Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

Summary

In situ metabolik profilleme için Förster Rezonans Enerji Transferi entegre biyolojik sensörler (FIBS) kalibre nasıl bir açıklama sunulmuştur. FIBS invaziv olmayan metabolik modelleri ve biyoproses koşullarının yüksek miktarda madde taraması gelişiminde yardım metabolitlerin hücre içi seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.

Abstract

Hesaplamalı biyoloji çağında, yeni yüksek kapasiteli deneysel sistemler onlar tahmin amacıyla valide böylece modelleri doldurmak ve rafine etmek için gereklidir. İdeal tür sistemler zaman ders veri elde edilecek zaman örnekleme ve yıkıcı analizlerini engeller düşük hacimli olacaktır. Gereken şey, gerçek-zamanlı ve noninvaziv gerekli bilgileri rapor edebilecekleri in situ izleme aracıdır. İlginç bir seçenek, floresan kullanılmasıdır, protein-bazlı hücre içi konsantrasyonlarının muhabir olarak in vivo biyolojik sensörler. Metabolit nicellendirmesinde bulmuştur in vivo biyosensör bir özel sınıfı, bir ligand bağlama alanı ile bağlanmış iki floresan protein arasında Förster rezonans enerji transferi (FRET) dayanmaktadır. Entegre biyolojik sensörler (FIBS) Fret yapıcı hücre hattı içinde üretilen, onlar hızlı yanıt süreleri ve spektral cha varhücre içindeki metabolitin konsantrasyonuna göre değişiklik tikleri. Bu yazıda, hücre içi metabolit konsantrasyonunun gelecek ölçümü sağlamak amacıyla yapısal olarak glikoz ve glutamin için bir ifade fibs (CHO) hücre çizgileri, Çin hamsteri yumurtalık yapımında ve toplu hücre kültüründe in vivo olarak fibs kalibre edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Beslemeli-kesikli CHO hücre kültürlerinden elde edilen veriler, FIBS hücre içi konsantrasyonunda elde edilen değişikliği tespit etmek için, her durumda mümkün olduğunu göstermektedir. Bağımsız bir enzimatik deneyi ile teyit edildiği gibi FIBS ve daha önceden oluşturulan kalibrasyon eğrisinden floresan sinyalini kullanarak, hücre içi konsantrasyonu tam olarak tespit edilmiştir.

Introduction

Metaboliti izleme süreç geliştirme, medya ve yem tasarım ve metabolik mühendislik dahil bioprocessing çeşitli uygulamalar vardır. Çeşitli yöntemler enzimatik ^1, kimyasal ^{2, 3} ya da bağlama deneylerinde kullanımıyla konsantrasyonu ölçümleri için kullanılabilir. İlginç bir seçenek, floresan kullanılmasıdır, protein bazlı anahtar metabolitlerin hücre içi konsantrasyonunun muhabir olarak in vivo biyolojik sensörler. Küçültme aslında sinyal-gürültü ^{oranı, 4,5} artırır ve protein bazlı sensörler eksojen genetik olarak reaktif metabolit analizi için gerekli olduğu anlamını kodlanabilir gibi ultra-düşük hacim deneylerinde, floresan bir araçtır. Förster rezonans enerji transferi (FRET) biyosensörler bir ligand bağlama alanı ile bağlanmış iki floresan protein oluşur. FRET bir alıcı, flüoresan molekül locat bir fotoğraf eksitasyonlu bir vericiden bir radyatif olmayan enerji transferi yakın (<100) ed. Ligand bağlayıcı bir bölünme ya da sırayla, emisyon spektrumunda bir değişiklik ile ölçüldüğü FRET veriminde bir değişime yol açan, florofor yakın bir değişim olmaktadır, sensörün bir konformasyonel değişikliği neden olur. FRET entegre biyolojik sensörleri (FIBS) yapıcı hücre hattı içinde üretilir ve spektral özellikleri, hücre içinde metabolitin konsantrasyonuna göre değişir. FIBS dinamik modellerin ⁶ ölçümler için idealdir hızlı tepki süreleri var. Önceki uygulamaların ^7-9 tekli ve çoklu ¹⁰ metabolitleri izleme ve uzaysal dağılımı ¹¹ veri sağlayan içerir. Ligand bağlama enerjisi transferi ve bir ligand bağlanma yakın temas eder (Şekil 1) içine, iki florofor getirir Apo-Min, düşürücü florofor yakınlığını bozan Apo-Max,: FIBS iki konfigürasyonlarda oluşturulabilir.

Bu çalışmada _content ">, bir protokol kurucu bir metaboliti, glukoz ya da glutamin için bir ifade fibs (CHO) hücre çizgileri, Çin hamsteri yumurtalık oluşturmak için sunulmuştur. bir yöntem, in vivo olarak, sensörün kalibrasyonu için kurulur gelecek Quantitative etkinleştirme Şekil 2'de gösterildiği gibi. Buna göre hücre içi metabolit konsantrasyonunun ölçümleri, glukoz veya glutamin hücre içi konsantrasyonu, iki besin işlemdeki yüksek konsantrasyonlarda ilave edildi için, beslemeli-kesikli CHO hücre kültürlerinde tespit edilebilir. sonuçlar Bu invaziv olmayan, düşük maliyetli olduğundan bağımsız enzimatik deneyi ile teyit edildiği gibi FIBS ve daha önceden oluşturulan kalibrasyon eğrisinden floresan sinyali kullanarak, hücre içi konsantrasyonunun doğru tahmini mümkün olduğunu göstermektedir. bu yöntem mevcut analitik teknolojiler üzerinde önemli avantajlar sunar ve hızlı mon olabilir FIBS bir gerçek-zamanlı sinyal vererekkültür boyunca itored.

Protocol

1.. Hücre Hattı Revival ve Bakım

1. 8 mM L-glutamin ve 10 ml / L 100x hipoksantin / timidin takviyesi (tam büyüme ortamı) ile takviye 9 ml CD-CHO ortamı içinde CHO hücreleri canlandırmak.
2. 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj.
3. Taze tam büyüme ortamında 10 ml hücreleri yeniden süspanse edin.
4. 1 ml'lik bir numune alın ve bir hemasitometre içinde tripan mavi boya eksklüzyon metodunu kullanarak, ışık mikroskopisi ile viyabl hücre konsantrasyonunu belirler.
5. 125 ml 3 x 10 ⁵ hücre / ml 'lik bir yoğunlukta bir tohum kültürünü başlatmak çalkalama cam deney şişesinin.
6. 120 rpm'de dönen bir yörüngesel çalkalama platformu üzerinde, 37 ° C,% 5 _CO2 bulunan nemli bir atmosferde bir inkübatörde kültür koruyun.
7. 2 x 10 ⁵ hücre / ml 'lik bir tohumlama yoğunluğunda tam büyüme ortamı içinde her 3-4 günde bir alt kültür.

2. Plasmid C Hücre Hattı transfeksiyonuBiosensor Gene ontaining

1. Bir büyük ölçekli plazmid saflaştırma kiti kullanılarak plazmid DNA hazırlayın.
2. (37 ° C,% 5 _CO2), transfeksiyondan önce 12-24 saat hücreler aktif transfeksiyon anda bölünen sağlamak için uygun koşullar altında hücrelerin koruyun.
3. Tripan mavi boya eksklüzyon metodunu kullanarak, hücre sayımı, daha sonra 1 x 10 ⁶ hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda bir sallama şişesi içinde 125 ml hücre kültürü, 20 ml bir çalışma hacmini hazırlayın.
4. Kullanılan hücre hattı için uygun bir transfeksiyon kiti kullanın. Transfeksiyon reaktifleri oranı plasmid DNA hücre çizgisi ve vektör üzerindeki bağımlı olacaktır. Bu önceki son transfections yürütülmesi için üretici tarafından belirtilen aralık dahilinde oranların bir dizi test ile optimize önerilir. Ayrıca hücrelerin ancak DNA ihtiva eden en az bir negatif kontrol kültürü korumak.
5. Statik modu, 4 gün boyunca inkübe edin ve daha sonra bir transfer Şeki125 rpm'de dönen ng platformu.
6. Bir öldürme eğrisi tarafından tespit edildiği üzere, uygun bir konsantrasyona kadar plazmid seçimi için uygun antibiyotik ekleyin. Bu çalışmada, zeosin transfekte edilmiş hücrelerin seçilmesi için 400 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar ilave edildi.
7. Kontrol çukurdaki hücre ölmüş kadar, antibiyotik her zaman bir ekleyerek, hücre hattı için uygun bir zaman aralığında ortam kullanın.
8. Kültürleri sallayarak ilerleme için en Konfluent kuyuları kullanın.
9. Dondurma karışımı 1 ml 10 ⁷ canlı hücreleri içeren şişeler içinde kriyojenik dondurma hücreleri tarafından hücre bankası kurulması. Bu çalışmada, bu% 92.5 büyütme ortamı ve% 7.5 dimetil sülfoksit oluşur.

3. Toplu ve Fed-batch Cell Büyüme Eğrisi

1. 50 ml çalışma hacmine sahip 250 ml'lik çalkalama cam deney şişesinin içinde transfekte edilmiş CHO hücrelerinin hücre kültürlerinin, üçlü kurmak için yukarıdaki hücre bakım talimatları takip edin.
2. Cultu koruyunnemli bir hücre 125 rpm'de dönen bir yörüngesel çalkalama platformu üzerinde,% 5 _CO2 ile 37 ° C'de kuluçka, ve 24 saatlik aralıklarla her bir büyüme kültüründen 4.1 ml örnekleri kaldırmak de res.
3. Tripan mavi boya eksklüzyon yöntemi ile, viyabl hücre yoğunluğu ve hücre yaşayabilirliğini belirlemek için numune 100 ul kullanın.
4. Viyabl hücre konsantrasyonu sıfıra indirgenene kadar tekrar edin.
5. Beslemeli-kesikli hücre kültürleri, sırasıyla 36 mM ve 4 mM başlangıç ​​değerlerine şekilde bunların konsantrasyonlarını geri 6. günde glukoz veya glutamin, uygun miktarda takviye için tekrarlayın. Bu, saf suyun aynı hacimde (bu durumda 12 mi) ile beslenmeleri için olan ek kontrol kültürleri de korunur önerilir.

4. Oranı Ölçümleri FRET

1. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 x g yukarıdaki aşama 3.2 ve santrifüj altında uzaklaştırıldı günlük numunelerin 2 ml alın
2. Resuspbuz soğuğu fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde bir 2 ml hücre pelletini sona erdi. 6 oyuklu bir plakaya aktarılır ve bu da bir hücre içeren herhangi bir boş örnek ekleyin.
3. Derhal 465/435 nm (mavi), 520/510 nm (sarı) 430/435 nm ve emisyon dalga boylarındaki bir uyarma dalga boyunda ve sarı, mavi floresan seviyeleri ölçülür.
4. FRET oranları (algılanan mavi floresan yerinde tespit sarı floresan oranı) hesaplayın.

5. Metabolit Tahliller

1. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 x g yukarıdaki aşama 3.2 ve santrifüj altında uzaklaştırıldı günlük numunelerin 2 ml alın Süpernatant kaldırmak.
2. 5 dakika boyunca 100 x g hızında tekrar 3 ml buz gibi soğuk PBS ve santrifüj hücre pelletini.
3. Süpernatantı ve yukarıdaki gibi 3 ml buz gibi soğuk PBS ile hücre pelletini. 15 saniyelik bir darbe de 3 dakika, her 15 saniye için kapalı örnek 5x sonikasyon. Bu noktada, hücre ilaveİsterseniz cts donmuş olabilir.
4. (Malzemelerin tabloya bakınız) hücre içi glikoz konsantrasyonunu belirlemek için, hücre ekstrelerinin örnekler üzerinde üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygun bir glükoz tahlil kiti kullanın.
   Not: bir standart eğri oluşturmak için uygun standartları kullanın. Bu çalışmada, standartların konsantrasyonu 0-100 mM arasında değişmektedir.
5. Standartları için okumalar kullanarak, standart eğri oluşturmak ve (bu durumda: y = 1310.51x - y absorbans okuma ve x, glikoz konsantrasyonu olan 723,43) en uygun doğrusal denklemi bulabilirsiniz.
6. , Standart eğri kullanılarak ve dikkate alınarak seyreltme glikoz konsantrasyonları hesaplayın. Hücre içi glikoz konsantrasyonu daha sonra, bu denklem kullanılarak hesaplanabilir:
   
   CHO hücreleri için, tek bir hücre hacmi, 12 ^{uM, 12} 'lik bir hücre çapı kullanılarak hesaplanmıştır
7. (Malzemelerin tabloya bakınız) hücre içi glutamin konsantrasyonunu belirlemek için, hücre ekstrelerinin örnekler üzerinde üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygun bir glutamin deney kiti kullanın.
   Not: bir standart eğri oluşturmak için uygun standartları kullanın. Bu çalışmada, standartların konsantrasyonu 0-2 mm arasında değişmektedir.
8. Yukarıda 5.5 'de olduğu gibi, (y absorbans okuma ve x, y = 203.1x + 17.1 glikoz konsantrasyonu bu durumda) kalibrasyon eğrisi oluşturmak
9. Standart eğri kullanılarak, dikkate alınarak seyreltme, numunelerin glutamin konsantrasyonunu hesaplamak. Hücre içi glutamin konsantrasyonu, yukarıdaki denklem 1 kullanılarak hesaplanabilir.

Results

Metodolojinin bir bakış, Şekil 2'de sunulmuştur. Burada sunulan çalışma olarak, CHO hücreleri FIBS vektör ve stabil hücre hatları ile transfekte edilmiş 400 ug / ml zeosin bir antibiyotik basınçta seçildi. Yapısal olarak glikoz ve glutamin sensörler sentezleyen iki ayrı kararlı hücre soyları bu nedenle, yaratılmıştır. Şekil 1, bu çalışmada kullanılan iki biyosensör konfigürasyonlarını göstermektedir. Glikoz sensörü Apo-Max prensibine dayanan ve mukabil plasmid pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrod...

Discussion

FIBS yöntem söndürülmesi ve ekstraksiyon kaynaklanan engelleyerek Bu durumda, büyüme sınırlayıcı besin in, in vivo ve in önemli moleküllerin in situ olarak nicelendirilmesi sağlar. Bulgular FIBS sinyal ve glutamin için glikoz ve 0,3-2 mm 1-5 mM aralığı içinde, hücre içi konsantrasyonları arasında iyi bir ilişki olduğunu ortaya koymaktadır. Toplu CHO hücre kültürü, bu konsantrasyonlar, üstel sabit ve erken aşamalarında düşüş rastlanmaktadır. Üstel ve durağan fazlar uygun besleme stratejilerinin...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-S Hücreler	Yaşam Teknolojileri	11619-012	Hücre hattı, çalışmanın hedeflerine bağlı olarak değişecektir
pCDNA4/TO vektörü	Yaşam Teknolojileri
TransIT-PRO Transfeksiyon Reaktifi	Mirus Bio	MIR 5700	Transfeksiyonlar, incelenen hücre hattına uygun herhangi bir yöntem kullanılarak gerçekleştirilebilir
Zeocin	Invivogen
CD-CHO ortamı	Life Technologies	10743-011	Hücre büyüme ortamı, incelenen hücrelere bağlıdır
100x HT Ek Ömrü	Teknolojiler	11067-030
L-Glutamin 200 mM (100x), Sıvı Yaşam	Teknolojileri	25030032
InfinitePRO 200 plaka okuyucu	Tecan	FLx800TBI	Gerekli dalga boylarına erişebilen herhangi bir 96 oyuklu floresan plaka okuyucu ikame edilebilir
Plaka okuyucu için filtreler	Tecan	30000463
Maxiprep Plazmid Saflaştırma Kiti	Qiagen	12163	Herhangi bir uygun kit ikame edilebilir
Amplex Red glikoz/glikoz oksidaz test kiti	Invitrogen	A22189	Herhangi bir uygun kit ikame edilebilir
EnzyChrom  Glutamin Test Kiti	Biyotahlil Sistemleri	EOAC-100	Herhangi bir uygun kit ikame edilebilir
Geliştirilmiş Neubauer hemositometre	Fisher Scientific	MNK-420-010N
İnkübatör	Nuaire	NU-5510E