Yöntem makalesi

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

DOI:

10.3791/51492

⸱

17 Ocak 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Recombinant Antibody Network, 2The Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto, 3Antibiome Center, University of California, San Francisco at Mission Bay, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Chicago

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir yöntem olup, aynı anda antijenlere karşı yüz Faj gösterimli birleştirici sentetik antikor kütüphanelerinden, ölçeklenebilir, yüksek verimli seçimleri yürütmek için görsel eşliğinde tarif edilmektedir. Bu paralel yaklaşımı kullanarak, standart bağışıklık tahlillerinde işlevsel çeşitli antijenler için yüksek bir çekim ve özelliğe gösteren antikor fragmanları izole ettik.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hem temel hem de klinik araştırma uygulamaları ihtiyaçlarını karşılamak antikorlar için talep yüksek olduğu ve dramatik gelecekte artacak. Ancak, geleneksel monoklonal teknolojileri bu göreve kadar yalnız olmadıklarını açıktır. Bu proteom tüm erişilebilir elemanlarına yüksek kalite ve yenilenebilir afinite reaktifler için talebi karşılamak için alternatif yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu amaç doğrultusunda, faj-görüntülenen sentetik antikor kütüphanelerinden seçimleri yürütmek için yüksek kapasiteli yöntemleri farklı antijenleri içeren uygulamalar için geliştirilmiştir ve hızlı verim ve başarı için optimize edilmiş. Burada, bir protokol video gösterimi ile bir kılavuzu 96 kanal sıvı tutucu veya otomatik robot sistemi kullanarak hedefleri yüzlerce karşı yüksek çeşitlilik kütüphanelerinden Fab faj klonlarının paralel seçimi göstermektedir ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu protokol kullanılarak, tek bir kullanıcı antijenlerin yüzlerce oluşturmak,Paralel onlara antikorları seçmek ve 6-8 hafta içinde antikor bağlanmasını doğrulamak. Vurgulanan şunlardır: i) uygulanabilir bir antijen biçimi, ii) ön seçim antijen karakterizasyonu, iii) kritik özel ve yüksek afinite klonlarının seçimi etkileyen adımlar, ve iv) izleme seçim etkinliği ve erken evre antikor klon karakterizasyonu yolları. Bu yaklaşım ile, tek geçişli membran reseptörleri salgılanmış protein hormonları, ve çoklu alan hücre içi proteinler de dahil olmak üzere pek çok hedef sınıflarına sentetik antikor fragmanları (Fab'lar) elde edilmiştir. Bu fragmanlar, tam uzunluktaki antikorlar dönüştürülür ve yüksek bir çekim ve özelliğe arzettiği doğrulanmıştır. Dahası, Western blotting, ELISA, hücresel bağışıklık, immüno-çökeltme ve ilgili deneyler de dahil olmak üzere, standart bağışıklık tahlilleri, çeşitli işlevsel olduğu gösterilmiştir. Bu metodoloji antikor keşif hızlandırmak ve sonuçta amaç o hayata yakın bize getirecekf proteomu yenilenebilir, yüksek kaliteli antikorlar üreten.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Post-genomik yaş başlaması ile karakterize ve proteinleri modüle kaliteli bağlayıcı reaktif durumu, yeni araştırma ve tedavi yollar açmak için esastır. Antikorlar, temel araştırma ve teşhis araçları ve potansiyel terapötik olarak hem akademik hem de endüstriyel araştırmacılara önemli olmaya devam etmektedir. Değil şaşırtıcı, özel antikorlar üretmek için geleneksel hibridoma teknolojileri güvenmek çoğu sözleşme antikor geliştirme firmaları, etkileyici bir büyüme olmuştur. Bununla birlikte, faj-görüntülenen antikor kütüphaneleri kullanılarak in vitro seçimi geleneksel teknolojiler sınırlamalar 1, 2 yüz benzersiz avantajlar ve başarı sunabilir güçlü bir alternatif teknoloji haline geliyor.

Araştırma araçları, üretmek için iki temel sorunlar olarak yüksek kaliteli antikorlar için önemli talep ışığında yenilenebilir antikorlar 1) Seçim çıktı ve 2) antijen av vardırailability. Grupların bir dizi şimdi verim ve antikor tanımlama oranını artırmaya yönelik in vitro seçim boru hatları tarif var. Bu açıklamalar detay tam uzunlukta ya üzerine seçerek dahil canlı yaklaşımların çeşitli kullanarak, 3,4 hedefler, veya yapısal etki 5,6,7 ilgili ya boncuk-tabanlı 6,8 veya 3,4 antijen immobilizasyon düzenleri tabanlı plaka. Buna ek olarak, gen sentezi teknolojileri 9 artan kabul maliyet etkin ve potansiyel olarak saflaştırılmış, tam uzunlukta antijenin yeterli miktarlarda elde etmede güçlükle hafifletmek, özellikle izole edilmiş alanlarının sistematik antijen üretimi yaptı. Tandem iki teknolojiyi kullanarak, kendi kendine yeten ve ölçeklenebilir antijen üretimi ve antikor seçimi boru hattı dile antijen alanların büyük kümeleri için antikorların paralel izolasyonunu sağlamak ve cha için reaktiflerin gelişimi kolaylaştırmak olacağını icat edildiyapısal ve işlevsel olarak ilgili proteinlerin bütün sınıfları racterizing.

Bu amaçla, eksprese antijen etki gen sentezi, antijenler ve ölçeklenebilir faj gösterimli antikor seçimleri yüksek verimlilik bakteriyel ifade silico tanımlanmasında çiftler geliştirilmiştir entegre bir boru hattı doğru. Bu boru hattı (lisans veya malzeme transferi anlaşması ile giderek mevcut antikor kütüphaneleri dahil) en yaşam bilimleri laboratuvarlarının mevcut sadece temel altyapı gerektirir, ama aynı zamanda bir endüstriyel ölçekte kullanım için otomasyona müsait. Bu protokol kullanılarak, afinite-etiketli antijen etki yüzlerce üretmek mümkündür ve rutin olarak bu antijenlerin çoğu son derece spesifik antikor fragmanları izole eder.

Faj ekran teknolojisi Fab, scFv ve özerk Fv etki ve a içeren rekombinant afinite reaktif biçimleri çok çeşitli gösterdi uyumluluk göstermiştirküçük 'alternatif çerçeveler' (tasarlanmış ankirin tekrar proteinleri (DARPINS), fibronektin (Fn), lipokalin etki ve daha 10) artan dizi. Bu yöntemler, kütüphanelerin diğer tiplerine adapte edilebilir kabul edilir, ancak Tartışma, antikorun ve antijenin Fab fragmanlarının izolasyonu için bu örnekteki sınırlıdır. Bu teknolojiyi kullanarak, küçük düşük nanomolar afinite ile Fab'ler, tam boy bir protein bağlama ve bağışıklık gibi bağışıklık tahlillerinde işlevsel olan birçok RNA bağlayıcı proteinler ve diğer başarılı seçilmiştir transkripsiyon faktör etki, SH2 etki alanları, de dahil olmak üzere protein alanlarının etiketli , immunopresipitasyon ve immunohistokimyasal. Önemlisi, rekombinant bağlayıcı klonlar tamamen yenilenebilir ve ifadeden yeniden üretilebilir ve böylece titiz klon doğrulama gider haklı, bakteriyel üretim sunan artan tutarlılık, tekrarlanabilirlik ve maliyet-etkililik yoluyla oluşturur.

Bu prot olarakocol ve eşlik eden video, immobilize edilmiş antijen sahaları kullanılarak faj görüntülemeli kütüphanelerinden antikor seçimi için temel yöntem gösterilmektedir. Diğer etiketler 11,12,13 ve seçim formatları da başarılı bir şekilde kullanılmıştır 13,14,2 rağmen, bu özel bir yöntem olup, mikro plakalar içinde pasif adsorpsiyonla da immobilize edilmiş GST-etiketli protein etki kullanmaktadır. Belirlenmesi ve doğrulama için özel zenginleştirilmiş klonal antikorlar izole yönelik seçim parametreleri paralel izleme seçimleri kurulumu ve yürütülmesi için kritik hususlar ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Antijen Nesil

Not: Antijen etki sentezlenmiş ve uygun bir IPTG uyarılabilir sentezleme konstruktu içine ticari satıcılardan çeşitli ile klonlanabilir.

  1. Kimyasal yetkili, T1-faj içine ifade yapıları Transform dayanıklı, BL21 E. kimyasal olarak kompetan hücreler 20 L ilave edildi, 96 PCR plaka buz üzerinde 1X KCM 20 ul DNA kodlayan 10 ng karıştırılarak coli hücreleri.
  2. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, 20 dakika süreyle buz üzerinde hücre / DNA karışımı inkübe ve daha sonra buz üzerine tekrar 2 dakika süreyle bir hava plaka conta ile, glukoz (SOC) ortamı ile önceden ısıtılmış süper uygun suyu 100 ul ile tahlisiye kapsayan önce ve 2.5 cm orbital sallayıcı içinde 200 rpm'de 1 saat boyunca 37 ° C'de çalkalanarak.
  3. Luria-Bertani (LB) karbenisilin ile desteklenmiş / agar plakaları (100 ug / ml) ile için kullanılan tek koloniler elde etmek için O / N büyümesi ile transforme edilmiş hücrelerin plaka 5 ulgliserol stokları üreten.
  4. 5 ul gliserol stoku 2YT / karbonhidrat ortam 1 ml aşılamak ve bir 2.5 cm orbital sallayıcı içinde 200 rpm'de çalkalanarak, 96 gözlü derin gözlü bloğu içinde 37 ° C'de 12 saat boyunca büyümektedir.
  5. NZY media15 inoküle bu kültürün bir 1:40 seyreltme ile (% 0.05 glukoz,% 2 laktoz ve 100 ug / ml karbenisilin ile desteklenmiş), daha sonra bir 2.5 cm x yörünge 30 ° C ve 200 rpm'de 6-8 saat için sallayın çalkalayıcı.
  6. Pelet bakteriler daha önce yayınlanmış protocols16,17 göre Ni-NTA reçinesi 100 ul ihtiva eden bir 96-çukurlu bir filtre plakası, yüksek verimlilik antijenik proteinlerin saflaştırılması ve.
  7. Bradford boya bağlama assay18 ile arıtılmış protein konsantrasyonunu belirlemek ve bir SDS-PAGE jeli üzerinde ayırma ve Coomassie boyası ile 10-50 ug görselleştirilmesi ile boyut ve saflık durumu hakkında karakterize (Bakınız Şekil 2).
    NOT: Bu aşamada proteinler, protein birikiminin 19 değerlendirmek yöntemlerle karakterize edilebilir ya da antijenin doğasına ve seçme hattı gereksinimlerine bağlı olarak 20 katlanması.

Faj Kütüphanesi 2. Hazırlık ve Titrasyon

  1. T1 faj dirençli E. tek bir koloni almak 50 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen 2YT ortamı 1 ml coli hücreleri.
  2. Hücre büyümesi, görsel olarak bir kez kurulduğunda, enfeksiyon için yeterli bir hücre hacmi sağlamak için 50 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen 2YT daha büyük bir hacimde kültür seyreltik (kütüphane seyreltme başına genellikle 45 ul, aşağıya bakınız.).
  3. 30 dakika karıştırıldı ve topaklama için buz üzerinde enkübe otoklava% 20 PEG-8000, 1/5 hacim, 2.5 M NaCl (PEG-NaCI) ile depolama tamponu faj çökeltme kullanımı için kütüphane hazırlanması 12,000 x g'de santrifüj ile faj çökeltilmiştir.
  4. Süpernatant atılır ve tekrar süspansiyon t ayarlanması, 1 x PBS, pH 7.4,% 0.2 BSA ve% 0.05 Tween (PBT), uygun hacimde bir faj çökeltilmişO seçimler için uygun bir faj konsantrasyonu (eğer gerekli ise) yeterli bir literatür kapsama sağlamak için. Adım 2.9 ve Tartışma bakın.
  5. Steril, çok oyuklu bir plaka içerisinde 1x PBS pH 7.4 içinde 45 ul bir 5 ul faj kısım seyreltin karıştırın ve aynı tampon maddesi içinde 10 misli seyreltilmiş bir dizi oluşturmak.
  6. T1 faj dirençli D 45 ul, her bir faj bir seyreltinin 5 ul ekleyin. E. coli bir çok oyuklu bir plaka içerisinde log fazı büyümesinde hücreler (= 0.4-0.8 OD 600), hava alabilir bir contalı kapak ve bir 2.5 cm orbital sallayıcı içinde 30 dakika boyunca 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
  7. Plaka, 5 g / ml karbenisilin 100 ile takviye edilmiş bir önceden ısıtılmış agar plakası üzerine kuyuların herbirinden enfekte olmuş hücrelerin ul ve koloniler görünür olana kadar 37 ° C 'de O / N büyür.
  8. Aşağıdaki gibi toplam faj / ml hesaplayın:
    En sulandırmak örnek x 200 x 10 i (i = maksimum num bir carbenicillin plaka üzerinde kolonilerin Faj / ml = sayıseyreltmelerin ber hangi kolonileri) belirgindir.
  9. Aşağıdaki gibi kütüphane çeşitliliğinin kapsama sağlamak için, kaplanmış antijen kuyu sayısını belirlemek için, hesaplayın:
    Kaplanmış antijen kuyuların sayısı gerekli =
    İstenilen kat kapsama * kütüphane çeşitliliği
    100 ul başına faj içinde

Faj-görüntülenen Kütüphaneler 3. Antikor Seçimi

3.1) Antijen Hareketsizleştirme

  1. Antijen kalitesini etkileyebilir ve dilüsyonları kolaylaştırmak için, 96 gözlü plakalar olmayan bağlanma için 100 x çalışma konsantrasyonlarda (örneğin, 500 ug / ml) ve kısım normalize stok antijen proteini plaka hazırlanması donma-erime döngülerinden kaçınmak için.
  2. PBS ile stok plakalarından seyreltilmesi ile seçimleri her turda bir gün önce hisse senedi protein çözümleri antijen kaplı tabak hazırlayın.
  3. Ceket 96 oyuklu GST-etiketli antijen proteini veya negatif kontrol, p 100 ul yüksek protein bağlanması polistiren plakalarrotein PBS içinde 5 ug / ml'de (GST BSA, nötravidin, vs.). Bir mikro-plaka karıştırıcısı üzerinde 250 rpm'de 4 ° de CO / K çalkalayın.
  4. Mikro kaplanmış protein çözeltisi çıkarın (1x PBS pH 7.4 içinde% 0.2 BSA) tampon maddesi bloke 200 ul antijen kaplı ve negatif seçim plakaları bloke eder ve 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında 250 rpm'de çalkalanır.
  5. Bloke edildikten sonra,% 0.05 Tween (PT), ya elle ya da otomatik bir mikro yıkayıcısı kullanılarak tampon 1x PBS pH 7.4, 200 ul bloke protein kaplı plakaları dört kez yıkayın.

3.2) Kütüphane Ön temizleme ve Antijen-faj Kuluçka

  1. Olmayan kütüphanesi tüketmek (veya etiketi-) negatif kontrol proteini ya da serbest afinite etiketi ile kaplanmış kaplara bir dizi PBT tampon maddesi içinde hazırlanmış faj kütüphanesinden 100 ul (10 ila 12 faj) transferi yoluyla spesifik bağlanma faj gösterimli antikor fragmanı klonlar protein (örneğin GST) hedef sayısına eşit ve faj inkübe250 rpm'de çalkalanarak oda sıcaklığında 1-2 saat için yuvalar içinde.
    Not: alternatif bir ya da negatif seçim için ek aracı olarak, inkübasyon daha da spesifik bir hedefin kurtarma etiket bağlayıcı bulunan klonları ortamdan uzaklaştırmak ve geliştirmek için fazla miktarda (5-25 uM), çözünür protein afinite etiketi (örneğin GST) varlığında gerçekleştirilebilir klonları bağlayıcı.
  2. Antijen kaplı plakalara negatif seçim transfer faj süpernatan ve spesifik bağlama klonlarının yakalanması için 250 rpm'de çalkalanarak oda sıcaklığında 1-2 saat süre ile inkübe edilir.
  3. Bağlanmamış faj çıkarın ve mikrolevhanın kuyu yıkama, 8-15 kez PT tamponu ile elle veya bir mikroplaka yıkayıcı kullanırken. Elüsyonun hemen önce aşırı yıkama tamponu çıkarın.

3.3) Elüsyon, Enfeksiyon ve Phage Amplifikasyon

  1. Erken seçim gününde, T1 faj dirençli E. tek bir koloni almak 50 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen ve 37 ° C'de wi büyümeye 2YT ortam 1 ​​ml coli hücreleri2.5 cm'lik orbital çalkalayıcı veya eşdeğeri 200 rpm'de sallayarak inci.
  2. Hücre büyümesi kurulmuş ve gözle görülebilir bir kez 2YT (genellikle seçim başına 100 ul de), enfeksiyon için yeterli bir hücre hacmi sağlamak için 50 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen ile ortamın hacmini arttırırlar.
  3. Daha sonra bağlı faj, 30 dakika boyunca 37 ° C'de yıkandı antijen tabağa, 100 ul ve sallayın elüt edilmesi için, 0,4-0,8 600 ulaşıldığında bir OD (yaklaşık 5-7 saat) kadar hücreler büyür.
  4. 1 10 x 10 hücre / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar M13K07 yardımcı faj eklenir ve 200 rpm'de çalkalanarak 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. 2YT 1.2 ml hücreleri aktarın 150 ug / ml karbenisilin ve 75 ug ile takviye / ml kanamisin 2.5 cm, 200 rpm'de çalkalanarak, 37 ° C'de, V-altlı ve büyümek O / N olan bir 96-iyice derin sağlam blok yörünge çalkalayıcı.

3.4) Faj hazırlanması ve Selec tekrarlanan yuvarlarsiyon

  1. Santrifüj ile pelet bakteriler, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4000 x g'de.
  2. 10X PBT 10/1 inci hacmi ile nötralize etmek ve karışımı, küçük bir tüp 96-çukurlu, steril mikro mavi kutu kopya plakalarda faj yüzer eşit hacimlerde karıştırın. Seçim tekrarlayın mermi 3-4 tur için (Adım 3.1.1 başlayarak) veya zenginleştirme görülünceye kadar negatif kontrol proteine ​​göre (Bölüm 4. ve 7.).
    Not: seçim erken turlarda önemli / tespit zenginleştirme beklenmemektedir zaman (yani 1 yuvarlar ve 2), (Şekil 3'te gösterildiği gibi, Bölüm 7 ve örnek sonuçları tarif edilmiştir), giriş ve çıkış faj titrelerinin ölçümü sağlamada yararlı olabilir en az faj (Tartışma tarif edilmiştir) başarılı seçimler için konsantrasyonlar ve bir araya ELISA daha uygundur.

Toplanmış ELISA ile 4. Karakterizasyon

  1. Ceket 96 oyuklu yüksek protein-bağlamaBölüm 3.1'de göre 2 ug / ml bir antijen proteini ya da negatif kontrol proteini (GST BSA, nötravidin gibi) GST-etiketli 100 ul polistiren plakaları ing ve 4 ° CO / N olarak çalkalanır.
  2. , Fazla antijen çıkarın mikro çalkalayıcı içinde 250 rpm'de, oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca çalkalanarak blokaj tamponu içinde 200 ul plaka blok ve her iki el ile ya da otomatik plaka yıkayıcı ile 200 ul PT tamponuyla dört kez yıkayın.
  3. (: 10-1: 1 seyreltilmiş PBT tamponu içinde 20), faj üst fazı, 100 ul uygulayın, 200 ul PT tamponu ile, sekiz kez oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 250 rpm'de sallamak ve plaka yıkanır.
  4. (: PBT tamponunda 5,000 1) 100 Anti-M13-HRP ul ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika için 200 rpm'de çalkalanır, daha sonra 200 ul PBS ile iki kez plaka altı 200 ul PT tamponuyla kez yıkayın.
  5. 1 100 ul uygulanır: 1 TMB substratı ve 5-15 dakika için geliştirme (ya da önemli bir renk gelişene kadar), daha sonra 1 MH 3 100 ul ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun PO 4 ve 450 nm'de plaka okuma.
  6. Genel olarak, faj havuzları zenginleştirme> 2 (Bakınız Şekil 4) spesifik olmayan bağlanma karşı spesifik bağlanma oranı olarak mermi 3-4 gözlenebilir
    NOT: Bu benzeşme etiketi protein yüksek mutlak bağlayıcı sinyal dikkat bilgilendirici etiket özel bağlayıcı (yerine hedef bağlayıcı değil) zenginleşmesine gösterir, ve negatif kontrol protein yüksek mutlak bağlayıcı sinyal "non-spesifik veya zenginleştirme gösterir yapışkan "bağlayıcı maddeler.

5. Klon Seçimi, Sıralama ve Karakterizasyonu

Tek Fab faj klonlarının 5.1) İzolasyon

  1. , Sıralama ve karakterizasyonu için bireysel klonlar izole T1 faj dirençli E. çoğaltılan faj havuzu 1/10 inci hacmini bulaştırmak için E. coli, bir yuvarlak dipli mikrotitrasyon plakasına büyüme log fazında hücreler (= 0.4-0.8 OD600), bir Breatha ile kapakble plaka contası ve 37 ° C'de 30 dakika süre ile, 200 rpm'de çalkalayarak kuluçkalayın.
  2. 2YT ortamı içinde 10-kat seri dilüsyonları hazırlayın ve ug / ml karbenisilin 100 ile takviye edilmiş ayrı agar plakaları üzerinde plaka.
  3. 1 x 10 9 M13K07 faj / ml ile takviye edilmiş 2YT / karbonhidrat ortamı 450 ul tek koloniler ve 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe mini tüp 96 çukurlu steril mikro kutu mavi O / N büyür.
  4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 4,000 x g hızında eğirme Pelet bakteri.
  5. Yada (Bölüm 5.4 de tarif edildiği gibi) klonal faj süpernatan Fab faj klonlarının sıralama için kullanılabilir klonal direkt bağlanması (Bölüm 5.3 ve 21 de tarif edildiği gibi) olan temsil edici sonuçları Şekil gösterilmiştir hareketsiz antijenlere karşı özelliklerinin belirlenmesi için ELISA'lar 5.

Karakterizasyon için Fab klonlarının 5.2) sentezlenmesi

  1. Aşağıdaki uygun bir e klonlamaXPression vektörü (Tartışma), tek E. almak E. coli ifadesi ile dönüştürülmüş koloniler steril kürdan veya pipet kullanarak 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de 12-16 saat boyunca büyümeye bir 96 gözlü derin gözlü plaka içinde 2YT / karbonhidrat eden 1 ml'lik ortam ile de oluşturur. Bu, ya elle ya da otomatik bir koloni toplayıcısı ile yapılabilir.
  2. Studier et al metodoloji uyarınca bir 96 yuvalı derin bölmeli blok glikoz / laktoz / gliserol ile takviye NZY ortamı 1,5 ml büyüyen kültürün 40 ul transfer. 15
    Not: Alternatif olarak, hücreler 1 mM IPTG eklenmesi ile meydana takviye olmayan ve protein ekspresyonu 3-4 saat (OD 0.8-1.0) için yetiştirilebilir.
  3. Bir hava contası kültür blok (lar) kapatılır ve 200 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de 6-8 saat boyunca Fab klonlarından ifade eder. 15 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüj plakalar, bakteriyel hücreler pelet liziz kadar -20 ° C 'de pelet folyo conta ile yüzer, kapak plakaları kaldırmak ve dondurulur.
  4. Liziz tamponu, 100 | il (Tris HCI 50 mM, 200 mM NaCI,% 1.25 Triton X-100, pH 1 mg / ml lizozim ve 10 U benzonaz / ml kültür ve proteaz inhibitörleri ile 8.0) ile toplanmıştır peletler ifade edilen Fab'ler kurtarmak ve 2 çalkalanarak 4 ° C 'de sa.
  5. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüj ile hücre artıkları çıkarın ve ELISA plakaları (Bölüm 5.3) ile özgüllük İlk özellik kazandırmaya kullanılmak üzere ham lizat supernatant toplamak.

Klon Fab ELISA Binding Doğrudan tarafından 5.3) Klon Karakterizasyonu

  1. Bunun yerine, bir 384 gözlü bir levhanın gözleri PBS içinde 2 ug / ml antijen, 30 ul aliquotting Bölüm 3.1'de tarif edildiği gibi antijenleri hareketsiz. 96 kanal-tabanlı dağıtım kafaları kullanırken plaka Quad-tabanlı antijen düzenleri reaktif transferini kolaylaştıracak. Bölüm 3.1 uyarınca yıkayın ve blok ELISA plakaları.
  2. Toplanan temizlendi lizatları Bölüm 5.2 eva immobilize antijen doğrudan uygulanabilirbağlanmasının luation. 200 rpm'de çalkalanarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca oyuk başına lizat 30 ul inkübe edin.
    Not: Saflaştırılmış Fab klon proteini alternatif olarak tarif edildiği şekilde, PBT tamponu içinde 10 ug / ml'ye dilüe edilir ve antijeni veya negatif kontrol proteini (GST BSA gibi) ihtiva eden bloke edilmiş gözlere Her klon, 30 ul uygulanarak ve geliştirilerek kullanılabilen Aşağıda. Alternatif olarak, Fab faj ayrıca faj süpernatan 10 ul seyreltilmesiyle kullanılabilir 20 ul PBT tamponu (Bölüm 5.1'de tarif edilen) (1: 3) ve (Adımlar 4.4 tarif - 4.5), anti-M13-HRP antikorları ile bulgulanması
  3. Fazla Lisatı çıkarın ve elle veya otomatik bir plaka PT tamponu 8x 100 ile ul yıkanır ve fazla tampon kaldırmak kullanarak kuyu yıkayın.
  4. 200 rpm'de çalkalanarak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBT tamponu içinde sekonder anti-FLAG antikoru 5000 seyreltme: 1 30 ul inkübe edin.
  5. Yıkama, geliştirmek ve Bölüm 4.3 uyarınca ölçmek - 4.5.
    NOT: Temsilcisi sonuçlarıgösteren spesifik ve spesifik olmayan hem de bağlama klonları, Şekil 5'te gösterilmiştir.

5.4) Klon Sıralama

  1. Tablo 2'de gösterildiği gibi, bir PCR ana karışımı hazırlayın.
  2. PCR bir levhanın gözleri içine uygun primerler ile hazırlanan PCR ana karışımı 20 ul uygun PCR şablonu (faj üst fazı veya yeniden süspansiyon haline tek, fajemid ihtiva eden bakterilerin koloni olarak) 2 ul ekle.
    Not: Ayrı ana karışımlar, hem ağır hem hafif zincir genleri sekanslanması için gereklidir.
  3. PCR Ayarlar - Tablo 2'de listelenen parametreler kullanılarak, PCR reaksiyonu şu koşullarda yürütülmüştür.
  4. 300 mil transilluminator'de DNA görselleştirme leke ve görüntüleme ile takviye edilmiş,% 1 agaroz jeli üzerinde yükleme boyası ile tamamlanmış reaksiyon 5 ul karıştırarak PCR reaksiyonunun başarılı olduğunu doğrulamak.
  5. 0.2 ihtiva eden steril su, 10 ul PCR ürün 2 ul ekleVe eksonükleaz ve karides alkalin fosfatazı her ul sıralama için hazırlık fazla primerler çıkarmak için 10 dakika boyunca 80 ° C'de enzim inaktivasyonunun, ardından 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.

Otomatik Seçimleri için 6. Ölçeklendirme

6.1) Pipet-tabanlı Sıvı Taşıma

  1. Bir% 1 Hazırlama su içinde (ağırlık / hacim) bromofenol mavisi ve 0.45 mi filtre kullanılarak çözülmeyen partikülleri çıkartmak.
  2. (16 seyreltme toplam), su içinde% 1 bromofenol mavisi çözeltisi 1000 seyreltme, ve iki misli seri seyreltileri ile devam: plaka okuyucusu üzerinde absorbans doğrusal aralığını belirlemek için, bir 1 hazırlayın.
  3. Düz tabanlı 96 çukurlu bir levhanın her seyreltme oranından 100 ul aktarın ve 590 nm'de absorbans okundu. Arsa mutlak seyreltme faktörü karşı absorbans ve sonraki testler için lineer aralığı yüksek sonunda orta bir seyreltme seçin.
  4. Su veya fiili çözüm bromofenol mavisi ekleÜç 96 gözlü plakalara pipetle için yeterli hacim içinde önceki aşamada seçilen seyreltme, ayrıca rezervuar ölü hacmine bağlı olarak pipetle edilecektir.
  5. Bir analitik terazi üzerine su pipetle test hacmi verecek şekilde tek kanallı pipet kalibre su (100 ul, oda sıcaklığında, 100 mg ağırlığında).
  6. Kalibre pipet kullanarak, üç kopya halinde, 590 nm 'deki absorbans bir yassı dipli, 96 gözlü bir levhanın en az üç kuyu için boyalı çözeltinin Test hacim transferi ve okuyun.
  7. Bir analitik terazi üç boş düz tabanlı 96 kuyu plakaları tartılır ve onların kitleleri kaydedin.
  8. Hazneden üç 96 gözlü levhalar her birine ve üç kopya halinde, 590 nm'de absorbans ölçümü Pipet test hacmi.
  9. Her plaka tartın ve kütle farkı hesaplar.
  10. İlk olarak, (örn., +/-% 5) her bir çukuruna absorbans tolerans aralığında düzgün olup olmadığını değerlendirmek ve inci ile uyumlu olup olmadığınıkalibre Pipetman el-pipetleme ile elde e absorbansları. Belirli kanallar sürekli aşırı veya az teslim iseniz, (örneğin bakınız Şekil 6) onarım prosedürleri takip ve tüm kanallar üniforma birimleri teslim kadar değerlendirme prosedürü tekrarlayın.
  11. İkincisi, bir kez tüm kanallar kuyu başına, üniforma hacimleri teslim ortalama kütle farkı hesaplayarak bu hacmin doğruluğunu kontrol etmek teyit edilmiştir. Örneğin, 100 ul için mükemmel kalibre edilmiş sıvı işleyici grubu plaka başına su 9.60 g, ya da su, 0.10 g oyuk başına sağlayacaktır. Teslim gerçek hacmi sürekli üzerinde veya amaçlanan hacim altında ise, o zaman bir düzeltme faktörü, yani aslında 100 ul sunmak için 110 ul programlama, uygulanabilir.
    NOT: Küçük hacimler için, örneğin, 10 ul ab sağlamak için, elle 96 oyuklu plakalara 90 su ul boyanmış çözelti içinde daha fazla bromofenol mavisi ve ön kısım on kat kullanımısorbances lineer aralıkta ölçülebilir ve sonbahar vardır.

6.2) Otomatik Plaka Yıkama

  1. Bölüm 3.1'de tarif edildiği gibi 96 ayrı kuyuların de (her bir durum için iki tabak test edilecek) mikro pozitif hedef ve negatif kontrol proteinleri hareketsiz.
  2. Oda sıcaklığında bir saat için bloke etme çözeltisi ile kuluçkaya yatırılması ile spesifik olmayan bağlanma yerleri bloke eder.
  3. 10 13 cfu özdeş 100 ul alikotları ekleme / Tüm plakalara tüm oyuklara PBT Fab faj çözeltisi bağlayıcı hedef ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında hafif ajitasyon ile inkübe ml.
  4. Her bir durumda, enfeksiyon ve titrasyon ve ELISA için, bir plaka, bir plaka göre iki tabak yıkayın.
  5. (Bölüm 4'te tarif edildiği gibi), anti-M13 HRP antikoru ve kolorimetrik alt-tabaka ile ya da geliştirme ((M13K07 ilavesi) ve 7.2.1 olmayan Bölüm 3.3 de tarif edildiği gibi) bakteriler ve titrasyon direkt enfeksiyonu ile yıkama etkinliğini değerlendirmek.
  6. Faj titreleri from spesifik klonlann genellikle klon spesifik olarak bağlanan kendisine karşı bir hareketsiz hale getirilmiş proteine ​​10 5 -10 7 faj / ml aralığında sağlayacaktır. Negatif kontrol protein (örneğin, BSA) Bazı kalıntı bağlama hangi tehlikeye düşürebilecek, beklenen ve genellikle 10 -10 2 5 faj / ml gözlenir, ancak çok düşük titreleri (yani., <10 1) aşırı sıkı yıkama sinyal olabilir olduğu Bir seçim.
  7. Faj ELISA ile belirlenmiştir bağlanma için robotik yıkama kurulan el yıkama sonuçları (Şekil 7) denk ise, pozitif ve negatif kontrol proteinleri belirlemek için, mutlak bağlayıcı sinyalleri karşılaştırmak.

6.3) Plaka Yıkama atım

  1. Başlatmak için, test edilecek dekontaminasyon protokolünü çalıştırın.
    NOT: En az iki kat toplam hat hacmini kullanarak ve başbakan ve 5 dakika içinde% 0.5 sodyum hipoklorit için yıkama kafasını emmek tavsiye, taze seyreltilmiş from ticari ağartıcı (tipik olarak% 6 sodyum hipoklorit).
  2. Çizgiler kadar Başbakan ve steril (otoklav), su içinde 5 dakika boyunca yıkama kafasını ıslatın ve nihayet, Başbakan sistem hava dolu.
  3. Prime steril su ya da yıkama tamponu ile hatları.
  4. Bir zamanlar steril 96 kuyu mikroplağı yıkayın yıkama kaldırmak ve steril plaka mühür ile mühür. Bu ön-kirlenme kontrolü plaka.
  5. Kısım O 100 ul / K, 96 gözlü bir levhanın tüm oyuklara faj kültür süpernatanı ile yükseltilir.
  6. Bir kez faj içeren plaka yıkayın, daha sonra yıkama kaldırmak ve plastik veya folyo plaka mühür ile mühür. Bu kirlenme kontrolü plaka.
  7. Dekontaminasyon protokolü yürütmek test edilir. Bu örnekte, tekrar 6.3.1 ve 6.3.2 adımları.
  8. Kez steril mikroplağı yıkayın sonra yıkama ve mühür kaldırmak. Bu dekontaminasyon testi plaka.
  9. Log fazı E. Plaka 50 ul titrasyon plakaları E. coli; Bu ön-enfeksiyonu olanyon kontrol plakası.
  10. Ön-kirlenme, kirlenme ve dekontaminasyon 96 oyuklu plakalar açmak ve E. 100 ul her bir oyuk için yeni ipuçları kullanan tüm oyuklara log-faz büyüme aşamasında coli.
  11. Kapatın ve 200 rpm'de 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  12. Levha 50, 10 cm 2YT / karbonhidrat plakalarına her 96 oyuklu plakanın rasgele üç kuyu enfekte olmuş hücrelerin ul ve 37 ° CO / N inkübe edin.
  13. 1 ml'lik 2YT artı oyuk başına 100 ug / ml karbenisilin içeren derin oyuklu plakalara her plakanın tüm oyuklara transfer enfekte hücreleri 50 ul ve 37 ° C 'de O / N büyür.
  14. Dekontaminasyon protokolünü tekrarlayın ve çizgiler kurumaya bırakın pulu.
    Not: plakalar üzerinde ya da sıvı bir ortam içinde Resim O / N büyüme öncesi enfeksiyon kontrolü, ön-kirlenme kontrol veya dekontaminasyon test plakları üzerinde dikkat edilmelidir. Birçok koloniler ve büyüme kirlilik kontrolü plaka üzerinde dikkat edilmelidir; etkinliği hakkında değilse, hiçbir sonuçarındırma protokolü yapılabilir. İdeal olarak, dekontaminasyon plakaları hiçbir koloniler ve O / N plakalarının havuzlarına hiçbirinde O / N büyüme verecektir. dekontaminasyon protokolünün sıkılığı, yüksek ağartma konsantrasyonları artmış uzun süreleri ve ek döngülerini emmek olabilir.

7. Giriş / Çıkış Titrasyonları

7.1) Giriş Phage Titrasyonları

  1. Steril olarak filtreden geçirilmiş, PBS ile 50 ul faj 5 ul kısım seyreltin ve karıştırın.
  2. Çok kanallı bir pipet ya da 96 kanallı pipet kullanılarak 10, 10, steril olarak filtreden geçirilmiş, PBS içinde 10 kat seri seyreltme hazırlayın.
  3. T1 faj dirençli E. 45 ul içinde seyreltilmiş faj 5 ul inoküle büyüme (OD 0.6-0.8) ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca bir hava contası ile kaplı inkübe log fazında coli hücreleri.
  4. 100 ug / ml karbenisilin ve O / N inkübe ile takviye edilmiş LB / agar plaka ile enfekte olmuş hücrelerin Levha 5 ulT, 37 ° C'dir.
  5. faj konsantrasyon kolonileri Bölüm 2.8 ayrıntılı hesaplamalara göre göründükleri en seyreltilmiş örnekten tahmin edilebilir.

7.2) Çıkış faj Pitrations

  1. E. eklenerek levha bağlı faj elüsyon tarafta coli hücreleri, otoklave 2YT ortamı ile 50 ul faj ile enfekte edilmiş bir hücre 5 ul kısım seyreltik
  2. Çok kanallı bir pipet ya da 96 kanallı pipet kullanarak 10 6 otoklava 2YT ortamı içinde 10 kat seri seyreltme hazırlayın.
  3. Levha 5 ila 100 ug / ml karbenisilin ile desteklenmiş bir agar plaka üzerine enfekte olmuş hücrelerin ul ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
  4. faj konsantrasyon kolonileri Bölüm 2.8 ayrıntılı hesaplamalara göre göründükleri en seyreltilmiş örnekten tahmin edilebilir.
    NOT: Her iki durumda (yani da, giriş ve çıkış faj titreleri, hem tetrasiklin koloni numaraları ile karşılaştırılması (toplam cell sayı) ve kanamisin (yardımcı faj titre) de bilgilendirici olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tarif edilen protokol paralel Birleşimsel faj gösterimli Fab kütüphanelerinden structurally- ve işlevsel olarak bağlı antijen alanlarının ikisinin de çeşitli antikor fragmanlarının izole edilmesi için kullanılmıştır. Antijen durumu ile ilgili sorunlar antikor seçiminde 23 için uygun olan eksprese antijen etki silico tanımlanmasında göre, pek çok durumda, atlatılabilir. Aynı laboratuar içinde antikor seçimi için (Şekil 1) bir antijen ifade bağlanması ile, seçime Kritik antijen parametre...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro antikor seçimleri yapılırken, seçim başarısı iki temel belirleyicileri üzerine seçilmesi için) iyi katlanmış antijenik hedefler izolasyon 1 ve 2) yüksek fonksiyonel çeşitlilik antikor kütüphanesinin fırsat. Bir çok durumda, iyi bir şekilde katlanmış, tam-boy proteinin yeterli miktarda bulunması sınırlayıcı olabilir. Bu sınırlamayı aşmak için bir yaklaşım, uygun bir afinite etiketine sahip bir bakteriyel ekspresyon vektörü içine sokulması için biyoinformatik analizi 22 tanımlanır ve ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz NIH Ortak Fonu kabul etmek istiyorum - Protein Yakalama Reaktifler Programı Rekombinant Antikor Ağ antikor seçimi ve karakterizasyonu boru hattı ve robotik seçim platformunun finansman alımı için Yenilik Kanada Vakfı gelişimini finansmanı için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
MALZEMELER
New Brunswick Innova44 istiflenebilir inkübatör çalkalayıcıEppendorfM1282-0004
Liquidator 96 kanallı manuel tezgah üstü pipetleme sistemiAnachem LtdLIQ-96-200
Mikroplaka çalkalayıcıVWR12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 tezgah üstü santrifüjTermo Ürün
ELx405 Select Derin Kuyu Mikroplaka YıkayıcıBiotekELX405USD
Özel Yüksek Verimli Otomatik Faj Seçim RobotuS & P Robotics
Plastik konik Falcon tüpü: 50 mlVWR21008-178
Plastik konik Falcon tüpü: 15 mlVWR89039-668
Axygen 1.7 ml mikrosantrifüj tüpleriCorningMCT-175-LC
96 kuyulu/384 kuyulu Maxisorp plakasıSigmaM9410-1CS
Corning 96 kuyulu V-dipli derin kuyu bloğuCorning3960
Axygen Mini tüp 96 kuyulu steril mikroplaka mavi kutuCorningAXY-MTS-06-CRS
Şirket AdıKatalog Numarası
polietilen glikolBioshopPEG800.1
maya özüBioshopYEX401.1
biyo-triptonBioshopTRP402.1
NZ aminSigmaC7290
glikozSigmaG8270-1KG
laktozBioshopLAC234
gliserolBioshopGLY001.500
karbenisilin ve nbsp;BioshopCAR544.10
kanamisinBioshopKAN201.25
tetrasiklin ve nbsp;BiyoshopTET701.25
Tween 20BiyodükkanTWN510.500
monobazik potasyum fosfatBiyoshopPPM302.1
dibazik sodyum fosfatAnachemia84486-440
sodyum klorürBioshopSOD001.10
potasyum klorürBioshopPOC308.1
kalsiyum klorürBioshopCCL302.500
magnezyum sülfatEMDMX0070-1
magnezyum klorürBioshopMAG510.500
NH4ClAmresco0621-1KG
Na2SO4BioshopSOS513.500
agarBioshopAGR001.500
SybrSafe DNA jel lekesiInvitrogenS33102
fosforik asitAcros Organics201140010
lizozimBioshopLYS702.25
benzonazNovagen71205
Triton X-100BioshopTRX506.500
proteaz inhibitörü kokteyli tabletlerRoche11 836 170 001
Ni-NTA reçinesi Qiagen1018240
1.000x yardımcı faj (M13K07) stoğu (ml başına 1013< / sup> faj)NEBN0315S
HRP konjuge M13-spesifik antikor (anti-M13-HRP).GE Healthcare27-9241-01
TMB substratı: eşit hacimlerde TMB ve H2Osub>2 peroksidaz substratı  karıştırın;KPL50-76-00
dNTP'lerBiyotemelDD0056
Taq polimerazGenscriptE00007
EksonükleazGE Sağlık EZ0073X-EZ
Karides alkalin fosfatazGE HealthcareE70092Z-EZ
75004525 Nefes alabilen yapışkan plaka sızdırmazlık filmi VWR 60941-084 REAKTİFLER

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
  2. Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
  3. Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254(2007).
  4. Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
  5. Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
  6. Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
  7. Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
  8. Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
  9. Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
  10. Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
  11. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
  12. Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
  13. Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
  14. Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
  15. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
  16. Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
  17. McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
  18. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  19. den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
  20. Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
  21. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).
  22. Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
  23. Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
  24. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
  25. Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Faj EkranlamaAntikor Se imiSentetik K t phanelerFab FajAntijen mmobilizasyonuParalel Se imS v Aktar m SistemiRobotik OtomasyonELISA Do rulamas

İlgili makaleler