilir. Ayrıca, mitoz sırasında siklin B sentezi gibi son zamanlarda önemli bir mechanis olarak öne sürülmüştürstabil siklin B ekspresyon düzeyleri 9,10 tutarak farelerde ve insanlarda bir mitoz blok teşvik m, bu sistem bize dengeli bir denge 6 bir unsuru olarak siklin B proteoliz analiz sağladı.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mikroskop Odası Slaytlar üzerindeki U2OS tabanlı Siklin B-SNAP Reporter Hücreleri (Klon 11 Hücreler 6) Tohum

  1. En az 48 saat süreyle günlük aşamada uyumsuz büyümeye izin verildi subconfluent SNAP muhabiri hücreleri Trypsinize.
  2. 8 sıra mikroskop odaları (hücre sabiti dağıtımı) ile çalışma.

Mikroskop bölmesinin bütün yüzey, santrifüj 10,000 hücreler boyunca sabit bir dağıtım az 8 iyi mikroskop odaları üzerine hücre tohumlama ve kırmızı fenol içermeyen normal büyüme ortamının 350 ul (% 10 fetal bovin serumu, penisilin / streptomisin ile takviye içinde tekrar süspansiyon için ve sodyum piruvat). Mikroskop odası (Şekil 2) hücre süspansiyonu aktarın.

8 sıra mikroskop odaları (merkezi maksimum hücre yoğunluğu) ile çalışma.

Mikroskop chamb merkezinde daha yüksek bir yoğunlukta hücreler tohumlanması içiner, fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme orta 300 ul odasına yerleştirin. Mikroskop odası merkezi (Şekil 2) dikkatlice 5.000 hücreleri ekleyin.

96 özel optik levhalar (hücre sabiti dağıtımı) ile çalışma.

De, tüm yüzeyi boyunca sürekli bir dağılımı 96 kuyucuğu üzerine hücrelerin tohumlama için 5.000 hücreler santrifüj ve fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme orta 300 ul tekrar süspansiyon haline getirin. 96 çukurlu bir levha için hücre süspansiyonu aktarın. Gerekli hücre içeren kuyu toplam sayısına bağlı olarak, hücre sayısı ve süspansiyon ortamının toplam hacmi (Şekil 2) ayarlayın.

96 özel optik levhalar (merkezinde maksimum hücre yoğunluğu) ile çalışma.

96 plakalar üzerine hücre ekimi için, dikkatli bir smal fenol red-free normal büyüme orta 15 ul 1.500 hücreleri ekleyiniyi merkezi (Şekil 2) ile hücre büyümesini sınırlandıran elde etmek için her bir kuyucuğa merkezine l damla.

  1. Çekirdekli hücreleri standart hücre kültür koşullarında (37 ° C,% 100 nem,% 5 CO2) altında en az 18 saat süreyle büyümesine izin verin.

2. SNAP Substrat ile Muhabir Hücrelerin boyanması

  1. Öncesinde boyama işlemi başına 30 dk fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme orta alikotları 37 kadar ısınmasını bekleyin ° C
  2. SNAP yüzey işlemesini kolaylaştırmak için (bizim durumumuzda TMR Star) -20 ° C'de saklanabilir 400 mcM stok solüsyonu, bir konsantrasyon elde etmek DMSO TMR Yıldızlı çözülür
  3. Boyamadan önce, 1 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için etiketleme fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C) 200 ul içinde TMR Yıldız stok çözeltinin 0.5 ul seyreltin.
  4. Uyumsuz büyüyen hücrelerin normal büyüme ortamı çıkarın ve l inkübestandart kültür koşulları altında 25 dakika boyunca ortam abeling.
  5. Fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C) ile orta ve yıkama hücreleri dört kez etiketleme çıkarın. 30 dakika için fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C) 300 ul hücre inkübe edin. Önce mikroskop taşımadan rezidüel ilişkisiz SNAP substrat kaldırmak için taze fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C), orta değiştirin.
  6. Bir önceden ısıtılmış bir styrofoam kutu içinde mikroskop için Aktarım hücreleri (37 ° C) sıcaklık değişimi en aza indirgemek için ısı blok.

3. Floresan Yoğunluğu Ölçümü

  1. Önceki analiz için iki saat ° C kuru modunda istenilen sıcaklık bütün bileşenleri ile tüm mikroskop getirmek için 37 iklim odasının hava sıcaklığını ayarlamak. Ön ısıtma nem ayarlamadan önce mikroskop yoğuşma ve sonraki hasarı önlemek için önemlidir.
  2. Hava nemi t ayarlayıno% 60 ve analiz başlangıç ​​önce CO 2-5%.
  3. Tarama ^ R Toplama yazılımını başlatın ve standart ayarlar (bkz. Tablo 1) tanımlayabilirsiniz.
  4. Analiz edilecek kuyuların konumlarını tanımlayın.
  5. Dt (iktisap çevrim süresi) ve iktisap döngüleri mutlak sayısını tanımlayın.
  6. Kuyuların daha yüksek bir dizi analizi istenirse, donanım otofokus seçmek, aksi halde tek başına yazılım otofokus kullanmak için yeterlidir.
  7. Edinimi başlatın ve ilk iki satın alma döngüsü için denetleyecek. Filtre değiştirilir ve buna karşılık gelen görüntü TMR Yıldız (Şekil 3) elde edilir önce mikroskop bu kanal içinde bir birinci görüntü sonraki toplama ile, histon H2-GFP sinyali üzerine odaklanacaktır. Bu tekrar sonraki döngüsü tekrarlanmadan önce, iyi içinde ve incelenmesi gereken kuyuların her biri için tüm pozisyonlar için tekrarlanır.

4. Proteolitik Profiller u analiziTarama ^ R şarkı

  1. Tarama ^ R Analiz yazılımını başlatın ve hücre çekirdekleri ile görüntüleri analiz olarak sinyal şiddeti ve komşu hücreleri ayıran yardımcı olmak için bir dönüm algoritmasına dayanan bir eşik kullanarak, ana nesne olarak tanımlanan histon H2-GFP, gözlemlenmiştir. Sitoplazma ile bir çekirdek içeren bir subobject TMRstar analiz için oluşturulmalıdır. (Ana nesne Önemli özellikleri X ve Y konumlarını, saat ve maksimum ve ana nesne ve TMRstar altnesnesi için alanına bölünmesiyle toplam yoğunluğunun GFP yoğunluklarını demek.) Bu analiz işlem büyük veri nedeniyle birkaç saat sürebilir miktarları.
  2. Analiz ana nesneleri (Şekil 4) atanan zamanla altnesnesi ortalama TMR Yıldızlı floresan yoğunluğu (hücre izleri), görselleştirmek modu iz değiştirin. Incelenmesi gereken hücre sayısı en az 140 devir süren bu ölçümlere gating ile ve H2-GFP yüksek bir maksimum yoğunluğu ile daralmış olabilir. Lookinghücrelerin daha fazla sayıda bir ilk temsilcisi ve objektif bakış (Şekil 4) sağlar.
  3. Tek hücre düzeyinde (Şekil 5A) aynı anda histon H2-GFP ve TMR Yıldızlı floresans görselleştirmek için ilgi bir hücre iz seçin.
  4. Ilgi bir hücre üzerinde sağ klik kullanarak ve histon H2-GFP ve siklin B-SNAP her zaman noktası için TMR Star illüstrasyon için verilebilir bir resim galerisi oluşturmak.
  5. Tarama ^ R Analiz yazılımı ve kapısı ilgi hücresi X vs Y nokta arsa (Şekil 5B) temsil edilmektedir bölgenin nüfusu moduna değiştirin.
  6. Geçitli bölgeye yeni bir nokta çizim penceresinde Uygula ve zamanla TMR Yıldızlı floresan yoğunluğu (Şekil 5C) demek görselleştirmek.
  7. Daha fazla hesaplama için Microsoft Excel İhracat verileri (zaman ve floresan yoğunluğu).

5. Temsilcisi Sonuçlar

Incirure 5D ve 5E bir hücre bir TMR Yıldız floresans yoğunluk eğrisi ile temsil siklin B kinetiği, Resmedeceğiniz kromozomal kayma belirtileri (Şekil 5E) olmadan normal mitoz yoluyla ilerler. Hücre prometafaz 6 girdiğinde izomorf penceresi (diyagramdaki parlak bölge) ulaşılana kadar nükleer zarf dökümü (NEBD gibi kırmızı üçgen ile gösterilir) takiben sitoplazma sıkıştırma üzerine, TMR Yıldızlı floresan yoğunluğu ani bir artış gösterir. Floresan yoğunluğu profaz ve metafaz hücre aracılığıyla ilerledikçe sürece istikrarlı bir düzeyde kalır ve daha sonra tüm kromozomlar (Şekil 5D ve 5E) istikrarlı bir metafaz plakası kurduk sonra hızla düşmeye başlar. Bu düşüş anafaz (eğri üzerinde mavi nokta) sırasında kromozom ayırma önce gelir. Geç mitoz yılında kromatin decondense başlar (mavi çubuk) ve floresan yoğunluğu eğrisi yaklaştığında ise hücre interfaz morfolojisi benimsermitoz (Şekil 5D ve 5E) önce plato daha düşüktür plato.

Otofokus ayarları Histon H2-GFP (ana nesne toplama ayarları) TMR Yıldız ile etiketlenmiş Siklin B-SNAP
(Satın alma ayarları) 		Toplama döngü süresi Tekrarlar
Kaba otofokus + / -39 mikron 24 Katmanlar
Güzel otofokus
+ / -5.4 Mikron 14 Katmanlar 		GFP filtresi ayarlayın:
Pozlama süresi: 100 ms
Işık yoğunluğu: 25% 		TRITC filtre ayarlayın:
Pozlama süresi: 150 ms
Işık yoğunluğu: 33.3% 		2-5 dk.
GFP filtresi ayarlayın:
Pozlama süresi: 12 ms
Işık yoğunluğu:% 12.5 		Yukarı devam analiz 48 saat (% 60 daha az hava nemi ile sınırlı)

Tablo 1. Siklin B proteolizin analizi için kullanılan standart olarak ayarlar. Histon H2-GFP siklin B-SNAP floresans yoğunluğunu ölçülmesi için odak düzlem tanımlamak için bir yapı referans olarak kullanılmıştır. Birikimli fototoksisite önlemek için görüntü alma ayarlara göre odaklama işlemi sırasında düşük ışık yoğunluğu vardır.

figure-protocol-1
Şekil 1. Endojen protein benzer çözünme özelliklerine sahip bir kimerik siklin B türevinin ifade yoluyla siklin B proteolizin ölçüm şematik. Darbe-kovalamaca etiketleme sonra floresan yoğunluğunda azalma APC / C-aktivitesinin bir ölçüsüdür.

figure-protocol-2
Şekil 2. 8 kuyu slaytlar veya 96 kuyucuğu üzerindeki hücrelerin analizi. Düzenli dağılımıiyi bir yüzey üzerinde hücreler 300 ul nihai hacim içinde yeniden süspansiyon elde edilir ve tek tek bir veya birkaç sıra el ile analiz için tanımlanan ise tavsiye edilir. Merkezi bölge içinde hücrelerin zenginleştirilmesi önceden doldurulmuş ya da hazneyi merkezine hücrelerin eklenmesi ile elde edilir. Bu tekniği farklı kuyularda otomatik görüntü elde etme durumunda tavsiye edilir.

figure-protocol-3
Şekil 3,. Veri toplama sırası. Histon H2-GFP A) Algılama mitoz sırasında kromozom uyum odak düzlemi tanımı ve izlenmesi için kullanılır. B) TMR Yıldız floresans şiddetinin Floresan yoğunluğu siklin B-SNAP etiketli darbe takibin mutlak miktarı için bir ölçüdür.

figure-protocol-4
Şekil 4. Ortalama TMR Yıldız Temsilcisi Tarama ^ R Analiz yazılım tabanlı tasvirizamanla floresan yoğunlukları (alanına bölünmesiyle toplam TMRstar yoğunluğu). temsili bir hücre trace (mavi) seçimi. Ilgili görüntüleri (sağda gösterildiği gibi) eş zamanlı görselleştirme izin histon H2-GFP (yeşil) ve siklin B-SNAP (kırmızı). büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-protocol-5
Şekil 5. A + B) XY-nokta arsa üzerinde bir ilgi hücre temsil nokta yolluk örneği. C) zamanla ortalama TMRstar floresan yoğunluğu (alan tarafından ayrılan toplam TMRstar yoğunluğu) Görselleştirme nokta arsa kullanarak. D + E), Microsoft Excel'de oluşturulmuş gibi NEBD (nükleer zarf dökümü) ve kromatin yoğunlaşması (mavi bar) arasında izomorf penceresi (diyagramda brigher alanı) siklin B-SNAP Temsilcisi floresans yoğunluk eğrisi. Anafaz t gösterilireğri üzerinde o mavi nokta. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Film 1. tamamlayıcı filmi görmek için buraya tıklayın .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz burada siklin B proteoliz ve kromozom uyum eşzamanlı izleme kolaylaştıran bir canlı hücre görüntüleme tabanlı bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yaklaşım mitotik kontrol çalışması tek hücre düzeyinde hücre popülasyonu soğukkanlı sağlar. Siklin B degradasyon eğrileri APC / C aktivitesini doğrudan içten kolaylaştırmak ve böylece dolaylı SAC 6 durumunu yansıtmaktadır.

Bu yaklaşım, olsa Tarama ^ R yazılım dayalı kurulan, kolayca herhangi bir karşılaştırılabilir mikroskop istasyonu çoğaltı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz pLPCX-Histon H2-GFP plazmid sağlamak için S. Taylor minnettarız. Biz sürekli destek için R. Mertelsmann ederim. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ürünün Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
Reporter hücre hattı üretilen in-house olarak 6 tarif 11 muhabir hücreler klonu
(U2Os bazlı siklin B-SNAP eksprese eden hücreler)
Retroviral siklin B-SNAP ifade vektörü üretilen in-house olarak 6 tarif pLNCX2-siklin B mut5-SNAP
Phenolred içermeyen DMEM Gibco 21063-029 FCS, sodyum piruvat, penisilin / Streptococcus bil takviyesi gereklidir
SNAP-Cell TMR-Yıldız New England Biolabs S9105S DMSO içinde Stok çözeltisi 400 uM
Özel Opstics Tabak iyi 96 Costar 3720
μ-Slayt 8 kuyu, ibiTreat Ibidi 80826
Mikroskopi ünitesi Olimpos İklim odası ile IX-81 ters mikroskop
Nesnel Olimpos UPLSAPO 20x objektif (NA 0.75)
Toplama yazılımı Olimpos Tarama ^ R Toplama yazılımı (v.2.2.09)
Analiz yazılımı Olimpos Tarama ^ R Analiz yazılımı (v.1.2.0.6)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
  2. Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
  3. Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
  4. Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
  5. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
  6. Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
  7. Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
  8. Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
  9. Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
  10. Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
  11. Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Siklin B ProteoliziTek H cre AnaliziHiston H2 GFPSNAP Raporlay c SistemiTMR Star EtiketlemeMitotik k zlemeAPC C AktivitesiKromozom HizalanmasFloresan iddeti TakibiMetafaz Anafaz Ge i i

İlgili makaleler