Yöntem makalesi

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

DOI:

10.3791/4282

⸱

23 Nisan 2013

 ,  ,  , 
1Research Service, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Department of Urology, The David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles , 3GeneFluidics, 4Division of Infectious Diseases, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 5Department of Microbiology, Immunology & Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz hızlı bakteri bulunması ve belirlenmesi için bir elektrokimyasal sensör test yöntem açıklanmaktadır. Tahlil, ribozomal RNA (rRNA) türe özgü dizileri için DNA oligonükleotid probları yakalama fonksiyonuna sahip bir sensör dizisi içerir. Yakalama prob ve yaban turpu peroksidaz bağlı DNA oligonükleotid dedektör prob ile hedef rRNA Sandwich melezleme ölçülebilir bir amperometrik akım üretir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektro kimyasal sensörler yaygın olarak kan şekeri hızlı ve doğru bir ölçüm için kullanılan ve bir analitler çeşitli saptanması için adapte edilebilir. Elektrokimyasal sensörler yararlı bir elektrik sinyali bir biyolojik tanıma olay iletici çalışır. Sinyal transdüksiyonu bir amperometrik elektrot bir biçimde bir redoks enzim aktivitesi bağlanmasıyla gerçekleşir. Sensör özgüllük doğal bir enzimin özelliği, bir glikoz sensörü durumunda glukoz oksidaz veya enzim ve bir antikor veya prob arasındaki bağlantı bir ürün ya da bir.

Burada, doğrudan tespit etmek ve bakteri belirlemek için bir elektrokimyasal sensör test yöntem açıklanmaktadır. Her durumda, burada tarif edilen sondalar DNA oligonükleotitleri vardır. Bu yöntem, hedef RNA (rRNA) ile yakalama ve dedektör probları sandviç hibridizasyona dayanır. Dedektör prob saat bağlı iken yakalama prob, sensör yüzeyine tutturulduğuorseradish peroksidaz (HRP). Örneğin 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) gibi bir alt-tabaka yüzeyine bağlı yakalama hedef dedektörlü kompleksleri ile bir elektrot ilave edildiğinde, alt tabaka, HRP ile oksitlenir ve çalışan elektrot ile azaltılır. Elektrot akım üreten elektrottan HRP alt tabaka ile elektronların mekik Bu redoks döngüsü ile sonuçlanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel saptanması ve tanımlanması için bir hedef molekülü olarak rRNA kullanılması bir takım avantajları bulunmaktadır. Bakteriyel hücrelerde rRNA bolluğu hedef amplifikasyon 1 için gerek kalmadan mililitre başına 250 bakteri gibi düşük bir duyarlılık sınırı için içerir. Bakteriyel rRNA DNA probları ile hibridizasyon için erişilebilir benzersiz türe özgü dizileri içerir. Sonuç olarak, elektrokimyasal sensör dizisi her bir sensör farklı bir türe spesifik yakalama prob ile işlevlendirilmektedir bilinmeyen bir bakteri, tespit etmek için kullanılabilir. Pozitif kontrol sensörleri "köprü" yakalama ve dedektör probları dahili kalibrasyon sinyali oluşturmak için bir sentetik oligonükleotid hedef için dahil edilmelidir.

Elektrokimyasal sensörler temel ve yorumsal araştırmalar geniş bir uygulama yelpazesi var. Örneğin, tahlil, tam E. etkisini ölçmek için burada açıklanan kullanılmıştır rrn üzerinde coli büyüme aşamasındaBakteriyel fizyolojisi 2 ile ilgilenen araştırmacılara büyük ilgi olan A ve ön rRNA kopya sayıları,. Elektrokimyasal sensör tahlilin hassasiyetini gürültü oranı sinyal ile belirlenir. Sinyal güçlendirme ve gürültü azaltma yöntemleri çeşitli araştırılmıştır. Biz sensör yüzeyinin kimyası geliştirmek dedektör prob ve / veya HRP enzimin spesifik olmayan bağlanma azaltmak için önemli olduğunu bulmak. Özellikle, alkanedithiols ve mercaptohexanol oluşan karışık bir hedef tek tabaka melezleştirme 3 için yakalama probunun yönelik koruyarak daha tam olarak elektrot yüzeyi kapsayan arka planı azaltmak için tespit edilmiştir. Bu yüzey kimyası tedaviler karmaşık biyolojik örnekler içeren deneyleri için özellikle önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Elektrokimyasal Sensörler işlevsellik

  1. 300 uM 0.05 uM'lik bir konsantrasyonda thiolated yakalama prob hazırlamak 1,6-hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 0.3 M NaCI, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, karanlıkta, 1 mM EDTA ve inkübe . HDT ile thiolated yakalama probunun İnkübasyon daha tutarlı sonuçlar ile sonuçlanan, yakalama prob üzerindeki tiyol grubu azalır sağlar.
  2. Nem ve / veya partikülleri çıkarmak için 5 saniye boyunca açık altın 16 dizi sensör çipi (ler), bir nitrojen akışı uygulanır.
  3. Sensör dizisi tüm 16 sensörlerin çalışma elektrot için HDT-thiolated yakalama prob karışımı 6 ul uygulayın ve 4 ° C gecede de kapalı bir Petri kabındaki sensör çip (ler) saklayın. Thiolated yakalama probları çıplak altın elektrot doğrudan bağlamak ve HDT yakalama probları overpacking önlemek ve hedef ile melezleme teşvik uzun bir uyum içinde tutmak için hareket eder.
  4. günün ardından, 5 saniye boyunca bir nitrojen akışı altında 2-3 saniye ve kuru için deiyonize H2O sensör çipi yıkayın.
  5. 10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM tüm sensörler 16 ve 50 dakika süre ile inkübe çalışan elektrot ve 6-merkapto-1-hekzanol (MCH) 6 ul uygulanır. Bu ve daha sonraki tüm sensör çipi inkübasyonlar oda sıcaklığında kapalı bir Petri kabındaki gerçekleştirilir. MCH thiolated yakalama prob veya HDT elektrot yüzeyinde bulunan olmayan herhangi bir boşlukları doldurma, engelleyici bir ajan olarak hareket eder.

2. Numune Hazırlama

  1. 5 dakika boyunca 16.000 xg bir mikrosantrifüj tüp ve santrifüj büyüme log fazı (≈ 0.1 OD 600) bakteri kültürü 1 ml aktarın. Kültür süpernatantı. Bakteriyel pelet hemen işleme veya -80 ° C daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir.
  2. İyice bot pipet uygulanarak, 1 M NaOH içinde 10 ul bakteriyel pelletinimikrosantrifüj tüp ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme tom. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında süspansiyona inkübe edin.
  3. , 1 M fosfat tampon, pH 7.2 50 ul ekleyerek bir floresein-değiştirilmiş detektör probu% 2.5 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 0.25 mM ile bakteriyel lizat nötralize eder. Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile nötralize lizat inkübe edin. Floresein-modifiye dedektörü problar bakteriyel rRNA hedef molekülü ile melezleşir.

3. Elektrokimyasal sensör olup Deneyi

  1. 5 saniye boyunca bir nitrojen akışı altında 2-3 saniye ve kuru için deiyonize H2O ile sensör çip MCH yıkayın.
  2. 14 sensörlerin her birinin çalışan elektrot ile nötralize edilmiş bakteriyel lizat 4 ul uygulayın ve 15 dakika boyunca inkübe edilir. Hedef-dedektör prob kompleksleri hareketsiz thiolated yakalama probları için melezleşme.
  3. % 2.5 BSA ve 0.25 ve ihtiva eden, 1 M fosfat tampon, pH 7.2 'de, 1 nM oligonükleotid köprü 4 ul uygulayınmu, M floresan-modifiye dedektör prob 2 pozitif kontrol sensörleri (sinyal normalleşmesi için kullanılır) ve 15 dakika inkübe.
  4. 5 saniye boyunca bir nitrojen akışı altında 2-3 saniye ve kuru için deiyonize H2O sensör çipi yıkayın.
  5. , 1 M fosfat tampon, pH 7.2 'de 0.5 U / ml anti-Floresein-HRP 4 ul geçerli olan tüm 16 sensörlerinin Çalışan elektrot için% 0.5 kazein içeren ve 15 dakika boyunca inkübe edilir. Anti-Floresein-HRP hareketsizleştirilmiş floresein-değiştirilmiş dedektör probları bağlanır.
  6. 5 saniye boyunca bir nitrojen akışı altında 2-3 saniye ve kuru için deiyonize H2O sensör çipi yıkayın.
  7. Sensör çipi monte içine sensör çipi ve yük yüzeyi ile bir etiket de filmin uygulanır. Pipet 50 Tüm 16 sensörler üzerine TMB substrat ul ve sensör çip montaj kapatın.
  8. Helios Chip Reader kullanan tüm 16 sensörler için amperometri ve dönüşümlü voltametri ölçümleri alın. Amperometrik mevcut TMB r oranı ile orantılıdırSensör yüzeyinde eduction (bkz. Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu bir sandviç ELISA ile benzer şekilde yapılandırılmıştır bir elektrokimyasal analiz tarif eder. Şekil 1, bu detektör probu üzerinde 3 'floresein bağlantısına bağlamak Anti-florosin antikor fragmanlarına HRP konjuge tarafından katalize edilen bir redoks reaksiyonu tarafından geliştirilen yakalama ve dedektör probları ile hedef RNA (rRNA) hibridizasyon gösterilmiştir. Test hassasiyeti önemli bir bileşeni altın elektrot yüzeyi kimyası olduğunu. Biz thiolated yakalama problar mercaptohexanol ve hexanedith...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan elektrokimyasal sensör tahlilinde nükleik asit hedef hızlı tespit sağlar. Duyarlılık ve özgüllük da uzunluğu ve yakalama ve dedektör probları GC içeriğine bağlıdır hedef prob hibridizasyon, serbest enerji kısmen bağlıdır. Biz, tipik olarak ortam sıcaklığında (~ 20 ° C) 5, 6, hibridizasyon adımları. Bununla birlikte, melezleme adımları (3.2 ve 3.3) da chip içeren kapalı bir odaya yerleştirilir ise, bir hibridizasyon fırın içinde daha yüksek bir sıcaklıkta gerçekleştirilir buharlaştırılarak

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar tarif edilen yöntemler ile ilgili patentlere mucitler vardır. Bu patentlerden biri Qvella Corporation lisanslı edilmiştir. BMC ve DAH Qvella Corporation sermaye ilgi var. VG elektrokimyasal sensör dizisi çip üreticisi GeneFluidics Başkanı, çip montaj, ve bu yazıda anlatılan çip okuyucu.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü'nden İşbirliği Anlaşması Ödülü AI075565 (DAH için) tarafından ve Wendy ve Pediatrik Üroloji Araştırma Mükemmellik Ken Ruby Fonu tarafından desteklenmiştir. BMC Judith ve Çocuk Ürolojisi Robert Winston başkanıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6-merkapto-1-heksanol (MCH)Sigma451088Oda sıcaklığında saklayın
1,6-heksanedithiol (HDT)SigmaH-12005Oda sıcaklığında saklayın
Tiyollü yakalama problarıOperonN/A100 & mu'da saklayın; -20 &°C'de 0,1x TE'de M; C
Floresein ile modifiye edilmiş dedektör problarıOperonN/A100 & mu'da saklayın; -20 &°C'de 0,1x TE'de M; C
Köprüleme OligonükleotidOperonN/A100 & mu'da mağaza; -20 &°C'de 0,1x TE'de M; C
Anti-Floresein-HRP, Fab parçalarıRoche11 426 346 9104 & deg'de saklayın; C
Helios Çip OkuyucuGeneFluidicsGFR-2009
Sensör Çip MontajıGeneFluidicsGFR-003
Film kuyusu çıkartmasıGeneFluidicsSensör çipleri ile birlikte gönderilir
Çıplak altın 16 sensör dizisi çipleri GeneFluidicsSC1000-16X-BOda sıcaklığında %100 N2 içinde saklayın
Sığır Serumu Albümini SigmaA7906Mağazası 4 > C
1M Fosfat Tamponu, pH 7.2 0.35M NaH2< / sub>PO < sub>4< / sub>, 0.65M K < alt > 2 < / sub > HPO< sub > 4 < / sub>, pH 7.2'ye ayarlanmış
Pierce37528'deBloker Kazein Eşit hacimde 1M Fosfat Tamponu ile seyreltin, pH 7.2, 4 ° C'de saklayın; C
Tablo 1. Reaktifler ve Ekipmanlar.
PBS

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
  2. Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
  3. Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
  4. Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
  5. Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
  6. Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
  7. Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
  8. Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
  9. Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
  10. Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
  11. Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
  12. Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ribozomal RNASandvi HibritlemeYaban Horseradish PeroksidazTMB SubstratSens r Dizisi ipiYakalama ProbuDedekt r ProbuFloresein Konjuge

İlgili makaleler