Yöntem makalesi

Çinko Finger nükleazlar kullanılması Apolipoprotein C-III Knockout Tavşanlar Üretimi

20.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50957

⸱

18 Kasım 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Models for Translational Sciences and Therapeutics, Department of Internal Medicine, University of Michigan Medical Center, 2Department of Molecular Pathology, University of Yamanashi

Bu makalede

Özet

Gen hedefleme araçları son gelişme nakavtla üretimi (KO) tavşan mümkün kılar. Bu çalışmada, biz Çinko Parmak nükleazlardır (ZFN) kullanarak beş Apolipoprotein (Apo) C-III KO tavşan oluşturulur. Bu çalışma ZFN KO tavşan üretmek için son derece verimli bir yöntem olduğunu göstermiştir.

Özet

Apolipoprotein (Apo) C-III (apoCIII), plazma şilomikron (CM) yüzeyinde, çok düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL) ve yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) bulunur. Bu kabul edildiğini kardiyovasküler hastalıklar için plazma apoCIII oluşturmadığı risk faktörü (CVD) yüksek seviyeleri. Elevated plasma apoCIII düzeyi genellikle insulin direnci, obezite, ve hipertrigliseridemi ile ilişkilidir. Ancak, bu farelerde lipoprotein metabolizma birçok açıdan insanların bu farklı olduğunu kaydetti; ApoCIIIin lipid metabolizması ve CVD rolleri paha biçilmez bilgi apoCIII nakavt (KO) farelerde dahil transgenik fare modelleri elde edilmiştir. Şimdi yüksek plazma apoCIII doğrudan aterojeniktir olmadığı kadar bilinmemektedir. Biz tavşan insan lipid metabolizmasını ve ateroskleroz okuyan bir reasonablemodelfor olarak hizmet verebilir hipotezine dayalı bu çalışmada apoCIII KO tavşan geliştirmek için çalıştı. Çinko parmak nukleaz (ZFN) takımları hedefleme tavşan ApoCIIIgene önce embriyo mikroenjeksiyon için in vitro doğrulama tabi tutuldu. MRNA, 35 tavşan pronükleer aşamasında embriyoların sitoplazmaya enjekte edilir ve blastosist devlet mutasyon hızı değerlendirilmiştir. Tahlil edilmiştir on altı blastosist, hedefleme yerinde tatmin edici bir mutasyon oranı,% 50 (8/16), in vivo deneyler için Set 1 kullanımını destekleyen, elde edildi. Sonra, Set 1 mRNA ile 145 embriyolar microinjected ve 7 alıcı tavşanlarda bu embriyolar transfer. 30 gün doğumdan sonra, 21 kitleri beş PCR dizileme tahlillerin ardından apoCIII KO tavşan olarak teyit edildi dışarı olan, doğdu. KO hayvan oranı (# KO kitleri / toplam doğumlu)% 23,8 idi. Genel üretim verimliliği (5 kits/145 embriyolar transfer)% 3.4. Bu çalışma ZFN KO tavşan üretmek için son derece verimli bir yöntem olduğunu göstermiştir. Bu apoCIII KO tavşan lipid metabolizması içinde apoCIII rollerini incelemek için yeni kaynaklar vardır.

Giriş

Apolipoprotein (Apo) C-III (apoCIII), karaciğer ve bağırsakta esas olarak sentezlenen küçük bir O-glikosile edilmiş salgılama proteinidir. Bu, plazma şilomikron (CM) yüzeyinde, çok düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL) ve yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) bulunur. ApoCIII kardiyovasküler hastalık 1 için bir risk faktörü olarak kabul edilmiştir. ApoCIII kalıtsal eksikliği olan hastalar, düşük plazma trigliserid (TG) düzeyleri ve azalmış subklinik koroner arter ateroskleroz 2,3 var. Elevated plasma apoCIII seviyesi, diğer taraftan çoğu zaman, insülin direnci, obezite ve hipertrigliseridemi (HTG) 4,5 ile ilişkilidir.

Gene nakavt (KO) bir genin işlevini incelemek için güçlü bir araçtır. , Mutasyona uğramış insan popülasyonlarında gözlem ile uyumlu olarak, farelerde apoCIII genin nakavt bir plazma TG indirgenmesi ve yemek sonrası HTG 6 koruma yol açtı. ApoCIII Böyle olumlu bir rol çıktıApoE ve apoCIII hem de eksik farelerde de yemek sonrası hiperlipidemi 7 korunmaktadır gibi, Apolipoprotein E (ApoE) bağımsız olduğu. Bu apoCIII KO fare modelleri insanlarda apoCIII muhtemel işlevleri hakkında değerli bilgiler vermiş olsa da, bu farelerin lipoprotein metabolizması birçok açıdan insanlarda bu farklı olduğuna dikkat edilmelidir. Örneğin, fare plazması, kolesteril ester transfer proteini (CETP), VLDL, LDL taşıma katılan önemli bir enzim, ve HDL 8 yoksundur. Bu nedenle, daha fazla in vivo apoCIII fizyolojik rolünü anlamak için, uygun bir hayvan modeli geliştirmek için gereklidir.

Tavşan klasik bir model hayvan türü 9-11. Kısa bir gebelik dönemi (30-31 gün), büyük DKBKS (4-12/litter) sahiptir ve kapalı tesis rahatlıkla muhafaza edilebilir. Fareler ile karşılaştırıldığında, tavşan, insanlarda 10 filogenetik olarak yakındırlar. Önemli bir şekilde, gibi huBir adam ancak fareler aksine, tavşan LDL-zengin memeliler ve CETP'nin 10,12 önemli seviyeleri var. Ayrıca, insan ateroskleroz 13 görülen benzer lezyonlu kolesterol açısından zengin bir diyet ile uyarılan aterosiklerozun duyarlıdır. Bu nedenlerden dolayı, apoCIII KO tavşan insanlarda lipid metabolizması ve ateroskleroz ApoCIIIplay rollerini araştırmak için kendi fare göre daha iyi bir model olarak hizmet edebilir varsayıldı.

Gen üretimi (GTT) tavşan bir meydan okuma olmuştur transgenik hedef. Bu embriyonik kök hücrelerin (ESC) iletilmesi tohum çizgisi eksikliği ve tavşanlarda somatik hücre nükleer transferi (SCNT) son derece düşük verimlilik kaynaklanmaktadır. Ve SCNT başarılı bir domuz, koyun ve sığır, ancak tavşan gibi germlin iletilmesi EKH, eksik türlerde KO hayvanlar oluşturmak için uygulanmıştır, oysa ESC, GTT fareler üretmek için birincil araçtır. En son çinko parmak Nükleaz (ZFN), Transcription Activator-Like Efektör Nükleazlar (TALEN) 14, ve RNA Rehberli Endonuclease (RGEN) 15 genom düzenlemek için güçlü araçlar ortaya çıktı. Bu nedenle "moleküler makas" olarak adlandırılan bu nükleazlar, hedef genin bir işlevsel KO yol ya da genomundaki spesifik bir yerdeki bir DNA sekansı entegre etmek için kullanılabilir genomu çift kordonlu kırılmaları (DSB) üreten verimlidir türlerin 16 bir dizi. 2011 yılında, ZFN teknolojiyi adapte ilk arasında, biz SCNT 17 için bu hücreleri kullanarak sonra bu yaklaşım ve başarılı oluşturulan PPARy KO domuzlar aracılığıyla peroksisom proliferatörü aktive reseptör gama (PPARy) KO domuz hücreleri üretilir. Aynı yıl, verimli immunglobulin gen bozulması ve aynı zamanda ZFN kullanarak tavşanlarda hedeflenen yedek 18 bildirilmiştir.

(Şekil 1 e bakınız ZFN Set 1 kullanılarak PCR dizileme ile teyit edildiği gibi, bu çalışmada beş apoCIII KO tavşan oluşturulan . akış şeması gösterim için). Bu hayvanlar lipid metabolizması içinde apoCIII rollerini incelemek için yeni kaynaklar vardır.

Protokol

Tüm hayvan bakım, bakım ve kullanım prosedürleri Michigan Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı gözden ve Üniversite Komisyonu tarafından kabul edildi.

1.. ZFN Tasarım ve Seçimi

  1. Üreticiye, ilgi konusu genin (örneğin tavşan apoCIII) genomik dizi bilgisi kaynağı. ZFN puanlara dayalı deneyler için ZFN set (ler) seçin.

2. Tavşan Embriyo Koleksiyonu

  1. Superovulate cinsel (6-18 ay) olgunlaşmış Yeni Zelanda Beyaz (NZW) ilk iki enjeksiyon, sonraki iki enjeksiyonlar ve 6 mg boyunca 5 mg ila 3 mg arasında bir doz ile FSH deri altına (sc) enjeksiyon iki kere / gün dişi tavşan son iki enjeksiyonlar için.
  2. Ovulasyonu uyarmak için ilk FSH enjeksiyondan sonra 72 saat sonra 200 IU hCG tek bir intravenöz (IV) enjeksiyonu uygulayın. HCG enjeksiyonundan hemen sonra bir erkek tavşan ile süperovulasyonu kadın Mate.
  3. Euthanize sodyum pentobarbital ile süperovulasyonu donör tavşanlar (150 mg / kg, iv) 16-18 saat sonrası tohumlama (psi).
  4. Dikkatli tüm Fallop tüpleri ve yumurtalıkların yapısı toplayarak yumurtalığa ampullae kurtarın.
  5. HEPES, 10 ml manipülasyon ortamı ile yıkayın yumurta kanalının her bir TCM 199 yumurta kanalı ve rahim ucundan orta enjekte edilerek,% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş tampon. Petri kabı için yumurta kanalı yumurtalık uç açılışında kızarmış orta toplayın.
  6. Gözlemlemek ve kızarmış ortamda kurtarıldı embriyolar tespit manipülasyon ortamda embriyolar üç defa yıkamak, havada 38.5 ° C'de manipülasyon ortamda tutmak, ve döllenme oluşumu için bir stereo mikroskop altında onları gözlemlemek. Pronükleer aşamasındaki embryo mikroenjeksiyon için hazırlanın 19-21 saat psi

3. ZFN mRNA hazırlanması

  1. RNAse içermeyen 0.1X TE (1 mM Tris-Cl pH içinde tekrar süspansiyona almadan önce elde edilen mRNA arındırın8.0, 0.1 mM EDTA). Konsantrasyonunu ölçmek ve kullanılana kadar -80 ° C 'de mRNA saklayın.
  2. 10 ul şişelere ZFN çift (pH 7.5 'de 1 mM Tris-CI, 0.1 mM EDTA içinde 4-10 ng / ml), bir kısım kodlayan mRNA hazırlayın. Kullanım için hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın. Mikroenjeksiyon önce, RNA flakon (ler) çözülme ve buz üzerinde tutmak.

4. Embriyo Mikroenjeksiyon

  1. Uzaklaştırılmıştır ortam bölmesine sahip bir 1-çukurlu slaytı üzerinde manipülasyon aracının bir 5 ul damla yerleştirerek mikroenjeksiyon platformu hazırlayın. Isıtılmış mikroskop sahnede mineral yağ ve yer ile orta damla örtün.
  2. Mikromanipülatör tutucu kol içine tutarak pipet (120 mikron çapında) yerleştirin ve manipülasyon orta damla içine yerleştirin.
  3. Bir mikropipet çektirmesi cihazı borosilikat cam kapiller tüplerin ısıtılması ve çekerek enjeksiyon mikropipetler Üretiyor. Enjeksiyon pipet enjekte edilecek olan mRNA yerleştirin.
  4. Bir mikropüskürtücü bağlı olduğu basınçlı hava kaynağı açın.
  5. Manipülasyon orta düşüş içine mikromanipulatöre pozisyona onu koydum, enjeksiyon tutucu içine enjeksiyon pipet yerleştirin.
  6. Kur, aşağıdaki parametreler ile önerilen mikropüskürtücü: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, pl 1-5 arasında bir enjeksiyon hacmi ile sonuçlanır Injtime = 1 sn.
  7. Nazikçe tutma pipet karşı dokunarak enjeksiyon pipet ucu açın.
  8. Platformda mikromanipülasyon damlasına embriyolar (30-50) aktarın. Bir embriyo yakalama ve enjeksiyon iğnesi, embriyo ve x-ekseni boyunca tutma pipet hizalamak için tutma pipet kullanın.
  9. 400X büyütme altında, embriyo yoluyla enjeksiyon pipet önceden. Çekirdeği önlemek için dikkatli olun. Plazma zarı delinir sonra, basın ayak pedalı enjekte etmek. Enjeksiyonundan sonra, iğneyi embriyo bırakın. Kalan tüm em için işlemi tekrarlayınbryos.
  10. Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), temel amino asitler (EAA), 1 mM L-glutamin, 0.4 mM sodyum piruvat ve% 10 ile takviye edilmiş Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) oluşur embriyo kültür ortamı içinde, enjekte edilen embriyolar üç kez yıkayın FBS.
  11. Bu cerrahi senkronize bir alıcı NZW dişi tavşan (adım 5.1) de yumurta kanalına aktarılır önce, 1-2 saat boyunca hava içinde% 5 CO2 içinde 38.5 ° C 'de embriyolar inkübe edin. In vitro tahliller ya da doğrulama için kullanılan daha önce Alternatif olarak, kültür embriyoları da blastosist aşamasına kadar.

5. Embriyo Transferi

  1. Yaklaşık ağırlığında sağlıklı 5-12 ay yaşlı bir kadın NZW tavşan, seçin. Alıcı hayvan olarak 4,0-5,0 kg. Gonadotropin (adım 2.2) verici hayvan (lar) için hCG enjeksiyonu bu aynı zaman noktasında alıcıya Hormon (GnRH) enjeksiyon kas içinden (im, 50 mcg / ml, 0.3 ml / hayvan) Releasing uygulayın.
  2. Mikroenjeksiyon tamamlanmasından sonra, embriyo transferi (GnRH, enjeksiyondan sonra normal olarak 16-24 saat) için alıcı tavşan hazırlar. 10-40 mg / kg ketamin (im) ile tavşan uyutmak ve / veya buharlaşmış izofluran (% 2-4), inhalasyon yoluyla. Steril oftalmik merhem uygulama tarafından aşırı kurutma tavşan gözlerini koruyun. O, yani tamamen bilinçsiz kadar hayvan gözlemlemek. ayak pedi, yeterli anestezi bir göstergesidir pedal refleksi eksikliği kontrol etmek için kullanılan sıkma, pedal refleksleri yanıt vermiyor.
  3. Tavşan karın Tıraş, antiseptik solüsyon, ardından antiseptik fırçalayın ile yıkayın ve steril gazlı bez sünger ile traş bölgeyi silin.
  4. Steril koşullar altında ameliyat, ameliyat boyunca alıcı tavşan yaklaşık her 15 dk hayati belirtileri kaydedebilirsiniz.
  5. Embriyoların mevcut sayısına bağlı olarak, bir alıcı hayvana, 10-25 embriyo transfer edin.
  6. Sonundacerrahi işlemler, kaplamalı emilebilir sütür ile kas tabakası kapatın. Emilebilir sütür kullanarak subkütiküler sütür ile veya nonabsorable dikiş (örn. monofilament naylon veya benzeri) kullanılarak basit bir kesintiye cilt dikişlerle deri dikin.
  7. Hayvan sıcak tutmak ve sternum yatma ulaşılana kadar onu izlemek.
  8. Günlük hayvan izleyin. Hayvan bakımı için veteriner yönergeleri izleyin. Ağrı kesici ve / veya veteriner hekim tarafından gerekli saptandığı takdirde ateş günlük sonrası çalışmasını azaltmak için meloksikamı (sc 1.0 mg / kg) yönetmek.
  9. Yaklaşık 10-14 gün sonrası operasyonda nonabsorable cilt sütür çıkarın.

6. ZFN Bağlı Gene bozulması Saptanması

  1. In vitro doğrulama için, in vitro kültürlenmiş embriyolar ile ilgili genotipleme gerçekleştirin. 5 ul NP-40 çözeltisi (1% NP-40 ve 1 ug morula / blastosist aşamalarına geliştirilmiş / ml Taq Tampon Proteinaz K Lyse bireysel embriyolar) 55 ° C de 0.5-1 saat, ve 95 ° C'de 10 dakika boyunca
  2. Yavruların genotip için, yenidoğan kitleri kulak deri örnekleri toplamak, genomik DNA ayıklamak ve PCR dizileme için şablon olarak kullanabilirsiniz. Kanamayı durdurmak ve rahatsızlığı azaltmak için toplandıktan sonra örnekleme alanına Kwik-Dur uygulayın.
  3. LA Taq-ve ZFN hedef bölge üst akışında yer alan (5'-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 ') ve (5'-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3 alt') vardır PCR primer çifti kullanılarak PCR için bir şablon olarak aşama 6.2 ya da 6.3 'dan erimesine kullanın .
  4. PCR ürünleri arındırın ve dizileme primeri (5'-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 ') ile sırası.
  5. Hedefleme sitenin etrafında sırası diyagramı çift eğri bakarak mutant örnekleri belirlemek. "Pozitif" olarak çift eğrileri ile olanları etiketleyin.
  6. , TA klonlama vektörü içine "pozitif" PCR ürünleri Clone 10-20 klon, sekansı insertler almak ve t çevresinde mutasyonları teyitargeting sitesi.

Sonuçlar

ZFN çiftleri vitro doğrulama konusunda
On altı ZFN çifti ilk olarak tasarlanmıştır. Set 1 'e ait hedef sekans bozulması tavşan apoCIII ekson 2 (Şekil 2A) bulunmaktadır. Üç çift (Set 1, 2 ve 3, Şekil 2A) seçilir, ve bunların ZFN aktiviteleri (Şekil 2B) belirlemek için maya MEL-1 raportör deneyine tabi tutulmuştur. 1 Set 2 (196.9%) ve Set 3 (177.8%) daha yüksek ve seçim eşiği (iç pozitif kontrolün yani% 50) daha yüksek 224,2% bir ZFN puan sahiptir ayarlayın. Bu nedenle in vitro Set 1 doğrulama deneyler için seçilmiştir.

Belirli bir dizi iç doğrulama kriterlerine göre in vitro embriyo doğrulama, geçmek için% 10 veya daha yüksek embriyolar pozitif oranları neden gerekiyor. Set 1 'e ait mRNA (5 ug / ml) 35 pronükleer aşama tavşan embriyolar (Şekil 3A' sitoplazması ile enjekte edildi/ Strong>). Mikroenjeksiyon tedavisi (n = 31) olmadan temizlendi embriyolar kontrol grubu olarak kullanıldı. Mikroenjeksiyon grubun on sekiz embriyo on altı dizilenmiştir olan, D5 BL evresine kadar gelişti ve sekiz (BL # apoC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, Şekil 3B, kırmızı altı çizili) gösterilir mutasyona uğramış hedefleme sitede (siyah kutulu, Şekil 2B, üst satır, apoC3wt.seq) de diziler. Mikroenjeksiyon grubunda (% 51.4) ve BL oranı microinjected embriyoların biraz bozulmuş gelişimsel yetkinliği gösteren kontrol grubuna (% 77.4), daha düşüktür. Mikroenjeksiyon embriyoların pozitif mutasyon oranı seçimi eşikten daha yüksek% 50.0 (8/16), (örneğin,% 10) 'dir. Bu sonuçlar Set 1 tavşan apoCIII hedeflenmesi yerinde mutasyonlar ikna etmek için etkili bir ZFN küme olduğunu ortaya koydu. Bu nedenle Set 1 apoCIII KO tavşan in vivo üretimi için seçildi.

ApoCIII KO tavşan üretimi
MRNA of ZFN Set 1 tavşan pronükleer evresindeki embriyoların sitoplazmaya mikroenjeksiyon ve 7 psödo-gebe alıcı tavşanlarda (Şekil 4A), 145 mikro-enjekte embriyo transfer edilmiştir. ZFN mikroenjeksiyon olmadan taze kızardı embriyolar (n = 75) alıcılara transfer edildi (n = 6) kontrol grubu olarak. Gebeliğin 30 gün sonra, 21 kitleri microinjected grubunda doğmuştur. PCR pozitif KO dizileme kiti (Şekil 4B) ve beş (apoC3-R1, R9, R11, R12 ve R16) tespit edilmiştir. Oran kontrol grubunda (22/75)% 29.3 iken, toplam vadeli kitleri / toplam embriyo olarak hesaplanan dönem faizi,% 14.5 (21/145) 'dir. Toplam KO kitleri / toplam terim olarak hesaplanan KO oranı% 23.8 (5/21). Bir KO kiti (apo-R16) beş gün postpartum (20.0%, 1/5) öldü. Hedefleme yerinde indelsat iki girmeler ve üç silmeleri içerir, bunlar sırasıyla tavşanlar # R1, R9, R11, R12, ve R16, (Şekil 4B) süreyle, 1, 1, Δ20 ve Δ21 areΔ1.

Bi17, daha önce tarif edildiği gibi oinformatics analizi, 1 sırasını ayarlamak için, 7 veya daha az eşleşmeme durumuyla birlikte dışı olası hedefleri ZFN tespit etmek için kullanıldı. Sadece bir kromozom 14 üzerinde bulunan, olası hedef dışı sitesi öngörülen, 7 uyumsuz baz puan ile tespit edilmiştir. PCR tahlili Kurucu hayvanların hiçbirinde hedef dışı etkinlik tespit edildi.

Tartışma

Bu çalışmada, beş apoCIII KO tavşan ZFN teknolojisi kullanılarak oluşturulmuştur. Daha önce tavşanların GTT üretiminin tek raporu da ZFN teknolojisi 18 kullanılır. Bu çalışma ZFN etkili tavşanlarda genlerin hedef için yararlı olduğunu doğruladı.

Bu çalışmada, tavşanlarda önceki ZFN raporda (% 30.8, 16/52) 18 ile karşılaştırılabilir olduğunu ve bu rapor transgenik oranı (pozitif kitleri / toplam doğumlu) is23.8% (5/21), zebra balığı 19, fare 20, 21 sıçan ve domuz 17 dahil olmak üzere diğer hayvan türlerinin içinde ZFN kullanarak. Bu oran normalde% 5-20 aralığında düşüş birçok geleneksel transgenik tavşan üretim çalışmaları, oranları daha yüksek aslında. Örneğin, geleneksel DNA mikroenjeksiyon yoluyla ürün apoCIII transgenik tavşan için bir çaba, Ding ve diğ. (% 5.6) 22 doğumlu 54 yavruların üzerinden 3 pozitif kurucuları elde.

Önceki bulguları ile uyumlu olarak, hedef bölgelerde mutasyon (beş KO tavşanlarda 1-21 arasında) bazların farklı sayıda oluşan silmeler veya eklemeler dahil, değişkendir. Kurucu hayvanların spesifik sekans bilgilere göre, bu (Δ1, 1, 1, ya da Δ20 mutasyonlar içerenler, yani.) ApoCIII fonksiyon kaybı olacağını en az dört tahmin edilmektedir. Bu mutasyon yedi amino asitlerin tek nedeni kaybı tahmin, ama bir okuma çerçevesi kayma olmadığı gibi hayvansal R-16 Δ21 ile, fonksiyonel kaybı görünmeyebilir. Sonuç olarak, deneyler, bu fenotip Kurucu hayvan gerçekten apoCIII fonksiyonlarının kaybı göstermek olup olmadığını belirlemek için gereklidir.

Bu çalışmada üretilen beş KO tavşanların hiçbirinde bialelik modifikasyonları içerir. İlginç olarak, bu aynı zamanda önceki ZFN tavşan raporda durumdur. Bunun aksine, ZFNs α1 ,3-galaktosıltransferaz hedeflerken, domuz uygulanmıştırHücreler, 23 knockouts biallelic Tek adım yaratma mutasyonların yaklaşık üçte biri ile, 7-46% arasında değişmekteydi tek bir alel hedefleme frekansı. TALEN domuz fibroblast hücrelerine uygulandığında Buna uygun olarak, bialelik modifikasyonlar toplam pozitif klonların 14 arasında, yaklaşık% 15-40 bulundu. Bu, bu çalışmada bialelik KO tavşan oluşturmak için başarısızlık hedefleme nükleaz göre genin bu kapasite için bir tür fark (yani tavşan genel domuz) gösterebilir mümkündür. O, bu projede üretilen KO tavşanların sayısının nispeten küçük olduğundan bu basitçe olduğunu, ancak daha olasıdır. Biz ZFN ZFN göre GTT tavşan üretiminin bir potansiyel avantaj olarak kabul edilmelidir, tavşanlarda bialleic mutasyonlar, üretme yeteneğine sahip olduğuna inanıyoruz. Diğer deneyler tavşanlarda ZFN böyle kapasitesini doğrulamak için gereklidir.

Sonuç olarak, mevcut çalışma gösteriyor ki ZHedefleme yaklaşımı FN dayalı gen KO tavşan üretiminde etkilidir. Özellikle,% 23.8, tatmin edici bir transgenik oranı ile beş apoCIII KO tavşan oluşturulur. Bu hayvanlar gelen fare modellerinde göre insanlarda lipid metabolizması üzerindeki bu proteinin rolü hakkında daha anlamlı bilgi sağlamak inanılmaktadır. Biz ZFN dayalı gen hedefleme, yanı sıra Yeten ve RGEN gibi diğer nukleaz tabanlı teknolojiler tahmin, nonmurine hayvanlarda önemli ölçüde çeşitli insan hastalıklarının incelemek için yeni bir hayvan modellerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.

figure-discussion-1
Şekil 1. ZFN teknolojisini kullanarak nakavt tavşanların üretim akış şeması. ZFN teknolojisi kullanılarak KO tavşan üretimi ilgi konusu genin seçimi ile başlar. Dizi bilgileri ZFN bebekler tasarlanmıştır, Resim ve subj edilirSeniyye maya içi doğrulama tabanlı. Kontrol noktası (CP) 1 (MP-1) olarak, in-house doğrulama (dahili pozitif kontrolün% 50 ya da daha yüksek) geçirilen yalnızca bebekler seçimi için kullanıcılara sağlanacaktır. Hiçbir setleri CP-1 geçerseniz, ek sırası etkili ZFN setleri tasarımı için gerekli olabilir. Bir in vitro embriyo doğrulama seçilen ZFN set seçilen siteler (CP-2) mutasyonlar neden sağlamak için takip edilir. O (in vitro embriyoların> =% 10 mutasyon oranları) CP-2 geçerse ZFN set (ler) sadece kullanılacaktır. CP-2 de başarısızlık ZFN setleri bir yeniden gerektirir. Embriyo donörler hazırlanacak ve pronükleer sahne embriyolar doğrulanmış ZFN setleri ile microinjected olacak. Bu microinjected embriyolar senkronize embriyo alıcılara transfer edilecektir. Bir aylık gebelik döneminden sonra, yenidoğan (CP-3) genotyped edilecektir. Yenidoğanların hiçbiri pozitif iseniz, ek mikroenjeksiyon yapılacaktır. Bu n varsayarak, CP-2 projesinin başlangıcından itibaren 2-3 ay sürersürecinde o hatası. Bu, CP-3 CP-2 ek 2-3 ay sürer. Bu nedenle ZFN teknolojisini kullanarak bir 4-6 aylık bir zaman dilimi içinde bir nakavt tavşan üretmek mümkündür. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

figure-discussion-2
Şekil 2. ZFN tasarımı. Üç ZFN setleri (2 Set 1 ve 3) Exon 1 veya tavşan apoCIII (A) Ekson 2 farklı hedefleme dizileri tasarlanmıştır. Üç set ZFN aktivitelerini belirlemek için maya MEL-1 raportör deneyine tabi tutulmuştur. Üreticinin protokollerine uygun olarak, üreticinin iç pozitif kontrolün>% 50 aktivite gösterdiği ZFNs in vitro ve in vivo deneylerde genom düzenleme için yararlı olarak kabul edilmektedir.ZFN faaliyetleri dolayısıyla 1 Bu çalışmada seçilen Set, Set 1 için 224,2%, Set 2 için 196,9 ve% Set 3 (B) için 177.8% idi. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

figure-discussion-3
ZFN Şekil 3.. In vitro embriyo doğrulama. Set 1 'e ait mRNA (5 ug / ml) 35 pronükleer aşama tavşan embriyolar (A) sitoplazmaya ile enjekte edildi. Mikroenjeksiyon tedavisi (n = 31) olmadan temizlendi embriyolar kontrol grubu olarak kullanıldı. BL gelişme oranı kontrol grubunda% 77.4 idi. Mikroenjeksiyon grubunda, BL oranı% 51.4 idi. PCR dizilmesine tabi 16 BLS, 8 (% 50) pozitif olarak tespit edildi, Set 1 belirten TARGE mutasyonlar ikna etmek için etkili bir ZFN kümesidirting sitesi (B, apoc3wt.seq, siyah-kutulu) tavşanlarda apoCIII arasında. Mutasyonları içeren Bls BL # apoC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, ve 17 (B, kırmızı altı çizili). Kalan BLS (# apoC-2, 6, 9, 10, 12, 14 ve 16) hedefleme yerinde mutasyon yok. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

figure-discussion-4
Şekil 4. ApoCIII KO tavşanların üretimi. ZFN Set 1 mRNA ile mikroenjeksiyon yüz kırk beş embriyo 7 psödo-gebe tavşan alıcı (A) transfer edildi. ZFN mikroenjeksiyon olmadan taze kızardı embriyolar (n = 75) alıcılara transfer edildi (n = 6) kontrol grubu olarak. Deney grubundaki toplam vadeli kitleri / toplam embriyo olarak hesaplanan dönem faizi 14 olduğunu0,5% (21/145), oranı kontrol grubunda (22/75)% 29.3 ise (A). Mikroenjeksiyon gruptan beşi (R1, R9, R11, R12, ve R16) doğan 21 kitleri dışında dizilemesi PCR (B) sonra, pozitif kitleri KO tespit edilmiştir. Hedefleme yerinde indels iki girmeler (R9 ve R11 hem 1) ve üç silmeleri (sırasıyla Δ1, Δ 20, R1, R12 ve R16 için Δ 21) içerir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe tarafından finanse edildi (HL105114, HL088391, NS066652 ve yec için HL068878), Amerikan Kalp Derneği (JZ Milli Scientist Kalkınma 0835237N). YEC mali Michigan Tıp Merkezi Üniversitesi (UMMC) Kardiyovasküler Tıp donatılmış Frederick Huetwell Doçent olarak desteklenmektedir. Bu çalışma Translational Bilim ve UMMC de Therapeutics (CAMTraST) Gelişmiş Modelleri için Merkezi tarafından desteklenen Çekirdek Hizmetleri kullanılmaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
APOC3-ZFNSigma AldrichCSTZFNY-1KTHedef Gen: APOC3, Lot Numarası: 12201118MN
mMESSAGE kitiInvitrogenAM1344MmRNA sentezi
MEGAclear Kit İnvitrojenAM1908MmRNA saflaştırması
Folikül uyarıcı hormonBioniche Yaşam BilimleriFolltropin-VEmbriyo donör tavşanları tedavi etmek
İnsan koryonik gonadotropinİntervetChorulonEmbriyo donör tavşanları tedavi etmek
Gonadotropin salgılatıcı hormonProspecbioHOR-255Embriyo alıcı tavşanları tedavi etmek
Earle'ün Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) Thermo Fisher ScientificSH30029.02Embriyo kültürü, baz ortamı
MEM (esansiyel olmayan amino asit)Sigma AldrichM7145Embriyo kültürü,
takviyeler BME AMİNO ASİTLERİ çözeltisiSigma AldrichB6766Embriyo kültürü, takviyeler
GlutaminGibco25030-149Embriyo kültürü, takviyeler
Sodyum piruvat ve nbsp;Gibco11360-070Embriyo kültürü, takviyeler
Fetal sığır serumuSigma Aldrich12003CEmbriyo kültürü, takviyeler
HEPES tamponlu TCM 199 & nbsp;Gibco12350039Embriyo manipülasyon ortamı
Kuluçkamakinesi EppendorfGalaxy 170Embriyo kültürü ekipmanı
Mikromanipülatör ve nbsp;EppendorfTransferMan NK 2Embriyo manipülasyon ekipmanı
Mikropipet çektirme SutterInstruments Inc.P-1000Embriyo manipülasyon ekipmanı
Mikroenjektör ve nbsp;Tritech ResearchMINJ-DEmbriyo manipülasyon ekipmanları
Borosilikat cam kılcal tüpler ve nbsp;Dünya Hassas Aletler A.Ş.TW100F-6Embriyo manipülasyon kaynağı
Euthasol (pentobarbitol sodyum)Virbac AH, Inc.ANADA # 200-071Embriyo donör tavşanların ötenazi

Kaynaklar

  1. Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor. Clinical Science. 114, 611-624 (2008).
  2. Pollin, T. I., et al. A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection. Science. 322, 1702-1705 (2008).
  3. Ginsberg, H. N., et al. Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).
  4. Cohn, J. S., et al. Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia. Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).
  5. Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).
  6. Maeda, N., et al. Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia. The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).
  7. Jong, M. C., et al. Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice. Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).
  8. James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. Cardiac physiology in transgenic mice. Circ. Res. 82, 407-415 (1998).
  9. Duranthon, V., et al. On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools. Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).
  10. Fan, J., Watanabe, T. Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models. Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).
  11. Shiomi, M., Ito, T. The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe. Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).
  12. Morehouse, L. A., et al. Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits. Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).
  13. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).
  14. Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  15. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).
  16. Petersen, B. Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production. Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).
  17. Yang, D., et al. Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning. Cell Research. 21, 979-982 (1038).
  18. Flisikowska, T., et al. Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases. PLoS ONE. 6, e21045(2011).
  19. Foley, J. E., et al. Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases. Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).
  20. Carbery, I. D., et al. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186, 451-459 (2010).
  21. Mashimo, T., et al. Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases. PLoS ONE. 5, e8870(2010).
  22. Ding, Y., et al. Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII. Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).
  23. Hauschild, J., et al. Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ApoCIII Nakavt Tav anlarEmbriyo MikroenjeksiyonuPron kleer Evre EmbriyolarGen HedeflemeZFN mRNA EnjeksiyonuBlastokist Mutasyon OranPCR Sekanslama AnalizleriAl c Tav an TransferiNakavt Hayvan Oran
Çinko Finger nükleazlar kullanılması Apolipoprotein C-III Knockout Tavşanlar Üretimi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.