Yöntem makalesi

Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi

11.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50561

⸱

6 Ocak 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, 3Department of Otolaryngology, University of Michigan

Bu makalede

Özet

Singeneik immün yetmetik konakçılarda değerlendirilen kanser kök hücre (KSS) bazlı dendritik hücre (DC) aşısı, heterojen dökme tümör hücreleri ile nabızlanan geleneksel DC aşılarına göre önemli ölçüde daha yüksek antitümör bağışıklık göstermiştir.

Özet

Murine melanom D5 syngeneic'ten C57BL/6 farelere ve Skuamöz kanser SCC7 singenetiğinden C3H farelerine kadar kanser kök hücre (CSC) ile zenginleştirilmiş popülasyonları aldefluor/ALDH'yi belirteç olarak kullanarak belirledik ve hücre lisatını dendritik hücreleri (DC) nabızlamak için antijen kaynağı olarak kullanarak immünojenikliklerini test ettik. ALDHyüksek CSClyazlarla nabız atan DC'ler, her iki modelde ve akciğer metastaz ayarında ve s.c'de sıralanmamış tüm tümör hücresi lysates'lerinin lysates'i ile nabız atan DC'lere göre önemli ölçüde daha yüksek koruyucu antitümör bağışıklığına neden oldu. sırasıyla tümör büyüme ayarı. Bu fenomen, CSC aşısı kaynaklı humoral ve hücresel anti-CSC yanıtlarından kaynaklandı. Özellikle, CSC-DC aşısına maruz kalan konakçıdan izole edilen splenositler, sıralanmamış tümör hücresi kalsat darbeli-DC aşısına maruz kalan konakçıdan izole edilen splenositlerden önemli ölçüde daha yüksek miktarda IFNφ ve GM-CSF üretti. Bu sonuçlar, adjuvan bir ortamda klinik kullanım için otolog CSC tabanlı terapötik aşı geliştirme çabalarını desteklemektadır.

Giriş

Kanser kök hücreleri geleneksel kemoterapi ve radyoterapiye nispeten dirençlidir1,2. Öte yandan, bu hücre popülasyonu, geleneksel kanser tedavilerinden sonra kanserlerin nüks etmesinden ve ilerlemesinden sorumlu hücreler olabilir1-4. Farklılaştırılmış tümör antijenlerinin kanser kök hücreleri üzerinde ifade eksikliği nedeniyle, kanser kök hücreleri, çoğunlukla farklılaştırılmış tümör hücreleri üzerindeki antijenleri hedeflemek için tasarlanmış olan kanser tedavisinin mevcut immünolojik müdahalelerinden kaçabilir. Bu nedenle, özellikle kanser kök hücrelerini hedef alan ve yok eden yeni stratejilerin geliştirilmesi, mevcut kanser tedavisinin terapötik etkinliğini artırmaya yönelik sözler verebilir. Bu amaçla, iki hayvan tümöründen (melanom D5 ve skuamöz hücreli kanser SCC7) kanser kök hücre (CSC) zenginleştirilmiş popülasyonları izole ettik ve CSC-TPDC aşısını hazırlamak için antijen sunum hücrelerini (dendritik hücreler, DC) nabızlamak için bir antijen kaynağı olarak kullandık. Daha sonra CSC-TPDC aşısının indüklediği antitümör bağışıklığı sırasıyla singeneik immün yetmetik konakçılarda, B6 farelerde ve C3H farelerinde değerlendirdik. CSC-TPDC kaynaklı antitümör etkinliği, daha önce grubumuz5,6tarafından kullanılan sıralanmamış heterojen tümör hücrelerinden (H-TPDC) ve diğer araştırmacılar tarafından hem klinik öncesi çalışmalarda hem de klinik çalışmalarda7 ile atımlı geleneksel DC aşısı ile karşılaştırıldı.

Protokol

1. ALDEFLUOR Boyama

  1. Hücre örneği hazırlama: Kültürlü tümör hücrelerinden veya yeni hasat edilmiş tümör örneklerinden tümör hücrelerinin tek hücreli süspansiyonu hazırlayın. Hücreleri sayın ve hücre süspansiyonu ALDEFLUOR Tahlil Tamponunda 1 x10 6 hücre/ml konsantrasyona ayarlayın.
  2. Dört adet 12 mm x 75 mm polistiren test tüpünü kontrol tüpleri olarak şu şekilde etiketle: #1: Lekesiz, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR artı DEAB ve #4: 7AAD.
  3. Bu kontrol tüpleri için, 1ml hücre süspansiyonu #1 ve #4, ancak 2 ml tüp #2 yerleştirin. Tüp #3 5 μl DEAB (ALDH inhibitörü) ekleyin ve buzda tutun. Daha sonra tüp #2 10 μl aktif ALDEFLUOR substrat ekleyin, karıştırın ve karışımın 1 ml'yi hemen tüp #3 aktarın.
  4. Aynı zamanda, ALDEFLUOR Test Tamponunda 1 x 10 6 hücre/ml'de de hücrelerin geri kalanına (örnek tüpler) milyon hücre başına2 μl aktif ALDEFLUOR substratı ekleyin.
  5. 37 °C su banyosunda hem 4 kontrol tüpünü hem de numune tüplerini 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. Kuluçkadan sonra, kontrol tüpüne #4 5 μl 7AAD ve numune tüpüne 1 μl 7AAD 1 x10 6 hücre ekleyin. 4 °C'de 10 dk kuluçkaya yatır.
  7. Tüm tüpleri 250 x g'da 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın.
  8. ALDEFLUOR Test Arabelleği'ndeki hücreleri yeniden başlatın.
  9. Akış sitometri tabanlı sıralama gerçekleştirin.
  10. DEAB ile negatif kontrol olarak tedavi edilen ALDEFLUOR lekeli hücreleri ve canlılık kontrolü için propidium iyodür (PI) 7AAD lekeli hücreleri kullanarak sıralama kapılarını ayarlayın. Bu kontrollere dayanarak, ALDEFLUOR+/ALDHyüksek,D5 ve SCC7 hücrelerini ayırt etmek için bir kapı kuruldu. Bu kapılar daha sonra ALDEFLUOR+/ALDHyüksek D5 ve SCC7 hücreleri için yukarıda hazırlanan tüm örnek hücreleri sıralamak için kullanılacaktır.

2. Kanser Kök HücreLi Lisate-nabız Dendritik Hücre (CSC-TPDC) Aşısının Hazırlanması

  1. Fareleri (sırasıyla singeneik B6 ve C3H) CO2 kullanarak ötenazi ve femur ve kaval kemiğini izole edin.
  2. Kemikleri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca% 75 etanol içine koyun. Daha sonra HBSS kullanarak kemikleri yıkayın.
  3. Kemikleri kesin ve hücreleri bir tabağa itmek için 21 G iğne ve 10 ml şırınga kullanın.
  4. Tek hücre süspansiyonu yapmak için şırınna kullanarak hücreleri aspire edin ve üfleyin.
  5. 5 dakika boyunca 1.500 rpm'de santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın. Daha sonra 37 °C su banyosunda 1 dakika boyunca RBC'yi lizize etmek için 5 ml RBC liziz tamponu ekleyin.
  6. Hücre sayısını sayın ve hücre süspansiyonu 10 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml IL-4 içeren tam orta (CM) olarak 1 milyon hücre/ml konsantrasyonuna ayarlayın.
  7. Hücreleri kültüre edin ve 3 gün sonra CM artı IL-4 ve GM-CSF'yi telafi edin.
  8. 5. günde, olgunlaşmamış dendritik hücreleri (DC'ler) hasat edin ve 4,2 ml çözelti C artı 1 ml OptiPrep yoğunluk gradyan ortamı içeren DC izolasyon ortamını hazırlayın.
  9. Hücre peletlerini 5 ml CM olarak askıya alın Hücre süspansiyonu izolasyon ortamına yavaşça ekleyin. Oda sıcaklığında 2,000 rpm'de santrifüj.
  10. CM ve yalıtım ortamı arasındaki DC'leri toplayın. Hücre sayısını sayın ve hücre süspansiyonu 10 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml IL-4 içeren kültür ortamında 1 milyon hücre/ml konsantrasyonuna ayarlayın.
  11. Kültür ortamında ALDHyüksek veya sıralanmamış D5 veya SCC7 hücrelerini askıya alarak ve dört kez hızlı donma-çözülme maruziyetine maruz kalarak tümör lysates hazırlayın ve ardından lysates'in membran kısmını toplamak için 5 dakika boyunca 100 x g ∼ dönüş yaparak.
  12. CSC-TPDC hazırlamak için, otolog ALDHyüksek hücrelerinin lysate ile darbe DC'leri. H-TPDC hazırlamak için, sıralanmamış heterojen tümör hücre lisat ile nabız DC'leri. DC'nin tümör hücre lisat oranı aynıdır.

3. Etkinliğin Aşılanması ve Değerlendirilmesi

  1. Normal B6 farelerini sırasıyla 2.500 D5 CSC-TPDC veya D5 H-TPDC tümör hücresi ile deri altı (s.c.) ile aşılayın. Normal C3H hayvanları s.c.
  2. Aşılamadan sonra, B6 farelerini heterojen D5 tümör hücreleriyle meydan oku, yani 20 gün sonra CO2 kullanarak fareleri ötenazi edin. Akciğerleri topla ve akciğer metastazlarını numaralandırır.
  3. SCC7 modelinde, DC aşısının karşı tarafında sıralanmamış SCC7 tümör hücreleri s.c ile C3H farelerine meydan oku. Tümör boyutunu izleyin.
  4. Deneylerin sonunda CO2kullanarak B6 ve C3H farelerini ötenazi yapın. İlk aşıdan sonraki 34. günde, fareleri CO2ile ötenazi ve aynı zamanda aseptik bir prosedürle her grubun dalağını toplayın.
  5. Immobilize anti-CD3 artı hrIL-2 veya LPS içeren CM'de anti-CD28 mAbs artı anti-CD40 (FGK45) mAb assitleri ile dalak T ve/veya B hücrelerini etkinleştirin.
  6. Etkinleştirmeden sonra, süpernatantları toplayın ve ELISA tahlilleri için kullanın.
  7. ELISA testi için, IFNφ, GM-CSF ve IgG için antikor içeren kaplama plakaları 4 °C O/N'de.
  8. Engelleme tamponu uygulamasından sonra, numuneler ve standartlar ekleyin ve oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
  9. Plakayı yıkayın ve inkübasyon için HRP algılama antikor ve TMB substrat ekleyin.
  10. Reaksiyonu durdurduktan sonra 30 dakika içinde 450 nm'de bir ELISA plaka okuyucusunda emiciliği ölçün.

Sonuçlar

ALDEFLUOR/ALDH,8-11multipl malignitelerde kök hücreleri izole etmek için tek bir belirteç olarak kullanılmıştır. ALDEFLUOR'u belirteç olarak kullanarak D5 ve SCC7 olmak üzere iki tümör modelinde kanser kök hücre ile zenginleştirilmiş popülasyonları belirledik. Murine melanom B16-D5 ve skuamöz hücreli kanser SCC7'de ALDEFLUOR+ hücreleri saptandı. ALDEFLUOR+ hücrelerinin kültürlü D5 ve SCC7 tümör hücre hatlarında sırasıyla yaklaşık %0,5 ve %5,2 katkıda bulunduğunu tespit ettik (Şekil 1). Kurulan tümörlerden yeni hasat edilen tümör hücreleri, ALDEFLUOR+ hücrelerinin varlığını doğrulamak için analiz edilmiştir. Şekil 1'dede gösterildiği gibi in vivo kurulan D5 ve SCC7 tümörlerinden ALDEFLUOR+ hücrelerinin sırasıyla %2,5'i ve %4,2'si vardı. Bu sıralanmış D5 ve SCC7 ALDEFLUOR+/ALDHyüksek popülasyonlarının tümörojenliği ve kendini yenileme kapasitesi, sırasıyla C57BL/6 ve C3H fareleri olan singeneik immün yetmezlik konağındadeğerlendirildi.

Hem hayvan çalışmalarında hem de klinik çalışmalarda nabız DC'lerine (H-TPDC) heterojen sıralanmamış tümör hücresi lysate kullandık5,6. CSC'lerin immünojenikliğini incelemek için, ALDHyüksek CSC ve darbeli DC'yi CSC-TPDC(Şekil 2)oluşturmak için CSC'lerin kalsatıyla izole ettik ve CSC-TPDC'nin tümör büyümesini önlemede yararlı bir etkisi olup olmadığını test etmek için H-TPDC'yi geleneksel bir kanser aşısı kontrolü olarak kullandık.

CSC-TPDC'nin neden olduğu koruyucu antitümör bağışıklığı inceleyerek CSC'lerin immünojenikliğini değerlendirdik. D5 modelinde, naif immün yetmecen fareler CSC-TPDC veya H-TPDC (aynı lisate: DC oranında) ile s.c aşılandı. Kontrol grupları salin (PBS) aldı. Son aşıdan bir hafta sonra, farelere intravenöz olarak(yani)sıralanmamış D5 tümör hücreleri ile meydan okundu ve akciğer metastazlarını numaralandırmak için akciğerler 3 hafta sonra hasat edildi. Tablo 1'degösterildiği gibi, PBS grubu ile karşılaştırıldığında, H-TPDC ile tedavi edilen fareler daha az akciğer metastazı geliştirdi. Daha da önemlisi, CSC-TPDC ile tedavi edilen fareler, yapılan her iki deneyde H-TPDC aşı grubuna göre önemli ölçüde daha az akciğer metastazlarına sahipti. SCC7 modelinde, normal C3H hayvanları sağ kanatta sırasıyla SCC7 CSC-TPDC veya H-TPDC ile s.c aşılandı ve ardından sol kanada sıralanmamış SCC7 tümör hücreleri s.c ile meydan okudu. PBS grubu ile karşılaştırıldığında, H-TPDC tümör büyümesine karşı mütevazı anti-tümör bağışıklığına neden oldu. Bununla birlikte, hem kontrol grubu hem de H-TPDC grubu ile karşılaştırıldığında CSC-TPDC ile tedavi edilen farelerde tümör büyümesinin önemli inhibisyonu vardı (p<0.05, Şekil 3). Bu sonuçlar, CSC'lerin tümör hücrelerinin zorluğuna karşı koruyucu bağışıklığı teşvik etmek için geleneksel sıralanmamış tümör hücrelerinden daha etkili bir antijen kaynağı olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Gözlemlenen CSC kaynaklı koruyucu antitümör bağışıklığının altında kalan mekanizmaları daha iyi anlamak için, deneylerin sonunda DC aşılarına maruz kalan hayvanlardan dalakları topladık. Dalak hücreleri daha sonra anti-CD3/CD28/IL-2 veya anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40 ile aktive edildi. Daha sonra sitokinlerin ve antikorların ekspresyonunun tespiti için kültür süpernatantları toplandı.  D5 CSC-TPDC veya SCC7 CSC-TPDC ile aşılanan hayvanlardan dalak hücreleri tarafından IFNφ ve GM-CSF'nin önemli ölçüde daha yüksek üretimleri vardı (Şekil 4). Ayrıca, D5 CSC-TPDC veya SCC7 CSC-TPDC ile aşılanan hayvanlardan toplanan LPS/anti-CD40 aktif dalak hücreleri ile D5 H-TPDC veya SCC7 H-TPDC ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde (p<0.05) daha yüksek IgG üretimi vardı. Bu antikorların sırasıyla D5 ve SCC7 CSC'lere bağlanarak yapıldığı tespit edildi ve bu tür bir bağlama, tamamlayıcı8varlığında CSC lizizine neden olabilir.

figure-results-1
Şekil 1. Kültürlü ve yeni hasat edilmiş taze murine D5 melanom ve SCC7 skuamöz hücreli tümörlerde ALDHFLUOR+/ALDHyüksek popülasyonları saptanmıştır. Negatif kontrol olarak spesifik bir ALDH inhibitörü olan 50 mmol/L DEAB ile tedavi edilen tümör hücreleri kullanıldı. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. 

figure-results-2
Şekil 2. Dendritik hücre bazlı kanser kök hücre aşılarının üretimi. CSC-TPDC ve H-TPDC'nin hazırlanması için kemik iliği türevi dendritik hücreler sırasıyla ALDHyüksek veya sıralanmamış tümör hücrelyatları ile nabızlandı. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. 

figure-results-3
Şekil 3. CSC lysate pulsed DC (CSC-TPDC) aşısı s.c daha etkili koruyucu antitümör bağışıklığına neden olabilir. SCC7 tümör modeli. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. 

figure-results-4
Şekil 4. CSC-TPDC ile aşılanan immün yetmsiz konakta daha güçlü sistemik hücresel yanıtlar.  Dalaklar H-TPDC veya CSC-TPDC aşısına tabi tutulan hayvanlardan hasat edildi ve belirtildiği gibi aktive edildi. Kültür süpernatantları daha sonra ELISA kullanılarak sitokin tespiti için toplandı. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. 

Tartışma

SCID fareleri gibi bağışıklık sistemi baskılanmış konaklar, konakçılarda adaptif bağışıklık eksikliği nedeniyle CSC'lerin immünolojik değerlendirmelerini önler. Bu çalışmada, hasta ayarlarını daha yakından taklit edebilecek, immün yetmeseent konakçılarda KSS'lerin immünojenikliğini değerlendirdik. Zenginleştirilmiş CSC'ler immünojeniktir ve lysates'leri seçilmemiş tümör hücresi lisat darbeli PCC'lere kıyasla aşı olarak DC'lere yüklendiğinde daha etkili tümör koruyucu bağışıklığa neden olabilir.  Mekanistik olarak, koruma, CSC-reaktif antikorların ve T hücrelerinin8'in seçici indüksiyonunun yanı sıra IFNφ ve GM-CSF gibi tip 1 sitokin üretimi ile sağlandı.

Dendritik hücre bazlı aşılar ve benimsenen T hücre transferi de dahil olmak üzere mevcut immünoterapilerin çoğu tümör farklılaşmış antijenleri hedeflemek için tasarlanmıştır. Bu farklılaştırılmış antijenleri ifade edemeyen CSC'ler bu immünolojik hedeflemeden kaçabilir. Buna karşılık, özellikle kanser kök hücrelerini hedeflemek için tasarlanan CSC aşısı, kanser hücrelerinin bu özel popülasyonunu yok edebilir ve böylece tümörün nüks ve metastazını önleyerek aşının terapötik etkinliğini artırabilir.

Hem kültürlü tümör hücrelerinde hem de taze hasat edilen tümörlerde, yüksek aldehit dehidrogenaz aktivitesine dayalı akış sitometrisi ile CSC ile zenginleştirilmiş popülasyon belirledik. Bu tür ALDHyüksek hücreleri, CSC-TPDC'leri oluşturmak için DC'yi nabızlamak için bir antijen kaynağı olarak kullanılacak akış sıralama ile izole edilebilir. Kültürlü tümör hücrelerinden izole edilen ALDHyüksek hücrelerinin ve yeni hasat edilen tümörlerin karşılaştırılmasının, anti-CSC bağışıklığının indüksiyonu açısından önemli bir fark göstermedi8. Bu sonuçlar, kültürlü tümör hücrelerinden veya klinik uygulama için yeni hasat edilmiş tümörlerden izole edilmiş CSC'leri kullanma potansiyelini ortaya koydu.

Klinik olarak alakalı olması için, bir aşının terapötik bir ortamda incelenmesi gerekir. Bu deneyler şu anda laboratuvarımızda yapılmaktadır.

Açıklamalar

STEMCELL Technologies, Açık Erişim yayın ücretlerini desteklemiştir.

Teşekkürler

Bu çalışma Michigan Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi'nin Will ve Jeanne Caldwell Endowed Araştırma Fonu ve kısmen NIH grant CA82529 ve Gillson Longenbaugh Vakfı tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ALDHEFLOUR KİTİKök Hücre Teknolojileri1700
Murine IL-4Pepro Tech214-14
Murine GM-CSFPepro Tech315-03
Fare GM-CSF ELISA KITBD Biosciences555167
OptiPrep Yoğunluk Gradyan OrtaSigma AldrichD1556
BD OptEIA TMB Substratlı Reaktif SetBD Biosciences555214
Ekipmanları
BD FACS Aria Hücre SıralayıcıBD Biosciences336834
KcjuniorBio-Tek Instruments176058

Kaynaklar

  1. Shafee, N., Smith, C. R., et al. Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors. Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).
  2. Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells. Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).
  3. Dallas, N. A., Xia, L., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).
  4. Yamauchi, K., Yang, M., et al. Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy. Cancer Res. 68, 516-520 (2008).
  5. Chang, A. E., Redman, B. G., et al. A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer. Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).
  6. Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines. Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).
  7. Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy. Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).
  8. Ning, N., Pan, Q., et al. Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity. Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).
  9. Ginestier, C., Liu, S., et al. CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts. J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).
  10. Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer. Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).
  11. Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ALDEFLUOR AnaliziAldehit DehidrogenazDendritik H cre zolasyonuT m r Lizat Haz rlamaAk SitometrisiELISA AnaliziKoruyucu Antit m r Ba klSitokin retimi

İlgili makaleler