Method Article

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

DOI:

10.3791/51492

⸱

January 17th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Recombinant Antibody Network, 2The Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto, 3Antibiome Center, University of California, San Francisco at Mission Bay, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir yöntem olup, aynı anda antijenlere karşı yüz Faj gösterimli birleştirici sentetik antikor kütüphanelerinden, ölçeklenebilir, yüksek verimli seçimleri yürütmek için görsel eşliğinde tarif edilmektedir. Bu paralel yaklaşımı kullanarak, standart bağışıklık tahlillerinde işlevsel çeşitli antijenler için yüksek bir çekim ve özelliğe gösteren antikor fragmanları izole ettik.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hem temel hem de klinik araştırma uygulamaları ihtiyaçlarını karşılamak antikorlar için talep yüksek olduğu ve dramatik gelecekte artacak. Ancak, geleneksel monoklonal teknolojileri bu göreve kadar yalnız olmadıklarını açıktır. Bu proteom tüm erişilebilir elemanlarına yüksek kalite ve yenilenebilir afinite reaktifler için talebi karşılamak için alternatif yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu amaç doğrultusunda, faj-görüntülenen sentetik antikor kütüphanelerinden seçimleri yürütmek için yüksek kapasiteli yöntemleri farklı antijenleri içeren uygulamalar için geliştirilmiştir ve hızlı verim ve başarı için optimize edilmiş. Burada, bir protokol video gösterimi ile bir kılavuzu 96 kanal sıvı tutucu veya otomatik robot sistemi kullanarak hedefleri yüzlerce karşı yüksek çeşitlilik kütüphanelerinden Fab faj klonlarının paralel seçimi göstermektedir ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu protokol kullanılarak, tek bir kullanıcı antijenlerin yüzlerce oluşturmak,Paralel onlara antikorları seçmek ve 6-8 hafta içinde antikor bağlanmasını doğrulamak. Vurgulanan şunlardır: i) uygulanabilir bir antijen biçimi, ii) ön seçim antijen karakterizasyonu, iii) kritik özel ve yüksek afinite klonlarının seçimi etkileyen adımlar, ve iv) izleme seçim etkinliği ve erken evre antikor klon karakterizasyonu yolları. Bu yaklaşım ile, tek geçişli membran reseptörleri salgılanmış protein hormonları, ve çoklu alan hücre içi proteinler de dahil olmak üzere pek çok hedef sınıflarına sentetik antikor fragmanları (Fab'lar) elde edilmiştir. Bu fragmanlar, tam uzunluktaki antikorlar dönüştürülür ve yüksek bir çekim ve özelliğe arzettiği doğrulanmıştır. Dahası, Western blotting, ELISA, hücresel bağışıklık, immüno-çökeltme ve ilgili deneyler de dahil olmak üzere, standart bağışıklık tahlilleri, çeşitli işlevsel olduğu gösterilmiştir. Bu metodoloji antikor keşif hızlandırmak ve sonuçta amaç o hayata yakın bize getirecekf proteomu yenilenebilir, yüksek kaliteli antikorlar üreten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Post-genomik yaş başlaması ile karakterize ve proteinleri modüle kaliteli bağlayıcı reaktif durumu, yeni araştırma ve tedavi yollar açmak için esastır. Antikorlar, temel araştırma ve teşhis araçları ve potansiyel terapötik olarak hem akademik hem de endüstriyel araştırmacılara önemli olmaya devam etmektedir. Değil şaşırtıcı, özel antikorlar üretmek için geleneksel hibridoma teknolojileri güvenmek çoğu sözleşme antikor geliştirme firmaları, etkileyici bir büyüme olmuştur. Bununla birlikte, faj-görüntülenen antikor kütüphaneleri kullanılarak in vitro seçimi geleneksel teknolojiler sınırlamalar 1, 2 yüz benzersiz avantajlar ve başarı sunabilir güçlü ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Antijen Nesil

Not: Antijen etki sentezlenmiş ve uygun bir IPTG uyarılabilir sentezleme konstruktu içine ticari satıcılardan çeşitli ile klonlanabilir.

  1. Kimyasal yetkili, T1-faj içine ifade yapıları Transform dayanıklı, BL21 E. kimyasal olarak kompetan hücreler 20 L ilave edildi, 96 PCR plaka buz üzerinde 1X KCM 20 ul DNA kodlayan 10 ng karıştırılarak coli hücreleri.
  2. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, 20 dakika süreyle buz üzerinde hücre / DNA karışımı inkübe ve daha sonra buz üzerine tekrar 2 dakika süreyle bir hava plaka conta ile, glukoz (SOC) ortamı ile önceden ısıtılmış süper uygun suyu 100 ul....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tarif edilen protokol paralel Birleşimsel faj gösterimli Fab kütüphanelerinden structurally- ve işlevsel olarak bağlı antijen alanlarının ikisinin de çeşitli antikor fragmanlarının izole edilmesi için kullanılmıştır. Antijen durumu ile ilgili sorunlar antikor seçiminde 23 için uygun olan eksprese antijen etki silico tanımlanmasında göre, pek çok durumda, atlatılabilir. Aynı laboratuar içinde antikor seçimi için (Şekil 1) bir antijen ifade bağlanması ile, seçime Kritik antijen parametre.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro antikor seçimleri yapılırken, seçim başarısı iki temel belirleyicileri üzerine seçilmesi için) iyi katlanmış antijenik hedefler izolasyon 1 ve 2) yüksek fonksiyonel çeşitlilik antikor kütüphanesinin fırsat. Bir çok durumda, iyi bir şekilde katlanmış, tam-boy proteinin yeterli miktarda bulunması sınırlayıcı olabilir. Bu sınırlamayı aşmak için bir yaklaşım, uygun bir afinite etiketine sahip bir bakteriyel ekspresyon vektörü içine sokulması için biyoinformatik analizi 22 tanımlanır ve .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz NIH Ortak Fonu kabul etmek istiyorum - Protein Yakalama Reaktifler Programı Rekombinant Antikor Ağ antikor seçimi ve karakterizasyonu boru hattı ve robotik seçim platformunun finansman alımı için Yenilik Kanada Vakfı gelişimini finansmanı için.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MALZEMELER
New Brunswick Innova44 istiflenebilir inkübatör çalkalayıcıEppendorfM1282-0004
Liquidator 96 kanallı manuel tezgah üstü pipetleme sistemiAnachem LtdLIQ-96-200
Mikroplaka çalkalayıcıVWR12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 tezgah üstü santrifüjTermo Ürün
ELx405 Select Derin Kuyu Mikroplaka YıkayıcıBiotekELX405USD
Özel Yüksek Verimli Otomatik Faj Seçim RobotuS & P Robotics
Plastik konik Falcon tüpü: 50 mlVWR21008-178
Plastik konik Falcon tüpü: 15 mlVWR89039-668
Axygen 1.7 ml mikrosantrifüj tüpleriCorningMCT-175-LC
96 kuyulu/384 kuyulu Maxisorp plakasıSigmaM9410-1CS
Corning 96 kuyulu V-dipli derin kuyu bloğuCorning3960
Axygen Mini tüp 96 kuyulu steril mikroplaka mavi kutuCorningAXY-MTS-06-CRS
Şirket AdıKatalog Numarası
polietilen glikolBioshopPEG800.1
maya özüBioshopYEX401.1
biyo-triptonBioshopTRP402.1
NZ aminSigmaC7290
glikozSigmaG8270-1KG
laktozBioshopLAC234
gliserolBioshopGLY001.500
karbenisilin ve nbsp;BioshopCAR544.10
kanamisinBioshopKAN201.25
tetrasiklin ve nbsp;BiyoshopTET701.25
Tween 20BiyodükkanTWN510.500
monobazik potasyum fosfatBiyoshopPPM302.1
dibazik sodyum fosfatAnachemia84486-440
sodyum klorürBioshopSOD001.10
potasyum klorürBioshopPOC308.1
kalsiyum klorürBioshopCCL302.500
magnezyum sülfatEMDMX0070-1
magnezyum klorürBioshopMAG510.500
NH4ClAmresco0621-1KG
Na2SO4BioshopSOS513.500
agarBioshopAGR001.500
SybrSafe DNA jel lekesiInvitrogenS33102
fosforik asitAcros Organics201140010
lizozimBioshopLYS702.25
benzonazNovagen71205
Triton X-100BioshopTRX506.500
proteaz inhibitörü kokteyli tabletlerRoche11 836 170 001
Ni-NTA reçinesi Qiagen1018240
1.000x yardımcı faj (M13K07) stoğu (ml başına 1013< / sup> faj)NEBN0315S
HRP konjuge M13-spesifik antikor (anti-M13-HRP).GE Healthcare27-9241-01
TMB substratı: eşit hacimlerde TMB ve H2Osub>2 peroksidaz substratı  karıştırın;KPL50-76-00
dNTP'lerBiyotemelDD0056
Taq polimerazGenscriptE00007
EksonükleazGE Sağlık EZ0073X-EZ
Karides alkalin fosfatazGE HealthcareE70092Z-EZ
75004525 Nefes alabilen yapışkan plaka sızdırmazlık filmi VWR 60941-084 REAKTİFLER

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
  2. Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
  3. Schofield, D. J., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phage DisplayAntibody SelectionHigh ThroughputSynthetic LibrariesFab PhageAntigen ImmobilizationParallel SelectionLiquid HandlerRobotic AutomationELISA Validation

Related Articles