Yöntem makalesi

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması

24.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50245

⸱

15 Mart 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, McKnight Brain Institute, University of Florida , 2Department of Entomology and Nematology, University of Florida , 3Genetics Institute, Department of Molecular Genetics and Microbiology, University of Florida , 4McKnight Brain Institute, Department of Neuroscience, Genetics Institute, Center for Translational Research on Neurodegenerative Diseases, and Center for Movement Disorders and Neurorestoration, University of Florida

Bu makalede

Özet

Biz burada mRNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması için işlemler ve metabolitlerin tarif Drosophila Başları. Biz daha iyi nöronal dejenerasyon yatan hücresel tedirginlikler anlamak için bu teknikleri uyguluyoruz. Bu metodolojileri kolayca ölçekli ve diğer "omic" projeler için adapte edilebilir.

Özet

Son on yıl için, biz bir model organizma olarak Drosophila kullanarak nöronal dejenerasyon moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamaya çalıştık. Meyve sinekleri bariz deneysel avantaj sağlasa da, nörodejeneratif hastalıklar üzerine araştırmalar çoğunlukla genetik etkileşim, histoloji, immünofloresan ve protein biyokimyası gibi geleneksel teknikleri, güvendi. Bu teknikler, iyi tanımlanmış biyolojik problemlere tek genlerin rolü ayrıntılı bir anlayışa yol mekanik, hipotez odaklı çalışmalar için geçerlidir. Ancak, nörodejeneratif hastalıklar, oldukça karmaşık ve zaman içinde çok sayıda hücresel organelleri ve süreçleri etkiler. Yeni teknolojiler ve omics çağın gelişi kompleks hastalıkların altında yatan küresel hücresel tedirginlikler anlamak için eşsiz bir fırsat sunuyor. Böyle Drosophila gibi esnek model organizmalar nedeniyle güçlü annot bu yeni teknolojilere adapte için idealdirtirme ve yüksek izlenebilirlik kazandırır. Bu küçük hayvanlar ile bir meydan okuma olsa da, bu tür sinek beyin gibi son derece ilgili dokulara yeterli bilgi moleküllerin (DNA, mRNA, protein, metabolitlerinin) arınma. Diğer zorluklar deneysel replicate için sinekler çok sayıda toplama (istatistik sağlamlığı için kritik) ve yüksek-kaliteli biyolojik maddenin saflaştırılması için tutarlı yöntemler geliştirmek oluşur. Burada, gen ekspresyonu ve metabolizma küresel değişime nörodejeneratif hastalıklara katkıda anlamak sinek başkanları ve transkript ekstraksiyon ve metabolitleri binlerce toplamak için prosedürler açıklanmaktadır. Bu prosedürler, kolaylıkla büyütülebilir ve hastalık ile proteomik ve epigenomic katkı çalışma uygulanabilir.

Giriş

Geçen yüzyılda, Drosophila en önemlisi gelişiminde derin biyolojik soruları, hücre biyolojisi, genetik ve nörobiyoloji 1 araştırmak için paha biçilmez bir laboratuar aracı olduğu kanıtlanmıştır. Bu başarının nedeni meyve sinekleri, manipüle sürekli genişleyen araç 18, 21, 31 için kolay olduğunu, ve yüksek kaliteli açıklama 26 ile nispeten basit bir genom sahip. Üç Nobel ödülü verilmesinin (1933, 1995, 2011) tarafından gösterildiği gibi sinek toplum içinde yaratıcılık ve sürekli yenilik ile birlikte bu teknik avantajları, geniş bilimsel katkı sağlamıştır. Daha yakın zamanlarda, Drosophila insan hastalıkları, öncelikle gelişimsel bozukluklar, doğuştan gelen bağışıklık, kanser ve nörodejeneratif 2 eğitim için uygun bir model olarak ortaya çıkmıştır. Biz özellikle nörodejeneratif hastalıkların hücresel ve moleküler temeli açığa ilgilendi. Bu karmaşık ve çeşitli işbirliğişulları anormal katlanmış protein grupları, muhtemelen çözünür oligomerler, bağlı olan ve bu nedenle, kolaylıkla sinekler modellenmiştir. Başlıca nörodejeneratif Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı da dahil olmak üzere, ve Huntington hastalığı, amiyotrofik lateral skleroz, çeşitli ataksilerde taupatiler, prion hastalığı ve diğer nadir hastalıkların tümü, son on beş yıl içinde 23 sinekler modellenmiştir. Fly laboratuvarları özellikle patojen proteinlerinin nörotoksisite karıştığı yeni genleri tanımlamak için Drosophila genetiği kahramanlık istismar ederek bu hastalıkların anlaşılması katkıda bulunmuşlardır. Nörotoksik kaskad ilgili yeni genler belirlendikten sonra, bunların etkileri genellikle anormal protein konformasyonlar miktarı ve türü değerlendirmek proteini dağılımı ve hücresel patoloji belirlemek için immünofloresan histolojisi dejenerasyon tespit desenleri gibi geleneksel yaklaşımlar, ve biyokimyasal analizleri ile analiz edilir . Son olarak, davranışdavranışsal analizi hastalık sonuçları işlevsel bir okuma olarak hizmet vermektedir. Bu köklü teknikleri oksidatif stres ve mitokondriyal disfonksiyon 13, transkripsiyonel disregülasyon 9, 27, 30, aberan aksonal transport ve sinaptik aktivite 14, anormal RNA dahil olmak üzere, hastalık sürecinin bir katkısı veya birkaç aday gen incelemek için istismar edilmiştir biyoloji 9, bozulmuş hücre sinyalizasyonu 29 ER dyshomeostasis 6, hücresel proteostasis 33, ve diğerleri 23 engellemiştir. Ancak, bu toksik proteinler birden birbirine yollar ile eşzamanlı uğratabilecek nasıl belli değil, ne bu değişikliklerin zamansal sırası ve patogenezi her yolun göreceli katkısı nedir. Yıllarca araştırma tek gen odaklanmış, insan ve hayvan modellerinde hem de hipotez odaklı yaklaşımlar neden hücresel mekanizmaların eksik, bilmece resmi yol açmıştırNörodejenerasyon. Bu toksik protein derlemeleri nöropatoloji hasara neden olan kesin mekanizmalar mevcut kötü anlayış hastalığı-modifiye eden tedavilerin geliştirilmesi için önemli bir sınırlamadır.

Şimdi bu patojen proteinler küresel hücresel tedirginlikler ikna nasıl anlamak için yeni yaklaşımların uygulama ilgilendi. Omics çağın gelişi yakın gelecekte etkili hastalık tedavilere yol açabilir sofistike yüksek verimli teknolojiler kullanarak karmaşık biyolojik problemlerin sondalama derin sağlar. Gen ekspresyonu (transkriptomik) çalışmalarında yüksek kaliteli açıklama en transkript tahmin edemeyeceği için birden fazla genomu dizilerinin tamamlanmasının ardından kuruldu. Transkript analizi (RNA-seq) için yeni nesil dizileme ve yeni uygulama, tarafsız bir yaklaşım, gelişmiş sayısal aralık ve daha düşük maliyetle 32 dahil mikroarrayler, kıyasla yeni avantajlar ve fırsatlar sundu.Biz daha dominant geçişli ataksi en sık görülen formu, Spinoserebellar ataksi tip 3 (SCA3) veya Machado-Joseph hastalığı anlamak için RNA-seq avantajlarını istismar etmek istiyorum. SCA3 Ataxin3 gen (ATXN3) 16 CAG trinükleotid genişleme nedeniyle dolu penetranslı bir monogenik, dominant bir hastalıktır. Bu mutasyon agrega için eğilimli yapar uzun bir poliglutamin (polyQ) parça ile Atxn3 protein üretimine yol açar. Mutant Atxn3 bütün hastalık ile ilgili düzensizliklerin için sorumlu SCA3 olarak nörotoksik ajan olduğu için, bu işlem, bu yeni yaklaşımlar omic uygulamak için ideal bir hastalıktır. Buna ek olarak, SCA3 sinekler 34 modellenmiştir erken nörodejeneratif hastalıklardan biridir.

Yerine koyarken RNA-seq sinek kafaları çok sayıda toplama prosedürleri, biz diğer bilgilendirme molekül küresel çalışmalar gerçekleştirmek için aynı malzeme kullanabilirsiniz anladım. Diğer gelişmekte olan discip arasındaçizgiler, proteomiks, epigenomics, ve metabolitler olmasa da sorunlar olmadan, daha önce elde olmayan bir derinlikte hücresel patolojinin inceleme sağlar. Gibi mRNA aksine, proteinlerin ve metabolitlerin kataloğu olası tüm yapıştırma varyantlar ve tüm normal ve patojenik metabolitlerin bile daha gizemli kökenli öngörmede artan zorluk nedeniyle şu anda oldukça eksiktir. Büyük çabalar halen birçok organizmalar ve hastalık koşullarında proteinlerin katalog devam etmektedir. Bunun için, biz böyle Drosophila gibi basit bir organizma, kullanarak SCA3 patogenezinde değişmiş metabolitlerin katkısı odaklanmak istedim. Bu özellikle yüksek tekrarlanabilirlik sağlar ve örnekleri 5, 24 yok.Komut nükleer manyetik rezonans son giriş (NMR), ile, nispeten yeni ve gelecek vaat eden bir alandır. Biz metabolit profil neurodegenerati karıştığı tespit biyolojik ve hastalık mekanizmalarına katkıda bulunabilir öneriyorumüzerine.

Bu omic projelerle önemli bir husus, büyük, üniforma örnekleri (200 sinek başları) yanı sıra hassas saflaştırma teknikleri Deneysel varyasyonun en aza indirmek için gerekli olmasıdır. Biz mikroarray'ler için önceden kullanılan ve aynı zamanda RNA-seq 12 için son zamanlarda kullanılan vardı prosedürleri takip sinekler toplamaya başladı. Ama biz yakında SCA3 yapıları misexpressing ile ilgili bir takım sorunlar karşılaştı. İlk olarak, analiz için hedef doku beynin bu deneyler 4, gal4 için bir sürücü seçmek zorunda kaldı. SCA3 bir beyin hastalığı olduğu için bariz bir seçim bir pan-nöral sürücüsü olacak. Biz bütün başları mRNA ve metabolitleri toplamak niyetinde beri Ancak, bu seçenek dokuların yapıları ifade ve olmayan ifade karışık malzeme üretecek. Tüm hücrelerin yapıları ifade homojen örnekleri oluşturmak için, biz bir zayıf ama her yerde sürücü hattı, daughterless (da)-gal4 kullanmaya karar verdi. INTERESzil gibi, ATXN3 20 de dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların, karışan genin birçok yerde ifade seçim yapma uygun, geniş bir dağılımına sahiptir. Patojenik Atxn3-78Q zamansız ifadesi gelişimi sırasında öldürücülüğü neden: Sonra, biz ikinci bir sorunla karşılaştı. Bu letalite atlamak için, biz gal4 19 geçici aktivasyon kontrol Gal80 ts dahil. Bu bize, en fazla 20 gün için deneysel sinekler, yaş onları toplamak onları dondurup, RNA (TRIzol) veya metabolit (metanol-kloroform) ekstraksiyon (Şekil 1) ya onların liyofilize başlarını işlemek için izin verdi. Biz zaten Transkriptomik ve metabolomik analizler için numune almak için bu protokolü kullandık, ancak bu tekniğin diğer açık uygulamalar (örneğin proteomik veya nöro-peptidomic analizleri) vardır.

Deneysel bakış: Bu protokollerin genel amacı consi toplama destek olmaktırtranskript ve metabolitleri çıkarılması için sinek kafası stent örnekleri. Bu işlemlerin belirli bir hedefe Atxn3-27Q ve Atxn3-78Q (non-patojenik ve patojenik deneysel kurgular) ifade sinekler gibi tek bir örnek 200 sinek başkanlarından oluşmaktadır lacZ (kontrol yapı) elde etmektir. Mevcut teknoloji tek hücre 28 dahil olmak üzere çok küçük örneklerinin analizine olanak rağmen, biz, böylece bize yüksek istatistiksel güven hastalık süreci ile ilişkili hücresel değişiklikleri belirlemek için izin, deneysel biyolojik ve teknik varyasyonu ortadan kaldırmak için 200 kafaları birleştirdiler. Bu yaklaşım dejenerasyonu sürüş en kritik yollar doğru bizi yönlendiren, nüfus tutarlı gen ekspresyonu sadece bu değişiklikleri tespit edecek şekilde tasarlanmıştır. Bu sinekler başkanları yaşa bağlı değişiklikleri merak yana, her genotip 1, 10 elde edilen ve yaşları 20 gün oldu.

Bu temel bir yönüKüresel analizler biyolojik üretimini destekleyen güçlü bir istatistiksel analiz çoğaltır olduğunu. Mikrodizileri ve RNA-seq ile Daha önceki üç kopya tecrübe içinde biyolojik örneklerin bu analiz verileri 11, 12 a ait kuvvetli istatistiksel önem verin göstermektedir. Biz her genotip ve zaman noktası için tek bir biyolojik tekrarında (Tecrübe 1) oluşturmak için nasıl) bölüm 1'de açıklanmaktadır. Bu prosedürler Reps 2 ve 3 oluşturmak için tekrarlanan, ya da her bir uzun Rep düzgün bir şekilde tanımlanması gibi, paralel olarak yapılabilir. Üç Reps ayarı, hedef olmasına rağmen dördüncü bir (hatta beşinci) Tecrübe yüksek bir veya daha fazla yaşlanma sırasında sinek düşük verim, kaybı ile ilgili sorunları veya malzeme kazara kaybı (sinekler, kafaları, veya RNA) kapsayacak şekilde tavsiye edilir örnekleri.

Biz on haçlar (harf AJ tarafından tanımlanan şişe) 200 kafaları / genotip / zaman noktasında elde etmek için yeterli nesil üretmedi bulundu. Extreme bakım şişeler çok sayıda tarihi, karışıklığı önlemek için uygulanması gerekenyeniden tek Rep (10 şişe x 3 genotipleri x 3 defa puan = 90 şişe) almaları gerekmektedir. Bunun için, biz genotip, zaman gelin ve şişe harfini kullanarak her bir şişe belirlenmiş. Örneğin, SCA3-27Q 20E 20 gün dinlendirilmelidir Atxn3-27Q ifade sinekler beşinci şişe (on) anlamına gelir. Döl eclose sonra, sineklerin benzersiz bir tanımlayıcı ile etiketlenmiş ayrı şişelerde muhafaza edilir.

Biz her bir örnek, şişe ve bir Excel elektronik toplama noktasına (sabahları ve akşamları) için elde edilen sinekler numaraları korunur. Biz önceki hesap letalite ve kaçakların içine almak donmaya vialde sinekler sayısını revize. Bu son sayıları itibaren 200 sinekler ekleyerek şişeleri kolayca böylece numunelerin korunması için katkıda dondurucu açmadan önce yer olabilir. Bir şişe toplanan sinekler sadece bir Rep kullanılabilir görüleceği gibi, her Reps çok sayıda şişe dan sinekleri içeren rağmen biz, biyolojik tekrarlı başına katkısı genişletirler. Biz saklıdıryedek örnekleri olarak, ya da diğer ilgili deneyler (western blot, qPCR) için, diğer Reps için planlanan Rep kullanılmamıştır şişeleri sinekler.

Protokol

1. Bir Replicate Yaratma ve Sinekler (DİKKAT, Sıvı Azot) Dondurma

Amaç: En az 200 genotip / zaman noktası başına kadın ve flash-friz toplayın.

  1. Genotiplerinin: Gal80 ts; da-gal4, daughterless düzenleyici bölge ve ısıya duyarlı Gal80 kontrolü altında gal4 zamansız ifade zorlanma. Bir kontrol çizgisi olarak, daha önce hiçbir zararlı etkilere neden olduğu gösterilmiştir edildiği, UAS-lacZ kullanılır. UAS-Atxn3-27Q ve UAS-Atxn3-78Q, non-patojenik ve patojenik Deneysel yapıları, sırasıyla. (Y, hs-Hid inşaat bakire kadınlarda daha verimli bir koleksiyon için önce kullanmış, ama biz çünkü Gal80 ts ile Y, hs-Hid tanıtmak için gereken ekstra zaman buna karşı karar olmuştur; Da-gal4 kromozomlar II ve III.)
  2. Şişeye 10 kadın, 5 erkek birleştirerek tüm stoklarımız açs aşırı kalabalık önlemek için. Tüm deneyler hazırlamak için kolay ve kene ile hızlı Drosophila büyüme ve düşük istila teşvik Caz Karışım sinek ortam, içinde gerçekleştirilmiştir.
  3. Her zaman noktası için da-gal4 erkek ve 100 UAS-Atxn3-78Q bakireler (tek UAS hattı örnek olarak kullanılacaktır); 50 Gal80 ts toplayın.
  4. Genotip / zaman noktası başına on haçlar olun. Karbon dioksit erkek ve kadınlar (CO 2) Uykusu / pad uyuştur. Sıra On bakire UAS-Atxn3-78Q sinekler (beş gün daha büyük) ve beş erkek Gal80 ts; Da-gal4 her büyük şişeye maya hamur (rehidrate kuru maya) ile çivili. Genotipleri, zaman noktalarında, ve şişe tanımlayıcılar (harfler AJ) ile şişe etiketleyin ve 25 ° C'de koyun
  5. 2 gün sonra, şişelerden yetişkin temizlemek kuru maya bir tutam ve optimal larva büyümeyi teşvik etmek için bir su fışkırtma ekleyin ve 18 ° C (Gal80 aktif, az şişeleri yerleştirmekBastırılmış gal4). Bu bakire kadın karşı döllenmiş türetilen döl deneysel değişkenlik tanıtmak olabilir, haçlar kopyalamayın. Ayrıca, her bir şişe döl bağımsız biyolojik çoğaltır (her şişe benzersiz döl üretir) temsil eder, ama transfer haçlar (kopya) (aynı genetik anayasaya ek döl) çoğaltır teknik olacaktır.
  6. Döl 18 ecloses zaman ° C, CO 2 uyuyan / ped uyutmak istenen genotiplerin bakireler toplamak ve (vialde 11:58 sinekler) ile küçük şişeler içine koyun. Şişe tanımlayıcı Etiket şişeleri. Havuz farklı şişe uçar etmeyin. 24 saat için 18 ° C'da geri şişeleri yerleştirin. Döl maksimize etmek için, ardışık sabahları ve akşamları toplamaya devam ediyor.
  7. Her flakon 18 ° C'de 24 saat tamamlandığında, 29 ° C (Gal80 inaktif, gal4 aktif) onları kaydırmak. Bu gün 0, deney başlangıç ​​noktası, tonların ifade başlatmak transgenlerin.
  8. Onlar gün 10 ve 20 ulaşana kadar sinekler her 2 günde bir şişeleri temizlemek için aktarın.
  9. Sinekler istenen yaş (1, 10, 20 gün) ulaştığında, küçük bir huni kullanarak ön-etiketli kriyotüplerin içine gıda şişeleri onları saymak ve aktarmak. Sinekler uyutmak etmeyin. Bankta şişeleri Invert.
  10. Sinekler transferi (stres) kurtarmak için izin 30 dakika bekleyin, sonra sıvı azot ve mağaza batırılarak şişeleri flaş dondurma bir ön etiketli, önceden soğutulmuş dondurucu kutusu hatırla:. Aynı sırayla sinekler dondurun onlar örnekleri arasında cryovial üniformalı harcanan zaman yapma, cryovial devredilmiştir.

2. Fly Başkanları Toplama ve Liyofilizasyon (Soğuk Oda, Pre-chill Tüm Ekipmanları, DİKKAT, Sıvı Azot ve Kuru Buz gerçekleştirin)

Amaç: Hızlı ayrılması, toplanması, ve doku dondurularak kurutma.

  1. Assemble elek (organları toplamak için üst odasında büyük örgü, kafaları toplamak için alt kanadı ikinci büyük, küçük parçalar toplamak için alt kapak) ve -80 ön-chill en az 30 dakika süreyle ° C.
  2. Aynı şişe kaynaklanan sinekler katkısını maksimize tarafından kriyotüplerin 200 sinekleri toplayın. Sabah veya akşam toplanan sinekler arasındaki farkları telafi etmek için, her numune özdeş bir sabah / akşam oranı (biz sabah 47% kullanılır /% 53 akşam) kullandığından emin Not:. İki 100-kafa örneklerinden oluşan RNA kombine edilebilir Daha sonra, tek bir tekrarında 200 sinekler eşdeğer elde edilmektedir.
  3. 5 dakika süreyle kuru buz parafilm (~ 9 x 14 cm) bir parça soğutun.
  4. Parafilm, bir seferde birkaç üzerine tam sinekler kriyotüplerin boşaltın; sayısı 100 sinekler ulaşıncaya kadar fırça ve kuru buz üzerinde bir cryovial mağaza kullanarak uçuyor.
  5. Sıvı azot içinde elek daldırın, üst chamb için 100 sinekler eklemeker. 1 dakika boyunca kuvvetlice elek çalkalayın. Yine sıvı azot içinde daldırma, ve 1 dakika süreyle çalkalanır.
  6. -80 Elek, bir mikrotüpteki alt kanadı kafaları toplamak ve yer açın ° C.
  7. , Mikrotüplerde açın parafilm içinde üstleri sarın ve küçük delikler olun.
  8. 2 gün için en az bir liyofilizerde numuneler.

3. Toplam RNA Ekstraksiyon ve mRNA Arıtma (RNaseZap olan tüm yüzeyler davranın; Sık Değiştir Eldiven)

Amaç: verimi maksimize etmek için doku homojen, toplam RNA ayıklamak, ve mRNA arındırmak.

  1. Dondurarak kurutma örnekleri çıkarın ve her mikrotüp üç küçük, steril, çelik taşlama topları ekleyin. Geno / Öğütücü Yeri; 1 dk için 1.500 vuruş / dak çalıştırın.
  2. , Tüpler açın 1 ml TRIzol ekleyin ve parafilm ile tüpler mühür. 1 dk Grind, gerekirse çelik topları çıkarmak için baş aşağı tüpler dokunun. 1 dk Grind.
  3. YapmaBu noktada tüp santrifüj (tüp kırılgan olacaktır). Yeni bir RNaz ücretsiz mikrotüp içine karışımı (çelik bilya hariç) aktarın. Pelet 4'e bir masa mikrosantrifüj içinde, hücre tortularını ° C'de 12,000 x g'de 10 dak.
  4. Yeni bir mikrotüp için süpernatant aktarın. 1-bromo-3-kloropropanla (BCP) 0,1 hacimleri ekleyin; 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalanır. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 4'e bir mikrosantrifüj içinde 12,000 ° döndürme x g 'de 15 dakika Not C: birçok RNA ekstraksiyonu protokolü, bu aşamada kloroform kullanımı; BCP faz ayrılması verimini artırmak suretiyle RNA verimi maksimuma çıkarmak üzere tasarlanmıştır.. Santrifüjleme aşaması esnasında 4 ° C'de numunelerin tutulması da faz ayrılması verimini artırmak ve sulu faz içine protein ve genomik DNA kirlenmesini azaltacaktır.
  5. Yeni bir mikrotüp için üst tabaka sulu aktarın. Buz-soğuk izopropanol 0.5 hacim ekleme yoluyla RNA çökelti, altı kez ters mil ilex. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 4 bir mikrosantrifüj içinde Spin ° C'de 10 dak 12.000 x at g.

Not: RNA geri kazanılması için ilave olarak, proteinler de TRIzol bir organik tabaka ve interfaz elde edilebilir, böylece her iki proteomikler ve transkriptomik analizler aynı numuneler üzerinde gerçekleştirilir. Bizim analizlerde bu adımı gerçekleştirmek vermedi, ancak TRIzol ekstraksiyon çözünür proteinlerin mükemmel bir temsilidir ve en arabellek / deterjan ekstraksiyonu daha membran ve nükleer proteinleri daha fazla temsil verir. Lee ve Lo 17 2-D jel ve LC-MS/MS gibi proteomik analizler için uygun TRIzol kullanarak proteinlerin ayıklamak için bir prosedür açıklanmaktadır.

  1. Süpernatantı. 1 ml buz-soğuk% 70 etanol (DEPC-işlenmiş su kullanımı), ve kısa bir vorteks ile karıştırın ekleyerek RNA yıkayın. 4'e bir mikrosantrifüj içinde döndürme ° C'de 12,000 x g hızında 5 dakika için.
  2. Süpernatantı. Hava kuru bir için pelett en az 15 dk. RNA pelet DEPC-su 80 ul ekleyin ve 10 dakika boyunca ° C 55 yerleştirin. 4 ° C'da gece boyunca bekletin.
  3. Nanodrop spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonu tayin edilir. Nm/280 260 nm 'de absorbans oranı 2.1 optimum olmak üzere, 1.8 ile 2.1 arasında olmalıdır.
  4. Kadar 100 ul toplam hacmi getirmek için 4 U DNaz I, 60 U RNasin, 10 ul 10x reaksiyon tamponu ve DEPC-işlenmiş su ekleyin, 30 mikrogram toplu RNA atın. 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. RNeasy Mini kit kullanılarak RNA arındırın. 30 sn için tüm centrifugations gerçekleştirmek ve tüm "isteğe bağlı" adımları içerir dışında, üreticinin talimatlarına uyun.
  6. Nanodrop kullanarak RNA konsantrasyonu belirleyin ve bir Bioanalyzer üzerindeki "toplam RNA pico" testi kullanılarak RNA kalitesini değerlendirmek.
  7. MRNA saflaştırma için, bir RNase içermeyen mikrofüj tüpe 30 ul Dynabeads aktarın.
  8. 1-2 dk için bir mıknatıs üzerinde tüp yerleştirin ve süpernatant kaldırmak. Içinde süspanse boncukBinding Buffer 15 ul. Tekrarlayın.
  9. Toplam RNA 5 mg ile başlayarak, DEPC-su kullanılarak 15 ul sesi ayarlayın. 65 Isı ° buz üzerinde 2 dk, ve yer için C.
  10. 15 ul önceden yıkanmış boncuklar toplam RNA 15 ul ekleyin. Boncuklar için RNA tavlama için 30 dakika boyunca her 5 dakika pipetleme ile iyice karıştırın. 1-2 dakika mıknatıs üzerine yerleştirin ve süpernatant tümünü çıkarın.
  11. Dikkatli pipetleme tarafından Yıkama Tamponu B Mix 35 ul ekleyin. Mıknatıs üzerine yerleştirin ve dikkatlice süpernatant kaldırmak. Yıkama iki kez tekrarlayın.
  12. 2 dakika için 80 ° C ile 15 ul soğuk 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve ısıtma ekleyerek mRNA Zehir. Hemen -80 ° C'de, mıknatıs üzerinde tüp Sözlüğe RNaz ücretsiz tüp supernatant aktarın ve dondurma ) 3.8 gibi sayısal. Verim toplam RNA ~% 1-5 olmalıdır.

Metabolomik analiz için, protokoller 1 ve 2) gerçekleştirmek, ve aşağıda) 4 ile devam edelim:

4. Metanol-kloroform ilaveMetabolitlerinin ction

Amaç: Ayrı polar ve non-polar metabolitleri.

  1. 0.1 mg / çıkarma sırasında lipid oto-oksidasyonunu önlemek için ml 'lik bir konsantrasyonda kloroform ile hidroksitoluen (BHT) butillenmiş antioksidan ekleyin. Tüm sonraki basamaklar bu BHT-kloroform kullanın.
  2. Içine Transferi 200 kafaları soğuk, konik vidalı kapaklı polipropilen tüpler, -80 ° C'de dondurularak önceden tartılmış ve lyophilize. Kuru ağırlığı belirlenir.
  3. Tüpler 5-7 zirkon boncuk koyun ve 800 Hz'de 20 sn, her iki devir için bir boncuk çırpıcı içerisinde homojenize.
  4. Ağır numunenin kuru ağırlığına dayalı olarak, aşağıdaki oranlarda su, metanol, ve kloroform ekleyin: 11.74 x metanol; 10.59 x su, 11.74 x kloroform, x g ve ürün de ağır numune ağırlığı olduğu bir ml hacim. Liyofilize başlıkları içeren boncuğun çırpıcı tüp için tüm hesaplanmış olarak metanol ve suyun toplam% 45 ekleyin.
  5. Homojenizer20 sn her iki devir için boncuk çırpıcı in ze.
  6. Kloroform hacmi (% 100) ve buz üzerinde bir koni şeklinde cam şişe içinde suyun geri kalanı (% 55) birleştirin. Daha sonra, bir cam şişeye (boncuk) ile doku karışım aktarın. 10 dakika boyunca çalkalanır. Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin.
  7. 4 de, bir santrifüj içinde döndürme ° C'de 2.000 x g hızında 5 dakika için. Pasteur pipeti (plastik kaçının) ve ikinci bir mikrosantrifüj tüp içinde yer polar (üst) faz çıkarın.
  8. -80 Küçük bir cam şişe ve dondurucu içinde polar-olmayan (alt) faz ° C. katılım Azot gazı akışı altında kurutun; azot tankından çalışan boru özü yumuşatıcı önlemek için yüksek saflıkta Tygon olduğundan emin olun.
  9. 620 ul döteryumlanmış kloroform ile, polar olmayan faz rehidrate. Etiketli NMR tüpler içine 600 ul aktarın. Patlamaya dayanıklı -80 ° C derin dondurucuda saklayın.
  10. Centrivap polar faz yerleştirin ve tüp 30 tamamen kuruyana kadar çalıştırmak ° C (~ 7 saat).
  11. Reh[- (trimetilsilil)-propiyonik asit 2 ,2,3,3-d4 asit 3], dahili bir standart olarak 1 mM TMSP ile döteryum oksit içinde 620 ul 0.1 M sodyum fosfat tampon maddesi (pH 7.3) ile polar faz ydrate. 30 sn vorteksleyin. 4 bir mikrosantrifüj içinde Spin ° C NMR spektrumları ile engel çökelti pigmentler ve diğer büyük moleküller, 10.000 rpm'de 5 dk. Etiketli NMR tüplere 600 ul süpernatan aktarın.

Sonuçlar

Da-gal4 kontrolü altında genişletilmiş Atxn3 zamansız ifadesi ile tetiklenen öldürücü atlamak için, biz Gal80 ts gal4 zamansal düzenleme tanıttı. Ama toplama ve sinekler çok sayıda dondurma ile devam etmeden önce, biz Gal80 ts ve da-gal4 denetimi altında bizim transgen ifadesi dinamiklerini tespit etmek istedim. Bunu yapmak için, biz, haç oluşturulan 18 ° C'de döl bıraktı, yetişkin sinekler toplandı ve 18 az 24 saat süreyle bunları muhafaza ° C Daha sonra, kısıtlayıcı sıcaklık (29 ° C) yerleştirilir ve sinekler 0, 6 için onları inkübe, 12, 24, 36, 48, ve 72 saat. Sonra, biz yayınlanan protokolleri 10 takiben tek sinekler western blot ile genişletilmiş polyQ allelinin birikimi saptandı. İfade ilk algıladı, ancak soluk 6 sıcaklık vardiyadan sonra saat ve doygunluk seviyelerini (Şekil 2A) ulaştığında, 48 saat kadar artarak devam etmiştir. INTERESzil gibi, erimez polyQ arasında bir yüksek moleküler ağırlıklı grup bu iri agregatlar oluşturması için protein için gereken zaman sinyal, 48 saat sonra ortaya çıktı. Biz de immünofloresan (Şekil 2B) tarafından genişletilmiş polyQ allel dağılımını belirlemek için her zaman noktasında sinek beyinleri. Protein ilk olarak, sıcaklık kayması sonra 24 saat tespit edildi düzensiz bir dağılıma sahip olsa da. 24 ve 48 saat arasında protein düzeyleri anten lobları ve mantar vücut projeksiyonlar (Şekil 2B) de dahil olmak üzere, açıkça görünür merkezleri birçok beyin yaparak, artmaya devam etmiştir. 48 ve 72 saat arasında genişletilmiş polyQ allelin ifadesi gal4 sistemi tam bu anda aktif olduğunu düşündüren, maksimal düzeylere ulaştı. Bu sonuçlara dayanarak, daha sonraki deneyler için ilk zaman noktasında (1. gün) olarak sıcaklığı vardiyadan sonra 24 saat seçilir. 10 ve 20 gün eski sinek koleksiyonları da sıcaklık değişimi (ti başlangıç ​​ölçüldüDeney patojen ve kontrol transgenlerin yeni ifadesi ile başlar zaman bana 0).

Bir kez biz Atxn3, 29 Gal80 ts ve da-gal4 ° C kontrolü altında 24 saat sonra saptandı doğrulandı, bu sinekler 20 gün boyunca nörodejenerasyon belirtileri gösterir olup olmadığını merak. Bu sinekler yetişkinler gibi patojenik proteinleri ifade başlangıcından bu yana, biz onlar nörodejeneratif fenotipleri göstermek için uzun bir inkübasyon süresi gerekebilir korkuluyor. Bu koşullarda Atxn3-78Q ve toksisite belirlemek için, biz lacZ, Atxn3-27Q ve Atxn3-78Q ifade sinekler toplanır ve bunların uzun ömürlü kaydedildi. LacZ ve 20 gün sonra% 90 canlılık üzerinde görüntülenir Atxn3-27Q ifade sinekler, ifade uçar Oysa Atxn3-78Q (Şekil 3) gün 20 (% 30) düşük sağkalım göstermiştir. Aslında, Atxn3-78Q sinekler kaybı son beş d hızlanan, (% 20) anlamlı günde 10 (% 7 mortalite) ve gündüz 15 ölmeye başladıays. Dolayısıyla, bu sonuçlar bir patojen gen yetişkin ifadesi kısaltılmış ömrü, Atxn3-78Q ile indüklenen nörodejeneratif fenotipleri bir anahtar işareti sonuçlandığını belirtti.

Bu protokolün en önemli yönlerinden biri çıkartılan malzemenin kalitesini sağlamak için donma sonrası numunelerin taşınması ve korunması idi. Biz Nanodrop göre DNaz tedavi öncesi 200 kafaları (yaş ve genotip bağlı) başına toplam RNA 15-80 mikrogram arasında ayıklanır. Yaklaşık üçte biri (6-25 ug) 260 nm 'de absorbans nm/280 oranı DNaz ile tedavi sonrası son derece saf bir RNA olarak elde edildi. Bununla birlikte, RNA-seq cDNA kütüphanelerinin hazırlanması için RNA'nın kalitesini belirlemek için en iyi yol Bioanalyzer toplam RNA üzerinde analiz etmek olduğunu ortaya koymuştur. Neyse ki, RNA (5 ng) yalnızca küçük bir miktar Bioanalyzer kullanıldı, böylece numune başına birkaç kütüphaneler üretmek için yeteneğini etkiler saptanmamıştır. Bir örnek olarak, toplam iki örnek ranRNA Bioanalyzer çip üzerinde DNaz tedavi öncesi, bunlardan biri (Şekil 4A-C) bozulmuş olduğundan şüpheleniliyor. Yüksek kalite RNA (örnek 1) ribozomal RNA'lar (Şekil 4A) temsil eden üç keskin RNA bantları, 200 nt aşağıda boyutu ve daha küçük bir bant sadece 2,000 nükleotidler aşağıdaki iki (nt) üretti. Nt yaklaşık 2.000 iki bant 18S rRNA (küçük pik) ve Drosophila rRNA biyoloji (Şekil 4B bakın) eşsiz bir yönüdür 28S rRNA (büyük pik), iki parçaları karşılık gelir. Bu nitelikler de Bioanalyzer izleri (Şekil 4B) gözlendi. Buna karşılık, bir bozulmuş RNA örneği (örnek 2) ribozomal RNA'ların sivri tepeler üretmek ve daha az 500 nt (Şekil 4A) birden çok bantları birikmiş vermedi. Bu, boyut dağılımı kolayca daha kısa boyutu geniş zirveler not edildiği Bioanalyzer izleri (Şekil 4C), ayırt edilmiştir. W dikkat etmek de önemlidirbozulmuş örnek az RNA sahip olduğunu göstermiştir, iki RNA örnekleri, arasındaki y-ekseni birimleri arasındaki fark gibi. Sadece kütüphane üretimi için kullanılacaktır (2.1 optimum olmanın, protokol adım 3.8 bkz. 1.8 ve 2.1 arasındaki 260 nm/280 nm'de absorbans Nanodrop oranı) maksimum kalitede görüntüleniyor RNA.

Metabolitlerin ekstraksiyonu için, klasik bir su / metanol / kloroform (2.0:2.0:1.8) polar ve non-polar hem metabolitlerinin 35 ekstraksiyonu maksimize etmek için iki adım içine ekstraksiyon prosedürü 3 bölünmüş izledi. Polar ve polar olmayan faz ayırma sonra, döteryumlanmış suda veya yeniden oluşturulmuş sırasıyla, döteryumlanmış kloroform, ve NMR ile analizi için dahili standart eklendi. NMR spektrumları bu ekstraksiyon yöntemi iyi bir metabolik profili açısından uygun, yüksek-kaliteli özler arıtma gösteren düz taban ve dar hat (Şekil 5) ile birlikte çözüldü kullanılarak eldeD metabolitlerinin, çok sayıda belirlenmesi. Şekil 5, literatürde 7 kimyasal kaymalar göre, glukoz ve sukroz, ve iki temel metabolik asit, laktik asit ve asetat gibi yüksek derecede bol metabolitler, karşılık gelen birkaç önemli tepe noktalarının belirlenmesini gösterir. Kimyasal kayma (parts per million) bir standart molekülü (TMS, sağdan ilk zirve) göreli bir molekülün koruyucu elektromanyetik temsil eder. Daha shieldedmolecules çekirdeğin etrafına yüksek elektron yoğunluğuna sahip ve alkiller dahil spektrum, sağında görünecektir. Böyle amid ve aromatik hidrojenler olarak Deshielded moleküllerin yelpazenin solunda görünür hale gelecektir. Meşgul orta bölüm (3-4 ppm) şeker molekülleri için zenginleştirilmiştir.

figure-results-1
Şekil 1.. Deneysel iş akışı. Öncelikle, biz istenen genotiplerinin (üst sıra) sinekler toplamak için haçlar ayarlayın. Sonra, biz ° C gen ekspresyonu, 1, 10 yaş onları, ve 20 gün etkinleştirmek için 29 bakireler kayması, ve onları (ikinci satır) flaş dondurma. Önümüzdeki bir microsieve (üçüncü sıra) kullanılarak dondurulmuş kafaları toplamak. Kafaları dondurularak kurutulmuş, yere kadar, ve RNA (dördüncü sıra) veya metabolitlerin (alt satır) çıkarılması için tedavi.

figure-results-2
Şekil 2. İfade kinetiği (A) Western Blot (Gal80 ts; Da-gal4 / UAS-Atxn3-78Q) Atxn3-78Q ifadesi gösteriyor. 29. inkübe sinekler 0'dan 72 saat ° C. Bir soluk grup ilk 6 saatte algılanır ve doygunluk indüksiyon sonrası 48 saat ulaşılabilir. (B) aynı sinekler tüm beyinlerin İmmünofloresan. Brain, bir, sabit, diseke edildid genişletilmiş polyQ proteini tanıyan bir antikor ile boyandı. Protein İlk mantar vücut (MB) projeksiyon ve anten lobları (AL) tespit edilir. 48 ve 72 saat arasında, ifade maksimum seviyelere ulaşır ve bol innervasyonu ile beyin merkezlerinde gözle görülebilmektedir. OL ve orta beyin arasında birkaç büyük nöronlar dışında optik lob (OL) 'de görüldüğü gibi nöron başına ekspresyon seviyesi zayıftır.

figure-results-3
Şekil 3,. Atxn3-78Q ömrünü azaltır ergin dönemlerinde (Gal80 ts; da-gal4) olarak lacZ, Atxn3-27Q ve yayg Atxn3-78Q ifade Sinekler. 29 ° C'de onların uzun ömürlü için izlenmiştir LacZ (mavi) ve Atxn3-27Q (yeşil) ifade günde 20 ile mortalitenin düşük seviyelerde gösterdi uçar. Buna karşılık, Atxn3-78Q (kırmızı) görüntülenir ifade uçar10. günde başlayan belirgin bir ölüm. Günde 15 By onlar günde 20 ile% 70 mortalite ulaşarak, önümüzdeki beş gün içinde hızlandırılmış canlılığı% 20 azalma gösterdi.

figure-results-4
Şekil 4. RNA kalitesinin değerlendirilmesi. RNA yüksek kalite ve bozulmuş örnekler bir Bioanalyzer çip üzerinde çalıştırıldı. (A) Bioanalyzer yüksek kalite RNA (örnek 1) bozulmuş bir RNA (örnek 2) bir boyut işaretleyici (sol şerit) yanında çalıştırmak. Merkezi şeritte ribozomal RNA karşılık üç sivri tepeler unutmayın. (B) Bioanalyzer sadece 2.000 mt ve 200 altında başka aşağıda iki karakteristik güçlü zirveleri ile, örnek 1 için izlemeyi. (C) Bioanalyzer çoğunlukla bozulmuş RNA oluşur örnek 2 için izlemeyi. Paneller B ve C arasındaki y-ekseni üzerinde birimlerinde farka dikkat edin.

figure-results-5
Şekil 5,. Polar metabolitleri Örnek 1D NMR spektrumları. Drosophila ve tamamlayıcı 2D COSY (korelasyon spektroskopisi) ve HSQC (heteronükleer tek bir kuantum korelasyon) pik atama için deneyler polar metabolitleri Örnek 1D proton NMR spektrumu. Glikoz; 3: Beta-alanin; 4: Asetat; 5: Laktat; 2 Sukroz: Metabolitler bilinen kimyasal kaymalar-1'e göre belirlenmiştir.

Tartışma

Transkriptomik 11, 12, metabolizma 15 ve nörodejeneratif hastalıklar 6, 8 bizim önceki tecrübelerine dayanarak, biz burada bir patojen genlerin yetişkinlere özel ifadesi ile sinek kafaları binlerce toplamak için yeni protokol ve için arındırıcı mRNA ve metabolitleri sunmak RNA- sırasıyla seq ve NMR spektroskopisi,. Bu deneylerin doğası her yerde gal4 hattı ve gen ifadesinin zamansal düzenleme kullanımı seçimi de dahil olmak üzere önceki sinek koleksiyonu için çeşitli yeniliklerin katkısı gerekli. Transgenlerin gal4, her yerde ifade ilgili iki nedenden ötürü önemliydi. İlk olarak, diğerlerinin yanı sıra ATXN3, Huntinğtin, amiloid prekürsör protein, ve süperoksit dismutaz 1 de dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların, ilgili genler, çok sayıda, geniş ölçüde nöronal ve glial hücreleri gibi sinir sistemi dışındaki diğer hücre tiplerinde ifade edilmiştir. Biz istedikdoğru yerde ifade sonuçlarını analiz yerine sadece nöral ifade odaklanarak bu patojen genlerin biyoloji bu yönünü modeli. İkincisi, çok sayıda sinek beyinleri toplamak mümkün değildir, ama biz sinek kafaları (koşul başına üç nüsha 200) 11, 12 ile bunu yapabilirsiniz. Bütün başkanları homojenizasyon nöral ve nöral olmayan dokularda karışımları bu yana, her yerde transgen ifadesi aynı transgenlerin salgılayan hücrelerin topluluklarda üniforma RNA ve metabolitleri elde etmek için kritik hale gelir. Bu son rapor da-gal4 25 tamamen her yerde olmayabilir önerdi ancak da-gal4, çünkü yüksek ekspresyon seviyesi arasında, onun oldukça hatta dağıtım için değil seçildi dikkat etmek önemlidir. Biz daha önce kol, Küvet-, ve Act-Ga4 dahil olmak üzere diğer her yerde gal4 hatları, düşünmüşler, ama onlar tüm bunları daha az bir hale yetişkin MSS ve kasların karmaşık ekspresyonu gösterdiBu çalışma için dequate. Aslında, yetişkin beyinlerinde immünofloresan da-gal4 sadece birkaç bin akson oluşan beyin merkezlerinde ve birkaç büyük nöronlar yüksek düzeyde (Şekil 2) birikmiş yaygın ama zayıf ifadesi, uyardığını göstermiştir. Yapıları ifade düzeyleri düşük olmasına rağmen, bu şartlar dramatik bir polyQ bağımlı moda sağkalım azalır. Nörotoksik proteinler tarafından indüklenen yavaş, progresif hücresel değişiklikler gözlemlemek için önemli olan düşük ekspresyon düzeyleri, tutarken Bu ifade dinamikleri bizim ihtiyaçlarını karşılamıştır.

Nörotoksik proteinlerin her yerde ifade inducing bir öngörülebilir sonucu erişkin eclosion önce öldürücülüğü neden oldu. Neyse ki, bu komplikasyon Gal80 ts kullanımı ile baypas idi. Yukarıda tartışıldığı gibi, gen ekspresyonu zaman fra ile de uyacağı, yaklaşık olarak 48 saat sonra maksimum sıcaklık kaydırma seviyelere ulaştığıDeney beni. Gal80 ts kullanmanın bir diğer avantajı da nörotoksik protein bileşeni olarak pan-nöral ifade edilmiştir deneyleri farklı olarak, herhangi bir ifade sinir sisteminin gelişimi sırasında meydana geldiğini idi. Böylece, Gal80 ts kullanımı sinir sistemi hassas gelişim aşamalarında bu nörotoksik proteinlerin toksik faaliyetlerine maruz kalmayan bir "temiz" arka plan oluşturdu. Bizim görüşümüze göre, yetişkinlerde gen ekspresyonunun aktivasyonu erişkin başlangıçlı patolojiler bu sınıf için daha iyi bir model sonuçlandı. Bununla birlikte, Gal80 ts da sıcaklık değişimlerine bağlı bir komplikasyon az getirmiştir. Bir düşük sıcaklıklarda (18-20 ° C) büyüyor sinekler deneyler önemli ölçüde uzun yapma, yaşam döngüsü gecikmeli oldu. Ayrıca, bu da yüksek sıcaklıklarda (29-31 ° C) büyüyen sinekler gibi, 25 yaşında sinekler göre kısaltılmış ömrü tarafından gösterildiği gibi kendi metabolizmasının ° C. hızlandırdığı bilinir Sitranskripsiyonel ve metabolik çalışmalar yüksek sıcaklıkta yaş sinekler yapılacaktır nce, biz hücresel stres yollarının ve enerji metabolizmasında önemli değişimler görmeyi bekleyebiliriz. Bu deney, patojenik olmayan Atnx3-27Q ve lacZ ifade alakasız bir denetimi bir ila iki kontrol tanıtmak için çok kritik olmasının nedeni budur. Biz doğrudan toksik Atxn3 ifadesi ile bağlantılı bu değişiklikleri belirlemek, böylece Bu kontroller gen ekspresyonu ve yüksek sıcaklık ile ilişkili metabolik değişiklikler için bir temel sağlayacaktır. Erişkin başlangıçlı, ilerleyici hastalıkların çalışmak için - ve birkaç dezavantajları (sıcaklık sorunları ve sonraki paragraf) - Genel olarak, biz pek çok avantaj sağlayan sineklerin toplanması için birkaç değişiklik girmiştik.

Gal80 ts ile zamansal düzenleme yararlı bir ek olmasına rağmen, aynı zamanda beklenmedik bir komplikasyon tanıttı. Bir Gal80 ts hem taşıyan sinekler oluştururkenistikrarlı bir stok nd da-gal4 yapıları, biz de yapıları uygulanabilir ancak steril vardı için iki kat homozigot uçar fark ettim. Homozigot Gal80 ts ve da-gal4 suşları uygulanabilir ve kendileri tarafından verimli olduğundan, bu kombinasyon düşük doğurganlık görüntülenmez neden açık değildir. Bu gal4 Drosophila dokulara 22 biraz toksik olduğu bir süredir bilinmektedir. Bu maya transkripsiyonel repressör Gal80 arasında heterolog ifade endojen transkripsiyonel makine ile, potansiyel olarak, müdahale ederek gal4 nin toksisitesi katkıda bulunduğunu, sonra mümkündür. Bu toksisite da, erken gelişim ve cinsel belirlenmesinde önemli bir rol oynayan bir genin kontrolü altında gal4 arasında yaygın dağıtım şiddetlenir olabilir. Ne olursa olsun kısırlık yatan nedenleri, biz Gal80 ts genişletilmiş; ho tutarken da-gal4 üzerinde dengeleyici kromozom sürdürerek da-gal4 sineklerGal80 t s mozygosity, gal4 sterilite için daha kritik bir katkı olduğunu düşündürmektedir. Biz UAS transgenlerin her biri ile çapraz her hafta bu erkeklerin yüzlerce kullanılır, çünkü bu çözüm anahtarı oldu. Ancak, uygun döl seçimi sırasında ek iş oluşturulan bir dengeleyici taşıyan haçlar. Döl sadece dörtte biri (% 25), seçim zamanı eklendi, hangi (kadın, non-dengeleyici) toplanan şişe başına verim azalır, ve genotip başına en az 200 sinekler elde / zaman / çoğaltmak için gereken şişe sayısı arttı noktası. Sineklerin toplanması gereken büyük kümeler nedeniyle zaman alıcı olmamıza rağmen genel olarak, biz sadece birkaç saat patojenik gen ekspresyonu açtıktan sonra hücresel değişiklikler okuyor ubiquitously ilerleyici nöron kaybı karışmış yeni ve ilginç süreçleri tanımlamak eminiz.

Genetik tasarım yerdeydi sonra, biz özel önembiyolojik değişkenliğin getirebilir deneysel manipülasyonlar. Bu erkek atmadan ve günde iki kez döl kontrol anlamına rağmen ilk, biz sadece, örneklerin homojenliğini sağlamak için bakire dişi toplanmış. Yaşlanma sırasında, en fazla 12 sinekler kalabalık ve stres önlemek için aynı flakon tutuldu. Ayrıca, dondurma işleminden önce, sinekler anestezi olmadan cryovials transfer edildi ve 30 dakika için transfer eski hallerine gelmeye bırakılmıştır. Bunlar görünüşte önemsiz faktörler deney alakalı olmaz son tahlilde değişkenliği tanıtan, gen ekspresyonu ve metabolizmasını etkilemektedir.

Dondurulmuş malzemeleri (başkanları, RNA ve metabolitleri) kalitesini sağlamak için, doku bozulması katkıda bulunabilir her ayrıntı özel dikkat. Sinekler küçük numaralar kriyotüplerin (flakon başına kadar 12 sinekler) aktarılır yana, 200 kafaları koleksiyonu için birçok şişeleri almak zorunda kaldı. Bu manipülasyonlar d vardıkuru buz ve sıvı nitrojen ile soğuk bir odada son derece dikkatli biri. Sinekler, başkanları ayırma ve bilgilendirme moleküllerin saflaştırılması koleksiyonu çok malzeme bu uzun bir süreç sonunda bozulmuş olduğunu keşfetmek için zaman alıcıdır. Malzeme kalitesini korur sağlanması için ek olarak, bu protokol dondurarak kurutma ve boncuk dayak içeren RNA ve metabolitler, verimi arttırmak çeşitli adımlar açıklanmaktadır. Bu adımlar, RT-PCR veya bütün sinekler kantitatif PCR için normal çekimleri için gerekli, ama onlar gibi sinek başları gibi küçük numunelerin tutarlı saflaştırma için kritik değildir. Biz diğer adımları RNA verimi etkilediği belirlenmiştir. Örneğin, büyük sineklerin bakılmaksızın genotip, genç sinekler önemli ölçüde daha az RNA üretilir. Bu gözlem, yüksek sıcaklık yaşlanma dramatik değişikliklere neden olduğunu ileri sürdü. Ayrıca, 100 kafaları RNA ayıklanması gerçekten 200 başları daha verimli olduğunu, bu yüzden biz iki b arındırmak için ilerledinumune başına 100 atches, yalnızca Bioanalyzer kalite doğrulamasından sonra bunları birleştirmek. Ayrıca, mRNA saflaştırma için sütunlar yani sütun başına kullanılan toplam RNA miktarını optimize edilmesi gerekiyor, kolayca doyurmak için görünüyordu.

Metabolitlerinin küçük moleküllerin farklı bir karışımı vardır, bu nedenle kalite kontrol DNA, RNA veya protein ile daha zordur. Kütle Spektrometresi (- Ne yazık ki, şu anda herhangi bir hayvan modeli için metabolitlerin hiçbir komple katalog, NMR spektroskopisi ve sıvı kromatografisi genişletilmiş kullanımı dahil olmak üzere birçok teknolojik yenilikler, uygulama için önümüzdeki birkaç yıl sayesinde değişiyor olabilir bir şey var LC-MS). NMR MS daha az hassas olmasına rağmen, hiçbir örneklerin imha, önyargı (LC) tanıtmak hiçbir analitik prosedürler ve temsilcileri ve çok sayıda deneysel koşullar 24 istatistiksel karşılaştırma sağlayan yüksek tekrarlanabilirlik dahil birçok vaat avantajlar gösterir. Bu nedenle, örnek olabilir,yeniden test gözlemleri doğrulamak veya LC-MS NMR verileri doğrulamak için tarafından yeniden analiz etmek. Burada, biz Drosophila metabolitlerinin bir katalogunu derlemek için kullandığınız sinekler ön NMR verileri gösterdi. Bu bilgiler nörodejeneratif hastalıkların altında yatan hücresel mekanizmaları anlamak ilerletmek için yeni bir pencere açarak, patojenik gen ekspresyonu normal metabolizmasını bozan belirleyen kritik olacak.

Yeni gelişmekte olan omic teknolojilerin elde değil bir ayrıntı düzeyinde nörodejeneratif hastalıklar çalışma için en iyi fırsatı sunuyoruz. Belki de bu yüksek verimlilik çalışmalarında aşmak için en büyük engel son derece hassas yöntemlerle analiz edilebilir tekrarlanabilir numune sadık topluluğudur. Prosedürler bu tutarlılık elde etmek için bir yol sağlar Burada tanıtılan ve kolayca veri kümeleri arasında mukayese edilebilir sonuçlara yol açacaktır. Bizim öncelikli araştırma alanları gen ekspres inceleyerek değişiklikleri kapsıyordu rağmeniyon ve metabolitler, üretilen sinekler da proteomik veya epigenomic analizine tabi olabilir. Nörodejenerasyon sırasında meydana Proteomik ve epigenomic değişiklikler de hastalık süreci için büyük önem olması muhtemeldir. Bilimsel topluluk sonuçta hastalık sürecini etkileyen moleküler değişikliklerin tam spektrum tespit ettiğinde, hastalığın gerçek sistemler düzeyinde anlaşılması mümkün olacaktır. Bu düzeyde, hastalık modifiye tedaviler sonunda bir gerçeklik olarak ortaya çıkacaktır.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının beyan.

Teşekkürler

Biz Janice Santiago, Gabriel Figueroa ve teknik yardım ve sinek stokları için Indiana Üniversitesi Bloomington Drosophila Stok Center Jose Herrera müteşekkiriz. DH ve CW NSF-IOS-1051890 fonları tarafından desteklenmiştir. PF-F ve LMM Florida Üniversitesi'nden Fırsat Tohum Fonu tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Şirket Kedi. Numara Yorumlar
Caz karışımı Drosophila gıda Fisher Scientific AS-153
Kriyojenik Flakon , Corning, Inc 430658
Mikrotüpler Axygen MCT-175-CS
RNaseZap Ambion AM9786 Tüm yüzeyleri Treat
5/32 "taşlama topları, paslanmaz çelik OPS Diagnostik GSS 156-5000-01
TRIzol Ambion 15596018
1-bromo-3-kloropropan Sigma B9673-200ML
Isopropanolunpanol Fisher Scientific A416-500
DEPC-işlenmiş su Fisher Scientific BP561-1
DNaz I Promega M6101
RNasin ribonükleaz inhibitörü Promega N2111
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Dynabeads mRNA Arındırma Kiti Invitrogen 610-06
Konik Vida Cap Tüpler Fisher Scientific 02-681-344
Vida Caps w / O-Ringler Fisher Scientific 02-681-364
2.0 mm Zirkonya boncuk BioSpec Ürünler 11079124zx
Metangliserol, HPLC-grade Fisher Scientific A4524
Kloroform, HPLC dereceli Acros organikler AC39076
Drosophila Stoklar
da-gal4 Bloomington Stok Merkezi 5460
Gal80 [ts] Bloomington Stok Merkezi 7108
UAS-MJD-27Q Bloomington Stok Merkezi 8149
UAS-MJD-78Q Bloomington Stok Merkezi 8150
UAS-lacZ Bloomington Stok Merkezi 8529
Ekipman
+ Mat Injectic Sleeper + MATIC INJECT
Microsieve Seti Fisher Scientific 3410531 Iki büyük kafes kullanın
Geno / Öğütücü 2000 Spex Numune Hazırlık SP2100-115
Sorvall Legend Mikrosantrifüj ThermoScientific 75002436
FreeZone Artı 2.5 L Cascade Freeze Kuru Sistem Labconco 7670041
Bioanalyzer v 2.6 Agilent 2100
DynaMag-2 Mıknatıs Invitrogen 123-21D
Nanodrop spektrofotometre ThermoScientific
Hızlı Hazırlık boncuk-çırpıcı ThermoScientific FP120
Centrivap Vacufuge Artı Labconco 022820001

Kaynaklar

  1. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat. Rev. Neurosci. 11, 514-522 (2010).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6, 9-23 (2005).
  3. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
  4. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  5. Bundy, J. G., Papp, B., Harmston, R., Browne, R. A., Clayson, E. M., Burton, N., Reece, R. J., Oliver, S. G., Brindle, K. M. Evaluation of predicted network modules in yeast metabolism using NMR-based metabolite profiling. Genome Res. 17, 510-519 (2007).
  6. Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Sanchez-Garcia, J., Gomez-Velazquez, M., Rincon-Limas, D. E., Fernandez-Funez, P. The ER stress factor XBP1s prevents amyloid-beta neurotoxicity. Hum. Mol. Genet. 20, 2144-2160 (2011).
  7. Fan, T. W. M. Metabolite Profiling by One and Two-Dimensional NMR Analysis of Complex Mixtures. Proress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
  8. Fernandez-Funez, P., Casas-Tinto, S., Zhang, Y., Gomez-Velazquez, M., Morales-Garza, M. A., Cepeda-Nieto, A. C., Castilla, J., Soto, C., Rincon-Limas, D. E. In vivo generation of neurotoxic prion protein: role for hsp70 in accumulation of misfolded isoforms. PLoS Genet. 5, e1000507(2009).
  9. Fernandez-Funez, P., Nino-Rosales, M. L., de Gouyon, B., She, W. C., Luchak, J. M., Martinez, P., Turiegano, E., Benito, J., Capovilla, M., Skinner, P. J., McCall, A., Canal, I., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y., Botas, J. Identification of genes that modify ataxin-1-induced neurodegeneration. Nature. 408, 101-106 (2000).
  10. Fernandez-Funez, P., Zhang, Y., Casas-Tinto, S., Xiao, X., Zou, W. Q., Rincon-Limas, D. E. Sequence-dependent prion protein misfolding and neurotoxicity. J. Biol. Chem. 285, 36897-36908 (2010).
  11. Graze, R. M., McIntyre, L. M., Main, B. J., Wayne, M. L., Nuzhdin, S. V. Regulatory divergence in Drosophila melanogaster and D. simulans, a genomewide analysis of allele-specific expression. Genetics. 183, 547-561 (2009).
  12. Graze, R. M., Novelo, L. L., Amin, V., Fear, J. M., Casella, G., Nuzhdin, S. V., McIntyre, L. M. Allelic imbalance in Drosophila hybrid heads: exons, isoforms, and evolution. Mol. Biol. Evol. 29, 1521-1532 (2012).
  13. Greene, J. C., Whitworth, A. J., Kuo, I., Andrews, L. A., Feany, M. B., Pallanck, L. J. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4078-4083 (2003).
  14. Gunawardena, S., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport and neuronal viability by amyloid precursor protein mutations in Drosophila. Neuron. 32, 389-401 (2001).
  15. Hahn, D. A., Denlinger, D. L. Energetics of insect diapause. Annu. Rev. Entomol. 56, 103-121 (2011).
  16. Kawaguchi, Y., Okamoto, T., Taniwaki, M., Aizawa, M., Inoue, M., Katayama, S., Kawakami, H., Nakamura, S., Nishimura, M., Akiguchi, I., et al. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nat. Genet. 8, 221-228 (1994).
  17. Lee, F. W., Akiguchi, S. C. The use of Trizol reagent (phenol/guanidine isothiocyanate) for producing high quality two-dimensional gel electrophoretograms (2-DE) of dinoflagellates. J. Microbiol. Methods. 73, 26-32 (2008).
  18. Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. Research resources for Drosophila: the expanding universe. Nat. Rev. Genet. 6, 179-193 (2005).
  19. McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
  20. Paulson, H. L., Das, S. S., Crino, P. B., Perez, M. K., Patel, S. C., Gotsdiner, D., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N. Machado-Joseph disease gene product is a cytoplasmic protein widely expressed in brain. Ann. Neurol. 41, 453-462 (1997).
  21. Pfeiffer, B. D., Ngo, T. T., Hibbard, K. L., Murphy, C., Jenett, A., Truman, J. W., Rubin, G. M. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. , 186-735 (2010).
  22. Rezaval, C., Werbajh, S., Ceriani, M. F. Neuronal death in Drosophila triggered by GAL4 accumulation. Eur. J. Neurosci. 25, 683-694 (2007).
  23. Rincon-Limas, D., Jensen, K., Fernandez Funez, A. Drosophila models of proteinopathies: the little fly that could. Curr. Pharm. Des. 18, 1108-1122 (2012).
  24. Robinette, S. L., Ajredini, R., Rasheed, H., Zeinomar, A., Schroeder, F. C., Dossey, A. T., Edison, A. S. Hierarchical Alignment and Full Resolution Pattern Recognition of 2D NMR Spectra: Application to Nematode Chemical Ecology. Anal. Chem. , (2011).
  25. Simon, A. F., Daniels, R., Romero-Calderon, R., Grygoruk, A., Chang, H. Y., Najibi, R., Shamouelian, D., Salazar, E., Solomon, M., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Diantonio, A., Krantz, D. E. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
  26. Smith, C. D., Shu, S., Mungall, C. J., Karpen, G. H. The Release 5.1 annotation of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, 1586-1591 (2007).
  27. Steffan, J. S., Bodai, L., Pallos, J., Poelman, M., McCampbell, A., Apostol, B. L., Kazantsev, A., Schmidt, E., Zhu, Y. Z., Greenwald, M., Kurokawa, R., Housman, D. E., Jackson, G. R., Marsh, J. L., Thompson, L. M. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
  28. Tang, F., Barbacioru, C., Nordman, E., Li, B., Xu, N., Bashkirov, V. I., Lao, K., Surani, M. A. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat. Protoc. 5, 516-535 (2010).
  29. Tare, M., Modi, R. M., Nainaparampil, J. J., Puli, O. R., Bedi, S., Fernandez-Funez, P., Kango-Singh, M., Singh, A. Activation of JNK signaling mediates amyloid-ss-dependent cell death. PLoS One. 6, e24361(2011).
  30. Taylor, J. P., Taye, A. A., Campbell, C., Kazemi-Esfarjani, P., Fischbeck, K. H., Min, K. T. Aberrant histone acetylation, altered transcription, and retinal degeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease are rescued by CREB-binding protein. Genes Dev. 17, 1463-1468 (2003).
  31. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. , 134-3571 (2007).
  32. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  33. Warrick, J. M., Chan, H. Y., Gray-Board, G. L., Chai, Y., Paulson, H. L., Bonini, N. M. Suppression of polyglutamine-mediated neurodegeneration in Drosophila by the molecular chaperone HSP70. Nat. Genet. 23, 425-428 (1999).
  34. Warrick, J. M., Paulson, H. L., Gray-Board, G. L., Bui, Q. T., Fischbeck, K. H., Pittman, R. N., Bonini, N. M. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93, 939-949 (1998).
  35. Wu, H., Southam, A. D., Hines, A., Viant, M. R. High-throughput tissue extraction protocol for NMR- and MS-based metabolomics. Anal. Biochem. 372, 204-212 (2008).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Transkript EkstraksiyonuMetabolit PurifikasyonuSinek Baş ToplamaDokuların LiyofilizasyonuRNA İzolasyonuKloroform EkstraksiyonuBioanalyzer AnaliziNMR AnaliziDoku Öğütme
Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.