Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Özet

Yüksek kaliteli toplam RNA, %70 etanolde Azure B ile omurilik bölümlerini lekelendikten sonra lazer yakalama mikroseksiyonu ile fare omurilik motoru nöronlarının hücre gövdelerinden hazırlanmıştır. RNA-seq ve qRT-PCR tarafından aşağı akış RNA analizine izin vermek için 3.000-4.000 motor nörondan yeterli RNA (~40-60 ng) elde edilir.

Özet

İlgi çekici hücrelerden yüksek kaliteli RNA hazırlanması, hücre tipleri arasındaki transkripsiyon farklılıklarının veya sağlık ve hastalıkta aynı hücre tipi arasında veya farmakolojik tedavileri takiben kesin ve anlamlı bir analiz için kritik öneme sahiptir. Omurilikte, birçok nörolojik ve nörodejeneratif hastalıkta ilgi çekici olan motor nöronlardan böyle bir hazırlık, motor nöronların toplam hücre popülasyonunun% <10'unu temsil etmesi nedeniyle karmaşıktır. Lazer yakalama mikrodisksiyonu (LMD) bu sorunu gidermek için geliştirilmiştir. Burada, endojen ve eksojen RNazların RNA hasarını önlemek için fare omuriliğini hızlı bir şekilde kurtarmak, dondurmak ve bölümlemek için bir protokol açıklıyoruz, ardından endojen RNaz'ı inhibe ederken motor nöronları tanımlamak için % 70 etanolde Azure B ile boyama. LMD daha sonra boyalı nöronları doğrudan guanidin tiyosiyanat lizis tamponuna yakalamak ve RNA bütünlüğünü korumak için kullanılır. Toplam RNA'yı kurtarmak ve bütünlüğünü ölçmek için standart teknikler kullanılır. Bu malzeme daha sonra transkriptlerin RNA-seq ve qRT-PCR tarafından aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Giriş

Birden fazla farklı hücre tipinden oluşan memeli dokularında, lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LMD) enstrümantasyonunun ortaya çıkması, RNA veya protein düzeyinde analiz için belirli bir hücre tipi seçme imkanına sahiptir. Şu anda, amplifikasyon ve yeni nesil sıralama teknikleri, RNA'ların göreli seviyelerinin değerlendirilmesi ve çeşitli ekli formların tanımlanması da dahil olmak üzere transkriptomun nispeten kapsamlı bir envanterini elde etmek için birkaç bin hücreden toplam RNA havuzunun kullanılmasını sağlar. Bugüne kadar, birkaç bin hücrenin proteomik analizleri sadece daha bol türler aracılığıyla uzanacaktır. Örneğin, 3.000-4.000 motor nöron hücre gövdesinden (gösterilmeyen) en bol proteinlerin 1.000'< tespit ettik ve Zhu ve iş arkadaşları yakın zamanda ~15.000 tümör hücresinden 2.665 protein tanımladık¹. Bununla birlikte, kütle spektrometresinin daha fazla gelişmesiyle, bu tür analizlerin çok daha derinliğe uzanması muhtemeldir.

Burada, farelerin omuriliklerinden motor nöron hücre cisimlerinin LMD'si için kullanılan özel bir protokol ve ardından RNA hazırlanması sunuyoruz. Bu protokol, presemptomatik transgenik mutant süperoksit dismutaz (SOD)1 amyotrofik lateral skleroz (ALS) farelerinin motor nöronlarından RNA'ları hem RNA-seq hem de qRT-PCR doğrulama²ile vahşi tip SOD1 transgenik suşundan hazırlanan RNA'larla karşılaştırma bağlamında kullanılmıştır. Özellikle, omurilikteki gri maddenin ön boynuzundaki motor nöronlar, astrosit denizi ile çevrili toplam hücre popülasyonunun% <10'unu oluşturur ve bu nedenle transkripsiyonal profilleri tüm kordonun çalışmalarından kolayca arındırılamaz. Lazer yakalama yaklaşımı, bu hücrelerdeki RNA ekspresyonunu analiz etmek için idealdir, fizyoloji kısa intra kardiyak salin perfüzyonunu takiben kordonu hızla çıkararak ve dondurarak korunur. Motor nöron somata büyüktür ve bu nedenle kolayca tespit edilebilir, burada nöronlar için güçlü bir benzeşime sahip bir boya kullanarak³. Ek olarak, bu boyutta, bu hücreler yakalanan hücre başına nispeten büyük miktarda RNA sağlar. Kullanılan prosedür, aşağıda ayrıntılı olarak açık olarak açıklanmış olduğu gibi, diğer nöronal hücre tiplerinin yanı sıra, özellikle boya boyama teknikleri veya antikor boyama ile tanımlanan diğer hücre tiplerini elde etmek için kolayca ayarlanabilir.

Protokol

Burada farelerin anestezisi, ötanazisi ve kardiyak perfüzyonu için açıklanan işlemler Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir protokol kapsamında gerçekleştirildi.

1. RNase içermeyen Enstrümanların ve Çözümlerin Hazırlanması

1. RNase, tezgah üstleri, mikropipettes ve araştırmacı dahil olmak üzere tüm laboratuvar yüzeylerinin ortak bir kirleticisi.
   1. Eldivenleri sık sık değiştirin veya RNA'ları arındırıcı bir çözelti ile düzenli olarak silin.
   2. Paslanmaz çelik diseksiyon aletleri ve cam eşyalar, 1 saat veya daha uzun bir süre >200 °C'de ısıtılarak RNase içermeyen hale getirilebilir. Not: Buhar sterilizasyonu RNase'yi yok etmez. Alternatif olarak, bir RNase arındırıcı çözelti ile silin, ardından RNase içermeyen% 70 etanol ve hava kuru.
   3. Tezgah üstlerini, diğer laboratuvar yüzeylerini ve mikropipetörleri RNase dekontaminasyon çözeltisi ile, ardından RNase içermeyen% 70 etanol ile silin. RNA kurtarma ve analizi için belirli bir laboratuvar tezgahı veya çalışma alanı belirleyin. Not: Pipetlerin millerini silmeden önce uç ejektörlerini çıkarın ve mümkünse bırakın.
   4. Üretici tarafından RNase içermeyen olarak onaylanmış tüpler, mikrosantrifüj tüpler, pipetler ve mikropipette uçları kullanın. Çok düşük bağlayıcı uçların ve mikrotüplerin kullanılması önerilir. Mümkünse, bu bileşenlerin yeni açılmış kutularını veya torbalarını kullanın ve bunları genel laboratuvar kaynağından ayrı tutun.
   5. Ticari kaynaklardan RNase içermeyen çözümler [Dulbecco'nun kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS (PBS), etanol, RNaz içermeyen %70 etanol] elde edin. Her deney için yeni açılan şişeleri kullanın.
2. Azure B boyasının kaynağı, bozulmamış RNA'nın başarılı bir şekilde kurtarılması için kritik öneme sahiptir. Değerli numuneleri boyamaya ve toplamaya adamadan önce her bir boya grubunu test edin. Deneyimsel olmayan bir hayvandan birkaç bin nöron toplayın, RNA hazırlayın ve 8,5'in üzerinde sürekli olarak RIN sayıları üreten bir tane bulmak için aşağıda açıklandığı gibi RNA bütünlüğünü belirleyin.
   1. Azure B boyayı (%1, wt/vol) RNase içermeyen %70 etanolde çözün, tipik olarak 50 ml santrifüj tüpünde 30 ml etanolde 0,3 g. Bir gecede RT'de veya tüm parçacıklar çözünene kadar bir rocker üzerinde iyice karıştırın. Bu çözeltinin bir tüpü, boyama yoğunluğunu etkilemeden birden fazla slaytı boyamak için kullanılabilir.
   2. Önlem olarak, her biyolojik kopya için farklı bir leke tüpü kullanın.
3. Daha fazla tedavi olmadan kordon bölümlerini gömmek için kriyooldları ve O.C.T.'yi kullanın.
4. Kriyostatı -20 ila -24 °C'de sakla. Bölümleme işleminden sonra, yeterli sayıda hazırlanana kadar slaytları -80 °C dondurucuya yerleştirin. Slaytlar yapıldıktan sonra RNA hazırlığına en kısa sürede başlayın. Uzun süreli depolama için, slaytlar yerine, 80 °C'de bölümlenmemiş veya kısmen bölümlenmiş OCT bloklarını saklayın.
5. RNA hazırlama kiti üreticisinin talimatlarına göre sağladığı çözümleri kullanarak, parçalanmış motor nöronlardan RNA hazırlığı için guanidin tiyosiyanat tamponunu yapın.

2. Farelerden Omurilik Bölümlerinin Hazırlanması (Şekil 1A)

1. Tüm diseksiyon aletlerini, cam kaydırakları, jiletleri ve diseksiyon platformunu RNase dekontaminasyon çözeltisi ile pişirerek veya silerek temizleyin ve ardından RNase içermeyen% 70 etanol. 2 dakika kurulayın. Laboratuvar mendilleriyle kaplayarak her şeyi tozsuz tutun.
2. Anestezi, kardiyak perfüzyon ve ötanazi de dahil olmak üzere hayvan elleçleme işlemleri, hayvanı omurilik diseksiyonu noktasına hızla getirmek amacıyla yerel kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesinin (IACUC) gereksinimlerine göre yapılmalıdır.
   1. Ölümcül dozda Ketamin (450 mg/kg) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile fareyi uyuşturun.
   2. Derin bir anestezi seviyesi elde edildikten ve ayak parmağı sıkışması tepkisi eksikliği ile onaylandıktan sonra, fare ventral tarafını bir diseksiyon platformuna (örneğin bir strafor tahtası) yerleştirin, kalbi ortaya çıkarmak için göğüs boşluğunu açın ve sol ventrikülün içine yerleştirilmiş bir infüzyonun 27 G kelebek iğnesini yerleştirin (araştırmacının sağındadır). Keskin bir forseps ile sağ kulakçıkları çalın ve peristaltik bir pompa kullanarak yaklaşık 2 dakika boyunca 5-7 ml / dk oranında PBS ile perfuse. Atriyumdan akan sıvı bu noktada büyük ölçüde kansız olmalıdır.
   3. Perfüzyon iğnesini çıkarın, farenin kafasını çıkarın ve diseksiyon tahtasında ters çevirin. Omuriliği açığa çıkarmak için cildi açın, omurları çıkarmak için küçük makas ve tokmak kullanın ve sinir köklerini keskin bir tokmaklarla keserken omuriliği çıkarın. Hız ve uygulama, perfüzyonun başlangıcından kablonun çıkarılmasına kadar hareket etmek için gereklidir; bu en fazla 7 dakika sürmelidir.
   4. Kalan kanı temizlemek için kabloyu RNase içermeyen suda 10 saniye durulayın. Omuriliği kavisli bir tokmakla RNase içermeyen bir cam kaydırağa çok nazikçe ama hızlı bir şekilde döşeyin. Temiz bir jilet kullanarak omuriliği enine 9-10 parçaya bölün.
   5. Parçaları aynı .C kullanarak O.C.T. ile dolu bir kriyoold içine yerleştirin ve temiz bir iğne kullanarak dikey olarak hizalayın. Kalıbı sıvı azotla önceden soğumuş 2 metilbütan içeren sığ bir tepsiye yerleştirin ve ardından RNA bozulmasını önlemek için omurilik parçalarını hızlı bir şekilde dondurmak için tepsiyi sıvı bir azot banyosuna koyun.
   6. OCT gömülü bloğu bölümlemeden önce 6 aya kadar -80 °C'de saklayın. RNA bütünlüğünü korumak için kablonun alınmasından donmaya kadar olan işlem 5 dakika içinde yapılmalıdır.
3. Her biri 9-10 omurilik kesiti içeren 20 μm dilim üretmek için bir kriyostat ile -20 °C'de O.C.T.'ye gömülü bloğun, bölümlerin slayda yapışmasını sağlamak için başlangıçta oda sıcaklığında tutulan RNase içermeyen PEN-membran 2 μm slaytlarda kriyoeksiyon. Kriyostatın içindeki -20 °C'lik bir yüzeydeki bölümü hemen yeniden dondırın. Slaytları kullanılana kadar -80 °C'de tutun.

3. Omurilik Bölümlerinin Lekelenerek Boyanmışlığı (Şekil 1A)

1. Temiz bir rafta altı adet 50 ml konik tüp yerleştirin. Hepsini 25-30 ml RNase içermeyen% 70 etanol ile doldurun, böylece slayt daldırıldığında derinlik slayttaki tüm bölümleri kaplamak için yeterlidir. Daha önce açıklandığı gibi 30-35 ml%1 Azure B çözümü yapın ve yıkama veya boyama sırasında değişen çözümler arasındaki süreyi en aza indirmek için aynı rafta tutun. Ekstra çözeltiyi hızlı bir şekilde boşaltmak için rafın önünde üç veya dört laboratuvar mendili bulundurun.
2. -80 °C dondurucudaki slaytları kuru buza alın. Bir kaydırağı eldivenli bir avuç içine yerleştirerek çözün. Slayttaki nem ve yoğuşmaların çoğunu laboratuvar silme ile silerek, bölümlere dokunmamaya dikkat ederek çıkarın. Slaydı tamamen kurumak için 30-40 sn petri kabına taze silika jel kurutucu üzerine koyun. Laboratuvar nemi yüksekse, kaydırağı daha hızlı kurutmak için vakum dessicator'da kısa bir işlem yapılabilir.
3. Yıkama ve lekeleme.
   1. Kurutulmuş kaydırağı RNase içermeyen ilk tüpe% 70 etanol batırın. Slaydı 30 saniye bekletin, ardından 45-60 sn boyunca yukarı ve aşağı daldırarak OCT'yi çıkarmak için slaydı yıkayın. Kaydırağı çözeltiden alın ve laboratuvar mendillerindeki fazla sıvıyı boşaltın. Slaydı% 70 etanol ikinci tüpe batırarak aynı işlemi tekrarlayın. Omurilik bölümlerinin etrafındaki OCT tamamen gitmiş değilse, üçüncü tüpteki yıkamayı tekrarlayın.
   2. Fazla sıvıyı boşalttıktan sonra, slaydı %1 Azure B çözümüne %70 RNase içermeyen etanolde 30-45 saniye batırın. Laboratuvar silme işleminde fazla Azure B'nin suyunu boşaltın; bu noktada, tüm slayt mavi olacaktır.
   3. Slaytı bir sonraki %70 etanol tüpüne batırın ve fazla boyayı gidermek ve spesifik motor nöron lekelerini görünür hale getirmek için hızlı bir şekilde 3-4x aşağı ve yukarı daldırın. Bölümler çok koyu lekeli görünüyorsa, % 70 etanol taze bir tüpte destaining adımını tekrarlayın. Boyama çok hafif görünüyorsa, slaydı 30 saniye daha Azure B çözümüne döndürün ve yinelenenleri yok etmeyi yineleyin. Fazla etanol silin ve tüm sıvı gidene kadar kaydırağı ~40 saniye kurutun. Gri madde açık mavi olacak, oysa motor nöronlar kolayca görülebilen koyu maviye boyanacak. Diseksiyona hemen başlayın.

4. Lazer Yakalama Mikrodisksiyonu (LMD) (Şekil 1B)

1. Mikroskobu açın ve numune toplama için 0,6 ml'lik bir mikrofuge tüpünün kapağını takmak için tüp tutucuyu boşaltın. 0,6 ml'lik bir mikrofuge tüpünün kapağına 30 μl guanidin tiyosiyanat lizis tamponu koyun. Çözeltiyi pipet ucu kullanarak yayarak kapağın yüzeyini sıvı ile örtün. Bu şekilde, toplanan tüm nöronlar parçalandıkça çözünür hale gelecektir. Kapağı delik ve hedefle mikroskop yazılımıyla hizalayın. Lazer yakalamaya başlayana kadar kapağı kapalı konumda tutun.
2. Hava kurutulmuş kaydırağı LMD mikroskobun aşamasına baş aşağı yerleştirin, böylece PEN'in zarı aşağı doğru kayar. Bölümleri olan membran, altında toplama tüpü olan deliğe bakmalıdır.
3. Slayt hazırlığına başlamadan önce lazeri 10 dakika açın. 5X hedefi olan bir omurilik bölümüne odaklanın. Diseksiyon için 20X hedefine geçin.
   1. Hafif kalemle bir "kukla" bölgeyi işaretleyin ve lazerin toplamadan kesmesine izin verin. Bu, PEN zarını rahatlatır ve birden fazla bölgeyi art arda işaretlemeyi ve kesmeyi mümkün kılar.
   2. Ventral korna bölgesindeki motor nöronlara yeniden odaklanın ve tanımlayın. Bu nöronlar konumları, piramidal morfolojileri, büyük boyutları ve Azure B ile koyu mavi boyamaları ile tanınabilir (Şekil 2).
   3. Hafif kalemi kullanarak, çizim aracını seçin ve motor nöronların kenarı boyunca işaretleyin ve tam bir anahat çizin. Motor nöron dışındaki hücrelerden bulaşmayı önlemek için anahattı motor nörona mümkün olduğunca yakın hale getirmeye çalışın. (Lazer kesim hattının ne kadar geniş olduğunu görmek ve boşluğu gerektiği gibi ayarlamak için önceden bazı bölümleri test edin.) Kesmeden önce birden çok hücreyi işaretleyin; yazılım pozisyonları hatırlayacaktır.
   4. Kapak konumuna tıklayarak kapağı kesme konumunun altına getirin. Lazerle motor nöron diseksiyonu başlatmak için başlat düğmesine tıklayın. Tüm motor nöronları bir slayttaki tüm bölümlerden bir mikrofuge tüpünün kapağına toplayın.
   5. Toplama tamamlandıktan sonra, tepsiyi boşaltarak ve tüpü hafifçe yerinden çıkararak mikrofüzyon tüpünü tutucudan alın. Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleme ile tampondaki motor nöronları tamamen çözün. Çözeltiyi 4 °C'de 2 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyarak tüpün gövdesine taşıyın. Numuneyi kuru buzda hemen dondurun ve -80 °C'de saklayın. Bu işlem, slayt boyamadan motor nöron koleksiyonuna kadar, RNA bozulmasını en aza indirmek için bir slayt için 30 dakika içinde yapılmalıdır.

5. Motor Nöronlardan RNA Hazırlama

Toplanan tüm nöronları bir hayvandan çözün ve RNA çıkarmak için bir araya toplayın. Örnekler, içlerindeki motor nöronların sayısına (Azure B ile lekelenmiş) bağlı olarak soluk mavi görünebilir. LMD doku için sağlanan protokole göre uygun bir kit kullanarak RNA çıkarın, mümkün olan minimum hacimde elde edin. Numunenin miktarını ve bütünlüğünü kontrol etmek için 1 μl alın. Kalan RNA'yı kuru buzda hızlı dondurun ve -80 °C'de saklayın.

6. RNA Kalite ve Miktarının Belirlenmesi

Üreticinin protokolüne göre kılcal elektroforez mikroakışkan çipi üzerindeki 1 μl numune ile RNA kalitesini belirleyin. RNA-seq ve qRT-PCR için 8,5'in üzerinde bir RNA Bütünlük Numarası (RIN) içeren toplam RNA preparatları kullanılabilir. Veri çıktısı genellikle örneğin yaklaşık konsantrasyonu da içerir.

Sonuçlar

Yukarıda ve Şekil 1'de özetlenen protokol, yaklaşık 20 PEN kaydırakta 9-10 20 μm dilimden incelenen 3.000-4.000 omurilik motoru nöron hücre gövdesinden 8,5 > RIN ile toplam RNA'nın 50 ng veya daha fazlasını üretmelidir. Bu sayıda slayt, fare omuriliğinin O.C.T. gömülü bloğunun% 10'undan daha azını temsil ettiği için, -80 ° C'de depolanan bloğa geri dönmek ve başka bir RNA hazırlığı turundan geçmek için daha fazla dilim kesmek mümkündür. Bir analiz için daha fazla miktarda RNA gerekiyorsa, birkaç gün içinde diseksiyon ve RNA hazırlığı yoluyla işlenebilen bir seferde yalnızca slayt sayısını(örneğin 20) yapmak, ardından ikinci bir tur için daha fazla slayt yapmak ve ürünleri birleştirmek daha iyidir. İyi bir hazırlık ile kötü bir birleştirmekten kaçınmak için önce her preparatın RIN'ini kontrol etmeyi unutmayın. RNA-seq yöntemleri daha hassas hale geliyor ve yeni PCR teknolojileri mevcut teknolojilerden daha yüksek hassasiyet vaat ediyor. Bu nedenle, daha az nöron hücre gövdesinden daha az RNA gerekecek ve bu da daha fazla sıralama derinliği ve ilginç vuruşların daha kapsamlı bir şekilde doğrulanmasına izin verecektir. Öte yandan, qRT-PCR analizi ve doğrulama⁴ için MIQE önerilerine tam bağlılık, düşük bolluklu RNA'lar için gerekli kontrol reaksiyonlarına izin vermek için daha büyük miktarlarda gerektirebilir.

Şekil 2, Azure B boyama ve diseksiyondan sonra omurilik ventral boynuz bölümünün bir bölümünün tipik bir dizi görüntüsü gösterir. Panel A'da, büyük, koyu lekeli hücre gövdeleri, anti-Chat antikor boyama²ile onaylanan motor nöronlardır ve daha küçük komşu hücrelerden kolayca ayırt edilir. Panel B, aynı bölgeyi hafif kalemle özetlenen ve mikroskop yazılımı tarafından numaralandırılan tek tek hücre gövdeleriyle gösterir. Anahatlar, lazerin kesme genişliği için küçük bir izinle hücre gövdelerinin kenar boşluklarını yakından takip eder. Bu aralık, motor nöron sitozol kaybını önlerken yabancı malzemenin dahil edilmesini en aza indirmek için her lazer güç ayarı için belirlenmalıdır. C ve D panelleri lazer kesildikten ve tek tek hücre gövdeleri toplama kapağına düştükten sonraki bölümü gösterir. Kesme kenar boşluğunun C panelinde hafif kalem anahattını tam olarak izlemediğine, ancak büyük ölçüde bunun dışında kaldığına dikkat edin. Bu düzensizlik, lazerin neden olduğu dokuya verilen ısı hasarını yansıtan her kesimin etrafındaki karartılmış alan gibi D panelinde de belirgindir. Bu nedenle, iki hücre gövdesi birbirine çok yakınsa, onları ayrı ayrı kesmeye çalışmak ve yakın temas bölgelerinde ısı hasarı için biraz RNA kaybetmek yerine, tek bir kesim için ana hatlarıyla belirlemek daha iyidir.

Şekil 3, LMD tarafından toplanan ~4.000 fare motoru nöron hücre gövdesinden hazırlanan bir RNA örneğinin RNA bütünlüğünün elektroforetik analizinin tipik sonuçlarını göstermektedir. Üst panel, toplam RNA'nın 1 μl'si tarafından üretilen elektroferogramdır; sağdaki içe jelin bir görüntüsüdür. Her ikisinde de, belirgin ribozomal RNA zirvelerine dikkat edin. Alt panel, RNA boyut standartlarını içeren şeridin elektroferogramıdır. Analiz yazılımı, bu örnek için 4.9 ng/μl konsantrasyonda 9.8 RIN hesapladı. Bu çözeltinin toplam 13 μl'si analizden sonra mevcuttu ve transkript miktarlarının aşağı akış qRT-PCR doğrulaması için 64 ng RNA sağladı. Orta derecede bol transkriptlerin tipik bir qRT-PCR analizi için, toplam RNA'nın 0.15-0.20 ng'si doğru miktar²üretmek için yeterlidir, bu nedenle bu preparattan elde edilen RNA miktarı, önerilen^4. Tabii ki, nadir transkriptlerin doğrulanmasına izin vermek için daha büyük miktarlarda giriş RNA'sı kullanılabilir. Bu miktar, kütüphane hazırlığına ve yeni nesil RNA-seq'e izin vermek için de fazladır.

Şekil 1. Omurilik dilimi üretimine genel bakış ve omurilik motor nöron hücre vücutlarının lazerle mikroseksiyonu. A)Dilim üretimi ve boyamada önemli adımlar. B)Omurilik bölümü ve lazer diseksiyonunun karikatür görünümü. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın. 

Şekil 2. Azure B lekeli motor nöron hücre gövdelerinin lazer diseksiyonunun öncesi ve sonrası görüntüleri. A)Lekeli bir bölümün ventral boynuzun bir kısmı. Dört büyük, koyu lekeli hücreye dikkat edin. Ayrıca, motor nöron olmayan (Anti-Chat antikor boyama ile doğrulanan; gösterilmeyen, ancak bkz. Bandyopadhyay²⁾ve diseksiyon için seçilmeyecek birkaç hafif lekeli ve biraz daha küçük hücreler vardır. Birçok küçük, karanlık nokta muhtemelen nöronal süreçlerdir (dendritler ve aksonlar), ancak bu doğrulanmadı. B) Işık kalemi ile özetlenen dört hücre gövdesi. Anahatların, aralarında minimum mesafe olacak şekilde hücrelerin kenar boşluklarını yakından izlediğini unutmayın. Bu aralık her mikroskop ve lazer için ampirik olarak kurulmalıdır. Yazılım, kaç kişinin toplandığını takip eden tek tek nöronları numaralandırır. C ve D) Lazer kesildikten ve hücre gövdelerini içeren parçalar toplama kapağına düştükten sonra. Geride kalan deliğin anahattan biraz daha büyük olduğunu ve düzensiz olduğunu unutmayın. Bu, lazer ışınının genişliğini ve dokunun yerel bileşimine bağlı olarak hafif değişken kesme verimliliğini yansıtır. Ayrıca lazerin neden olduğu lokal ısıtma hasarı nedeniyle her deliği çevreleyen koyulaşmış dokunun kenarı da belirgindir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Şekil 3. LMD örneklerinden hazırlanan RNA'nın bütünlüğünün elektroforetik analizi. A)Yukarıdaki protokolle ~4.000 motor nöron hücre gövdesinden hazırlanan RNA'nın 1 μl aliquot'ı mikroakışkan çip üzerinde mikrokapcal elektroforez ile analiz edildi. Elektroferogram, belirgin ribozomal RNA zirveleri ile gösterilir. Sağda jelin kendisinin bir görüntüsü vardır. B) Boyut standartlarının elektroferogramı, ilgili jel şeridi sağda olacak şekilde gösterilir. Cihaz yazılımı bu örnek için 9.8 RIN ve 4.9 ng / μl konsantrasyon hesapladı.

Tartışma

Omurilik dilimlerinin lazer mikroseksiyonu ile toplam RNA üretimi için bu protokolün en önemli başarı ölçüsü RIN değeri^{5 'tir.} Daha yüksek ökaryotlardan alınan RNA örnekleri için, 8,5'in üzerindeki değerler düzenli olarak yüksek kaliteli sıralama ve qRT-PCR verileri verir. Verim düşük ancak kalite yüksekse, hazırlığı tekrarlayın. Bütünlük daha düşükse (hatta 7,5-8), ancak sorunun kaynağını bulmak ve yeniden denemek daha iyidir. Bir şeylerin ters gidebileceği birçok adım vardır, ancak gerçekten sorunun sadece iki kaynağı - endojen RNaz kontaminasyonu veya eksojen RNaz kontaminasyonu. Birincisi pratikle ele alınabilir, böylece farenin fedakârlıktan O.C.T gömülü kablosunu dondurmaya kadar geçen süre en aza indirilebilir. Protokolde endojen RNaze'nin zayıf bir sonuca katkıda bulunabileceği diğer nokta dilimlerin hazırlanması sırasındadır. Her dilim bir oda sıcaklığı PEN kaydırağını hızlı bir şekilde yapışmalıdır, ancak eriyecektir (O.C.T netleşir). Dilim ne kadar hızlı yeniden refrozen edilebilirse o kadar iyi. Kullandığımız kriyostat, odanın içinde -20 °C'de olan ve dilimi hızlı bir şekilde yeniden dondurmak için kullandığımız düz yüzeylere sahiptir. Kullanılan kriyostatta benzer bir nokta bulun ve dilimin tekrar hızlı bir şekilde opak hale geldiğinden emin olun.

Eksojen RNaz kaynaklarının izini sürmek zor olabilir, çünkü çok fazla olasılık vardır. Açıkça RNase içermeyen kullanılan tek reaktifler O.C.T. ve Azure B'dir. Azure B daha önce tatmin edici bir performans sergilediyse, bu reaktif hiçbir zaman sorun olmasa da, yeni bir O.C.T. şişesi deneyin. RNase içermeyen reaktifler, farklı bir tedarikçiden bile değiştirilebilir. Çok daha olası bir kaynak araştırmacı. Çalışma alanının kapsamlı bir şekilde temizlenmesine ek olarak, genellikle başka bir laboratuvar üyesinin prosedürdeki tüm adımları takip etmesi ve gözlemlemesi yararlıdır. Bu rutin olarak bu işlemi yapmayan biri olsa bile, yeni bir göz kümesi fark edilmeyen bir kirlenme kaynağı alabilir.

Bu protokolün RNA'yı diğer omurilik hücrelerinden, diğer türlerden omurilik hücrelerinden veya diğer organlardaki belirli hücre türlerinden kurtarmaya kadar uzatmak, endojen RNaz'ın etkisini ortadan alırken veya en azından en aza indirirken ilgi çekici hücrelerin net bir şekilde tanımlanmasını sağlamak için çeşitli alanlarda değişiklikler gerektirecektir. Buradaki protokolde, kablonun hızlı bir şekilde çıkarılması ve dondurulması, %70 etanolde Azure B boyama ile birleştiğinde, hem RNA bozulmasının en aza indirilmesine hem de motor nöron hücre gövdelerinin kolay tanımlanmasına izin verildi. Azure B, RNA^3'e bağlanıyor gibi görünen nöronlar için iyi kurulmuş bir histokimyasal lekedir ve nörodejeneratif hastalığı olan hastalardan beyin dokusunun otopsi örneklerinde nöronların RNA içeriğini değerlendirmek için kullanılmıştır⁶. Özellikle, Azure B boyama, saflaştırılmış RNA'nın bütünlüğünü veya ters yazıp çözümlenme yeteneğini etkilemedi. Benzer LMD protokollerinde cresyl violet⁷ ve toluidine blue⁸ gibi diğer boyalar kullanılmıştır. Hücre cisimlerinin parçalanırken doğrudan guanidin tiyosiyanat çözeltisine toplanması, sağlam RNA'nın rutin olarak iyileşmesiyle sonuçlanan son adımı sağladı.

Diğer hücreler ve organlar için de benzer yaklaşımlar öngörülebilir, endojen RNa'lar tarafından RNA bozulmasını en aza indirirken veya tercihen önlerken ilgi çekici hücreleri tanımlamanın başarılı analiz için kritik gereklilik olduğunu kabul etmek. Pankreas gibi yüksek RNas seviyelerine sahip dokularda, hızlı kullanım ve düşük sıcaklık, görselleştirme için doğal otofluoresanslarından yararlanarak RNA'nın β hücrelerden geri kazanılmasına izin vermek için birleştirilmiştir⁹. Tanımlama için antikor lekeleme kullanan prosedürler de bildirilmiştir¹⁰, ancak elimizde tam olarak başarılı olmamıştır. Son olarak, LMD mikroskoptaki doku bölümlerinde tanımlamak için kullanılabilecek ilgi çekici hücrelerde floresan füzyon proteinlerini(örneğin GFP, YFP, RFP) ifade eden birçok fare modeli mevcuttur. Aslında, bu protokolle analiz ettiğimiz fare suşları SOD1 ve YFP¹¹arasında bir füzyon proteinini ifade eder ve omurilik motor nöronları oldukça floresandır. Bununla birlikte, O.C.T.'yi aynı anda ortadan kaldıracak, RNaz aktivitesini engelleyecek ve motor nöronların görselleştirilmesine ve LMD tarafından iyileşmesine izin verecek kadar YFP floresanını sürekli olarak koruyacak bir dizi etanol yıkama ve / veya dehidrasyon durumu bulamadık. Belki de bu sınırlamayı aşmak için yeni bir floresan protein veya organik çözücülerde floresan koruyan mevcut proteinlerin bir varyantı bulunabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ketamin	Webster Veteriner	26637041101	Kurumsal veterinerlik servisi tarafından onaylanmış herhangi bir kaynak
Diseksiyon aletleri (makas, forseps,  vb.)			Yüksek kaliteli diseksiyon aletleri için herhangi bir uygun kaynak
Kriyostat	Leica Microsystem	CM3050S	Diğer kriyostatlar
LMD6000 B	Leica Microsystem		Diğer LMD sistemleri test edilmemiştir
RNaz içermeyen PEN-membran 2 & mu; m slaytlar	Leica Microsystem	11505189	Diğer slayt türleri test edilmiştir ve iyi performans göstermemektedir
RNeasy Mikro kiti (50)	Qiagen	74004	Guanidin tiyosiyanat lizis tamponu kullanan ve küçük miktarlarda RNA'nın geri kazanılması için test edilmiş herhangi bir kit kullanılabilir
Agilent 2100 BioAnalyzer	Agilent Technologies	G2939A
Azure B Sertifikalı	MP Biyomedikal	190520	Kritik! Herhangi bir kaynaktan gelen ürün, RNA bütünlüğünü koruma yeteneği açısından kullanımdan önce test edilmelidir
PBS	Sigma Life Science	D8537	Herhangi bir güvenilir RNaz içermeyen PBS
RNA Etanol kaynağı %70 (DEPC ile arıtılmış su ile üretilmiştir)	Amerikan Biyoanalitik	AB04010-00500	Herhangi bir güvenilir kaynak, laboratuvar yapımı olabilir
Su, RNaz içermez, Endotoksin test edilmiştir (RNase'i ortadan kaldırmak için DEPC ile muamele edilmiştir)	Amerikan Biyoanalitik	AB02128-00500	Herhangi bir güvenilir kaynak, laboratuvar yapımı
olabilir RNase AWAY	Invitrogen Life Technologies	10328-011	RNaseZAP (ayrıca Invitrogen'den) gibi diğer benzer RNase giderme reaktifleri
kullanılabilir 2-Metilbütan	Elektron Mikroskobu Bilimleri	78-78-4	Herhangi bir kaynak
Maxymum Recovery mikrofüj tüpleri (0.6 ve 1.5 ml) ve pipet uçları	Axygen	311-03-051 & 311-09-051	Ultra düşük tutma, RNaz içermeyen tüpler ve uçlar; OCT kullanmadan önce diğer üreticilerin ürünlerini test edin
. Bileşik	Doku-Tek	4583
Cryomold Orta Boy	Doku-Tek	4566
Laboratuvar mendilleri (Kimwipes)	KIMTECH	34155