Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hidrolize Çapraz bağlayıcılar yoluyla Adenoviral vektörler gergin kullanma Metalik Stent Yüzeylerden Vasküler Gen Transferi

9.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51653

⸱

12 Ağustos 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

Bu makalede

Özet

Bu çalışmalar, adenoviral gen vektörlerinin stentlerin ve model ağ disklerinin kaplamasız metal yüzeylerine geri dönüşümlü bağlanmasını rapor etmektedir. Vektör immobilizasyonu için kullanılan çapraz bağlayıcıların hidrolizine bağlı olarak transdüksiyona yetkin viral partiküllerin sürekli salınımı, vasküler hücrelerde ve stentli arterlerde dayanıklı bir bölgeye özgü transgen ekspresyonu ile sonuçlanır.

Özet

Stent restenoz yaygın koroner ve periferik arter kritik daralmış kesimleri ile yeniden kurmak kan akışı için kullanılan stent tabanlı revaskülarizasyon işlemlerinin önemli bir komplikasyon sunar. Alternatif bir strateji sunmak anti-restenotik aktiviteye sahip genlerin ayarlanabilir serbest bırakabilen Endovasküler stentler halen ilaç salınımlı stentler kullanılan. Tipik olarak, vektörün fiziksel olarak yakalanmalarında için kullanılan polimer kaplamalarla ilişkili aşırı bir enflamatuvar yanıtı kaçınarak klinik kullanımlarını elde etmek amacıyla, gen salınımlı stent, stent hareketsizleştirilmiş gen vektörü serbest bırakılması ve damar siteye özgü iletimi öngörülebilir kinetiklerle gösterirler. Bu çalışma, bisfosfonat (PABT) hidroliz olabilen bir çapraz bağlayıcıların (HC) ile paslanmaz çelik yüzeyi uğratılmış polialilamin için adenoviral parçacıklarının geri bağlanmasına dayalı stentlere adenoviral vektörlerin gen coatless bağlanması için ayrıntılı bir yöntem anlatılmaktadır. Bir aile5 ile 50 gün arasında değişen zincir içinde bir ester hidroliz reaksiyonuna ortalama t 1/2 ile iki işlevli (amın ve tiol-reaktif) HC stent vektör bağlamak için kullanıldı. Vektör hareketsizleştirme prosedürü, 9 saat içinde gerçekleştirilir ve çeşitli adımlardan oluşur: PABT (4 saat) bir sulu çözelti içinde metal numunelerin 1) inkübasyon; Tris (2-karboksietil) fosfin (20 dk) ile PABT yüklü tiyol gruplarının 2) korumanın giderilmesi; Pırıdıldıtıo (PDT) grup (2 saat) ile derive edilmiş polietilenimin ile reaksiyona sokulması ile numune metal yüzeyin tiol reaktif kapasite 3) genişlemesi; Ditiyotreitol (10 dakika) ile tioller PDT grupların 4) dönüştürülmesi; HC (1 saat) ile adenovirüslerin 5) değiştirilmesi; Boyut dışlama sütun kromatografisi (15 dakika) ve tiollenmiş çelik yüzeye (1 saat), tiyol-reaktif bir adenoviral parçacıkların 7) immobilizasyon ile modifiye edilmiş adenovirüs partiküllerinin 6), saflaştırma. Bu teknik, stentlerin ötesinde geniş potansiyel uygulanabilirliği vardırİmplante edilen yabancı maddelerin ara-yüz hücrelere tabaka aracılı gen aktarımı yoluyla biyolojik uyumluluğunun geliştirmek için biyoprotez cihazların yüzeyi mühendisliği kolaylaştırarak.

Giriş

Bir tedavi yöntemi olarak gen tedavisinin etkinliği gen terapi vektörleri 1,2 fakir hedefleme kapasitesi ile engellenmektedir. Hedef bölgede transgen ekspresyonunun alt terapötik seviyelerinde uygun hedefleme sonuçları eksikliği ve vektör ve kodlanmış bir terapötik ürün 4, her iki karşı bağışıklık karşılıklarının monte edilmesi için sorumlu olanlar da dahil olmak üzere, hedef olmayan organlar 3 e vektörleri yayılmasına yol açar 5. Bir potansiyel transdüksiyon karışıklık dengelemek ve hedefleme kan ve lenf yolu ile serbest yayılmasını önleyen bir formunda, istenen konuma gen vektörlerin tanıtmaktır teşvik etmek anlamına gelir. Tipik haliyle, bu çabalar fiziksel th tutulmasıyla da enjeksiyon yerinde geçici olarak sürdürülmesi gen vektörlerin sahip olan fibrin, kollajen veya hiyalüronik asit hidrojel matrisler 6-10 ile karıştırılır, viral veya viral olmayan vektörler ya da lokal olarak oluşan enjekte edilebilir bir dağıtım sistemlerine bağlıBir polimerik ağ-em.

Gen tedavisi için lokalize bir diğer genel olarak kabul edilen bir paradigma implante prostetik cihazların 11,12 yüzeyinde gen vektörlerin immobilizasyon kullanmaktadır. Kalıcı tıbbi implantlar (endovasküler, bronş, ürolojik ve gastrointestinal stentler, kalp pilleri, yapay eklemler, cerrahi ve jinekolojik kafesleri, vb.) Hastaların 13 on milyonlarca yıllık kullanılmaktadır. Genellikle etkili iken, bu cihazlar yetersiz güncel tıbbi uygulamalar 14-17 tarafından kontrol edilir komplikasyonlara yatkındır. Implante edilebilir protez cihazlar lokalize gen tedavi için proxy platformları olarak hizmet için eşsiz bir fırsat sunuyoruz. Farmakokinetik açısından, thei kinetiklerini implant / doku arayüzde gen vektörlerin yüksek lokal konsantrasyonlarda alınmasında ve yavaşlayan gen vektörler sonuç nispeten düşük giriş dozlarda tıbbi implantlar yüzey türetilmesi kaynaktanBu konumdan r eliminasyon. Hedef alınan hücre popülasyonu ile uzun süreli bir ikamet sonucu ve daha iyi alınmasıyla olarak, vektör immobilizasyon gen vektörü yayılmasını minimize eder. Böylece, hedef dışı dokuların istenmeyen aşılama azalır.

(Aynı zamanda alt-tabaka-aracılı gen aktarımı ya da katı faz gen aktarımı olarak adlandırılır) implante biyomalzeme gen vektörlerin yüzey birleştirme kullanılarak hücre kültürü ve hayvan deneylerinde uygulanmıştır hem spesifik (antikor-antijen 18-20, avidin-biyotin 21,22) ve 23-26 (şarj, van der Waals) etkileşimler spesifik olmayan. Yüzey ile aşırı güçlü bağlar, hedef hücreler tarafından vektör içselleştirme engel yana implante edilmiş cihazın yüzeyine vektörlerin kovalent bağlanması, daha önce fonksiyonel olmayan olarak kabul edilmiştir. Yakın zamanda, bu sınırlama tet olarak kullanılan hidrolize edilebilir kendiliğinden çapraz bağlayıcı kullanımı ile aşılabilir olduğu gösterilmiştiradenoviral vektör 27,28 arasında stent ve kapsid proteinlerinin değiştirilmiş metal yüzey arasında onun. Ayrıca, taşıyıcıda salım hızı ve in vitro ve in vivo olarak transgen ekspresyonunun zaman seyri hidrolizi 28 farklı kinetik sergileyen hidroliz olabilen bir çapraz-bağlayıcıların kullanımı ile modüle edilebilir.

Bu makale aktif metal yüzeye adenoviral vektörlerin tersine çevrilebilir kovalent bağlanması için ayrıntılı bir protokol sağlamakta ve anjiyoplasti, stent sıçan şahdamarı modelinde kültürlenmiş düz kas ve endotelyal hücrelerin in vivo ve in vitro olarak takip eden transdüksiyon olayları incelemek için uygun bir deney düzeneği getirmektedir .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yayın deneyler için Cy3 etiketli Adenovirüs hazırlanması 1.

  1. (PH 9.3 CBB) karbonat / bikarbonat tamponu içinde 650 ul boş Ad, 2 x 10 12 parçacıkların (yaklaşık olarak 2 x 10 enfektif 11 birim) süspanse edin.
  2. 0.2 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona (2 Cy3 (NHS)) 1 mi CBB amin-reaktif floresan boya 1 şişe (0.2 mg) içeriği çözülür.
  3. 5 saniye boyunca virüs süspansiyonu, girdaba boya çözeltisinin 100 ul ekleyin ve (100-200 rpm) çalkalanarak 28 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir.
  4. PBS ile bir 20 mL Sefaroz 6B sütun dengelenmesi. Cy3 etiketli Reklam süspansiyon damla damla jel yatağının merkezine 750 ul ilave edin.
  5. Viral süspansiyon reçine nüfuz sonra, 5 ml PBS ekleyin. Eluatın atın.
  6. PBS, 0.5 ml ilave edilir ve etiketli bir cam kap içinde eluatın toplamak. On 0.5 ml'lik kısımlar olmak üzere toplam toplama bu adım 10x tekrarlanır.
  7. Deneyi inciE, viral DNA içeriğinden spektrofotometri (260 ve 280 nm) ile parçası toplandı.
  8. 260 nm'de, toplam (F1-F10 toplamı) optik yoğunluk (OD) arasında% 10'dan fazla ihtiva eden fraksiyonlar havuzda toplayın. Not: Genellikle fraksiyonlar F3, F4, F5, F6 ve bir araya getirilmiş ve karıştırılmıştır.
  9. Yeniden deneyde, viral DNA içeriği ve Cy3 için fluorometri (550 y / em 570 nm) ile spektrofotometri (260 ve 280 nm) ve tahlili ile karışık havuzlanmış fraksiyonlar sırasıyla kapsid proteinini etiketli. Not: Cy3 (NHS) 2 kalibrasyon eğrisi 10 -10 -13 -9 mol / L aralığında hazırlanmış ve flüorimetrik Bir araya toplanan fraksiyonlardan aynı plaka üzerinde test edilir kapsamaktadır.
  10. Etiketli virüs verim ve etiketleme yoğunluğu hesaplayın. 1.19 x 10 12 virüs parçacıkları / ml bir 1 cm yol uzunluğu 29 boyunca 1 OD birimine karşılık varsayalım. Verim = [(OD 260nm /1.19)*10 12 * V / giriş İlan tutarı] * 100, OD 260nm optik de olduğunu: formülü kullanın260 nm'de bir araya getirilmiş formülasyonun nsity V Reklam geri kazanım ürünü oranı (%) hesaplanması için bir araya getirilmiş formülasyon (mi) hacmidir. Aşağıdaki formül kullanılır: Etiketleme Yoğunluğu = C * 6.02 * 10 23 / ​​(ODc bir araya getirilmiş formülasyonun, Cy3 konsantrasyonu (mol / ml) ve OD 260 nm olan 260 nm /1.19)*10 12, bir araya getirilmiş formülasyonun optik yoğunluk olduğunu 260 nm ortalama Cy3 etiketleme yoğunluğunu hesaplamak için. NOT: etiketli virüsün tipik bir kurtarma giriş dozun>% 70 olduğunu. Etiketleme yoğunluğu tek bir virüs partikülü başına 600-800 floroforunun moleküller.
  11. Kısım tek tek salım deneyleri için uygun daha küçük bölümlerinin (tipik olarak 5 x 10 11 parçacıklar) boşalan Ad Cy3 etiketli. NOT: Şu an protokol sadece serbest deneyde Cy3 etiketli Ad kullanımını belirtir. Tüm transdüksiyon çalışmaları etiketli olmayan vektörler ile gerçekleştirilir.

Metal Örneklerinin 2. Etkinleştirme

  1. Paslanmaz s yıkayınTEEL izopropanol içinde arka arkaya diskleri veya paslanmaz çelik örgü stent (5 dakika x 2) ve kloroform çalkalanarak (100 rpm) ile 55 ° C'de (5 dakika x 2). Çözücüyü çıkarın.
  2. 200 ° C'de 30 dakika boyunca numune ısıtın.
  3. Suda kurulu gizli tiyol grupları (PABT 27,28,30) ile polialilamin bisfosfonat (100 rpm) çalkalanarak 72 ° C'de (w / v% 1-2) içinde çözülür. KHCO 3 4,5-5 pH ayarlama.
  4. (100-200 rpm) çalkalanarak, 72 ° C'de 2-4 saat boyunca PABT çözelti içinde bulunan metal örnekleri inkübe edin. NOT: Bu prosedür bu noktada durdu olabilir. Numuneler 4 ° C'de 3 gün boyunca stabildir.
  5. Çift damıtılmış su (DDW) ile üç kez örnekleri durulayın.
  6. Tris (2-karboksietil) fosfin etmek için örneklerin Açığa (TCEP, 0.1 M asetik tampon içinde 15 mg / ml) 28 ° C'de 15 dakika boyunca (100-200 rpm) izledi.
  7. Gazı alınmış DDW içinde 5x durulayın.
  8. (Kurulu piridiltiyo grubu ile PEI% 2 polietilenimin etmek için örneklerin Açığa Çalkalayarak (100-200 rpm hızında 28 ° C'de 2 saat boyunca bir argon atmosferi altında gazı giderilmiş DDW PDT 27,28,30)). NOT: Bu prosedür bu noktada durdu olabilir. Numuneler 4 ° C'de 2 hafta içinde stabildir.
  9. DDW ile numuneleri üç kez durulayın.
  10. Tioller piridilditiyo grupları dönüştürmek için 10 mg / ml ditiotreitol / DDW etmek için örneklerin maruz bırakmaktadır.
  11. Gazı alınmış DDW tekrar 5x durulayın.

3. Adenovirüs Aktivasyon ve Metal Yüzey İmmobilizasyonu

  1. (PH 9.3 CBB) karbonat / bikarbonat tamponu 487,5-495 ul Ad eGFP veya Reklam Luc ya da 5 x 10 11 partiküller (yaklaşık 5 x 10 10 bulaşıcı ünite) süspanse edin. Not: Cy3 İlan boş parçacıkları etiketli bırakma çalışmaları için, 5 x 10 11 kullanabilirsiniz (CBB ile 487,5-495 ul ses seviyesini ayarlamak).
  2. Orta derecede, (t 1/2 = 5 d) hızla (hidroliz oranlarını 28 [değişen HC çözülür (t 1 /2 = 12 gün) ve yavaş yavaş (t 1/2 = 50 d) 'HC örneğin, RHC IHC veya AVM Şekil 1] ya da olmayan hidroliz olabilen bir çapraz bağlayıcı (NHC), 20 mM'de CBB olarak sülfo-LC-SPDP.
  3. Hemen 500 ul (çapraz bağlayıcı 200-500 uM son konsantrasyon), girdap toplam hacim için virüs süspansiyon çapraz-bağlayıcı solüsyonun 5-12,5 ul ve (çalkalama ile 28 ° C'de 1 saat boyunca 100 ile inkübe 200 rpm).
  4. Gazı alınmış 5 mM EDTA / PBS (EPBS) ile 20 mi Sefaroz 6B sütun dengelenmesi. Reçine yatağının merkezine çapraz-bağlayıcı ile modifiye Reklam süspansiyonu 500 ul damla damla ekleyin.
  5. Gazı alınmış EPBS 5 ml. Eluatın atın.
  6. Gazı alınmış EPBS 0.5 ml ilave edilir ve etiketli bir cam kap içinde eluatın toplamak. Bu adımı on 0.5 ml fraksiyonların toplanması toplam 10 kez tekrarlayın.
  7. 260 ve 280 nm'de spektrofotometri ile toplanan kesitlerin OD belirlenmesi ve virüs titreleri (1.19 x 10 12 ug / mL için kulla OD dönüştürmek1 OD) 29'a ile donatılmışlardır.
  8. Ayrıştırılan virüsün>% 10 ihtiva eden fraksiyonlar havuzda (Not: Genellikle, fraksiyonlar F3-F6). Bir araya toplanan süspansiyon için spektrofotometrik tahlil titre tekrarlayın.
  9. (2,11) başı olarak aktive edilmiş metal örnekler ile şişeye viral süspansiyonun aktarın. (100-200 rpm) çalkalanarak 28 ° C'de 1 saat boyunca, argon atmosferi altında inkübe edin. Not: Bu aşamada elde edilen Ad-, bağlı metal örnekleri, ayrıca protokol bölümlerde 5-7 de tarif edilen daha sonraki serbest kalması ve nakil deneylerinde kullanılmaktadır.

PCR ile Yüzey ilişkili İlan Vektör 4. Kantitasyonu

  1. NHC, SHC, IHC ve RHC (n = her bir tipi için 3) 2 ve 3'te tarif edildiği gibi yoluyla gergin yüzeyi hareketsiz Reklam eGFP ile birlikte formüle kafesleri hazırlayın.
  2. Viral DNA izole etmek için bir QIAamp DNA Mikro kiti kullanın. B ATL 180 ul karışımından oluşan 200 ul ihtiva eden 1.5 ml'lik plastik tüplere tek tek kafes yerleştirinuffer ve proteinaz K 20 ul (hem kit). Aynı karışımı ihtiva eden ayrı tüplere (kalibrasyon eğrisi için standartları gibi) Reklam EGFP parçacıkların bilinen miktarda ekleyin. Gecede sallayarak olmadan 56 ° C'de inkübe edin.
  3. (Kit) AL tampon 200 ul, vorteks karışım% 100 etanol içinde 200 ul ekleyin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  4. 1 dakika boyunca 8,000 rpm'de bağımsız bir MinElite (kit) sütun ve bir dönüş üzerine her bir tüpten karışımı aktarın. Taze ALT tampon 180 ul örgü içeren tüpler durulayın, 1 dakika boyunca 8000 rpm'de ilgili sütun ve bir dönüş üzerine ekleyin. Elüsyonların atın.
  5. 1 dakika boyunca 8,000 rpm'de AW1 sütunlar halinde (kit) tampon ve spin 500 ul ilave edin. Elüsyonların atın.
  6. 1 dakika boyunca 8,000 rpm'de AW2 sütunlar halinde (kit) tampon ve spin 500 ul ilave edin.
  7. Elüsyonların atın.
  8. Unti ilave bir 3 dakika boyunca 14,000 rpm'de döndürünl sütunlar tamamen kuru. Elüsyonların atın.
  9. Sütunlara MilliQ-sınıf su 50 ul ekleyin. 5 dakika boyunca 14,000 rpm'de döndürün. (Kit), ayrı ayrı her bir toplama tüpüne sütundan elüsyon çözeltisi 50 ul toplayın.
  10. Güç SYBR Yeşil PCR aşağıdaki (12.5 ul Master Mix, [5'- ACG TAA ACG KİK ACA AGT TC -3 '], 0.63 ul 10, 10 uM eGFP duyarlı primer 0.63 ul çoğalır birleştirerek PCR Master Mix çözeltisi hazırlayın uM EGFP anti duyarlı primer [5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG 3 '] ilave edin, MilliQ-dereceli su 6.3 ul). "DNA yok" kontrolleri de dahil olmak planlı reaksiyonların sayısına göre bu miktarlar çarpın.
  11. Yükü mikroamper Optik 96 oyuklu Reaksiyon plakanın üçlü içine PCR Master Karışımı 20 ul (aşama 4,8) Reklam EGFP DNA 5 ul. Microamp Optik Yapışkan Film ile plaka mühür. Hava kabarcıklarını yok etmek için, 1 dakika için 1000 rpm'de döndürün plaka.
  12. 7500 Real-Time PCR motorun yuvasına plakası yerleştirin. 7500 Sistem SDS Yazılımı (v1.4 veya daha yüksek) seçmek ana menüde "Yeni deneme oluştur". "Next" tıklayın. "Yeni deneme sihirbazı" ekranında bir kaydırma menüden SYBR Green seçin ve "add" butonuna tıklayınız. Plakanın bir düzen almak için "next" tıklayın. SYBR Green seçin, tüm kuyu analiz edilecek vurgulayın. Ardışık hiçbir DNA kontrol kuyuları, Reklam eGFP DNA Standartlar ve bilinmeyenler vurgulayın ve kaydırma menüden ilgili belirtme kullanarak işaretleyin.
  13. Alet sekmesine geçin. , "Ayrışma safhasının eklemek" seçmek 25 ul varsayılan 50 ul iyi ses seviyesini değiştirin. Start tıklayın.
  14. Aykırı ve diğer düzensizlikler için QC özetini kontrol ettikten sonra kullanarak PCR sonuçları analiz edin.

Model Çelik Hasır adlı Hidrolize Çapraz-bağlayıcı-gergin Vektör Parçacıkların 5. Yayın Kinetiği

  1. (100-200 rpm) çalkalayarak,% 1 BSA / PBS (1 x 3 saat) olarak (3,9 göre) RHC, IHC SHC ve NHC ile Cy3 etiketli Ad ile türevlendirilmiş örgü örnekleri yıkayın.
  2. Steril ince forseps kullanılarak, elüsyon tamponunun 200 ul ile doldurulmuş bir 96-yuvalı plakanın bireysel çukurlar halinde kafes yerleştirin (% 0.1 BSA /% 0.1 Tween-20 / PBS).
  3. Her mesh orta kısmının floresan görüntüleri çekmek. Mikroskop ve görüntü alımı için kullanılan CCD kamera ayarlarını kaydedin.
  4. Maksimum azalma ile iyi-tarama modunda fluorimetrically plakasını (550 ex / 570 em) tahlil. Zemin kontrolü olarak, turevlenmemış meşlik kuyu kullanın.
  5. (50 rpm) çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin.
  6. Önceden belirlenmiş zamanlarda (1-30 gün) en kafesleri bozmadan yıkama tamponunu aspire ve taze elüsyon tamponu 200 ul ekleyin. Tekrar tampon değiştirdikten sonra 4,3-4,5 adımları.

Kültür Cel 6. İletimiMesh-hareketsiz İlan Vektörler tarafından ls

  1. Reklam eGFP yıkayın - ya da Ad Luc varlığında gerçekleştirilir (100 rpm) çalkalayarak 5 dakika boyunca üç kez steril PBS ile kafes -derivatized.
  2. İnce steril pensler kullanılarak örgü Diskler tek tek çıkarmak ve ayrı ayrı büyüme log fazında ilgi hücre türü ile 96 oyuklu bir plakanın gözleri içine yerleştirin.
  3. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de 24 saat boyunca kuluçkaya bırakılır.
  4. Boyutunu ve kuyularda gen ifadesinin uzamsal dağılımını belirlemek için (eGFP veya lusiferaz biyolüminesans görüntüleme için floresan mikroskobu fluorometri) ilgili terminal-olmayan uç nokta deneyi kullanarak.
  5. İsteğe bağlı olarak, PBS için yerine orta düşük eGFP ifade beklenen ise fluorometri deneyi (485/535 nm) duyarlılığını artırmak. Not: florimetre iyi tarama yeteneği varsa, gözleri içindeki hücreler EGFP ifade eden uzamsal dağılımını değerlendirmek için iyi bir tarama modunda plaka okuma. Değişim PBFluorometri tamamladıktan sonra orta S.
  6. Görüntü FITC filtre seti içeren (altı ve kenar örgü hem de) Reklam EGFP -eluting meşlik kuyularda transduse hücreleri. 40-200X büyütmede temsilcisi görüntü alabilir. Floresan mikroskop ve görüntülerin edinimi için kullanılan CCD kamera tam ayarlarını kaydedin.
  7. Doğrudan Reklam Luc -eluting ile çukurlara PBS içinde lusiferin stoklar 5 ul (10 mg / ml) önceden biyolüminesans görüntüleme için 10 dakika boyunca 37 ° C ve% 5 CO2 ile inkübe / ml, 500 ug bir son konsantrasyona kadar kafes . Aspire medya ve görüntüleme sonrası lüsiferin-özgür medya ile değiştirin.
  8. Önceden tespit edilmiş bir kat (2 haftaya kadar) en uç nokta tahlilleri alt-tabaka tekrar-kaynaklı gen transferi, aşağıdaki raportör gen ifadesinin kinetiğini incelemek için.

Gecikmeli Zaman Noktalarında Korunan İletimi Kapasitesinin 7. Doğrulama

  1. Hazırlayın Reklam eGFP deVektör bağlanması için RHC, IHC, SHC ve NHC kullanılarak rivatized kafes (2,1-2,11 başına ve 3.1-3.9) ve ayrı ayrı (% 60-80 konfluent BAEC sığır aortik endotel hücreleri ile 96 oyuklu bir plakanın gözleri olan kafes yerleştirin ).
  2. (6,4-6,5 göre), flüoresans mikroskopisi ve fluorometri ile 1 ve 2 gün sonra örgü yerleştirme de kafes hareketsiz Reklam eGFP ile kültürlenen BAEC transdüksiyonunu analiz eder.
  3. Transdüksiyon başlamasından 48 saat sonra iki kez PBS ile örgü içeren kuyu yıkayın.
  4. Her çukura,% 0.25 tripsin / EDTA, 200 ul, (100 rpm) çalkalama ile 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. PBS ile yıkayın 3x.
  5. Kafesleri ile ilişkili tüm EGFP-pozitif hücrelerin tamamen çıkarılmasını tespit için flüoresan mikroskopi ve fluorometri kullanın.
  6. Taze bir% 60-80, ilk önce tohum ekme yoğunluğu (2-2,7 4 x 10 hücre / kaynak) ile kısmen çözülür meşlik kuyulara BAEC pasajlanır tohumu.
  7. 37 ° C ve% 5 CO inkübe plakası önceki 2 floresan mikroskopi ve fluorometri ile "yeni" iletim olayların değerlendirilmesi için zaman önceden belirlenmiş bir süre (1-10 gün).

8. Reklam salınımlı stent Anjiyoplasti Sıçan Karotis Modelinde Stent Dağıtım

  1. Bu protokol açıklanan tüm hayvan prosedürleri laboratuar hayvanları kullanımı ile ilgili Federal düzenlemelere uygun ve Philadelphia Çocuk Hastanesi IACUC tarafından onaylanmıştır. Tüm araçlar otoklavda sterilize edilir aseptik cerrahi koşullarına uymak için. Bir boncuk sterilizatör kadar ardışık beş hayvanlarda araçların kullanımı arasında istihdam edilmektedir sürekli sterilite sağlamak için.
  2. Reklam Luc 2,1-2,11 ve 3,1-3,9 göre stent -eluting hazırlayın. Kullanılmadan önce en fazla 24 saat boyunca 4 ° C'de steril PBS içerisinde virüsün türetilmiş stent saklayın.
  3. IP ketamin (100 mg / kg) enjeksiyonu ve ksilazin (5 mg / kg) ile, erkek Sprague-Dawley sıçanları (400-450 g) elde anestezisi. Depençe tutam tepki ve kas tonusu ile anestezi derinliği Terminé. Kornea ve sklera kuruluğunu önlemek için oftalmik veteriner merhem sürün. Not:% 4 ve indükleyici ve anestezinin muhafaza% 2 izofluran (1 L / dak) ile anestezi inhalasyon sırasıyla, deneyimsiz bir kullanıcı için tavsiye edilir, böylece mümkündür ancak bu hayvanın boyun bölgesine serbest erişimi engellemiş.
  4. Ayak tutam tarafından anestezi derinliği yeniden değerlendirin. Tıraş ve aseptik hazırlık boyun ve üst göğüs bölgesi. Antibiyotik (sefazolin, 20 mg / kg; İM) yönetme, analjezik (meloksikam, 0.5 mg / kg SC) ve tuzlu su (10 ml / kg, sc.) Bir 24 G kateter kullanılarak kuyruk ven kateterize ve heparin verilmesi (200 IU / kg, IV). Not: 10 mg / kg (İM) enrofloxacin (Baytril) verilmiştir bir dozu yerine sefazolin kullanılabilir. Gram-pozitif bakterilere karşı belirgin bir aktivite eksik antibiyotik kaçının. / Kg karprofen (Rimadyl) 10-15 mg önleyici bir analjezik olarak yerine meloksikamın kullanılabilir. Narkotik analjezikler (ELg., morfin, buprenorfin) nedeniyle solunum deprese edici özellikleri kaçınılmalıdır.
  5. Cilt ve boyun fasyası boyunca orta hat kesi gerçekleştirin. Sol eksternal karotid arter izole künt diseksiyon tekniklerini kullanın. Kravat-off dış karotid arter en uzak cana yerinde. Internal karotid arter kökenli bir kayma geçici ligatürün uygulayın.
  6. Sol eksternal karotid arterde 2 mm arteriotomi kesi olun.
  7. Eksternal karotid arter kesiden karotis arter içine 2-Fransız Fogarty yerleştirin. Tuzlu su ile kateterin ucu açılır ve endotelyumun soymak için karotis bifürkasyonun aortik arktan 3 kez geçer.
  8. Fogarty kateter ve karotis arter içine tüp bir parça (1.04 mm OD, 0.99 mm ID) kaydırın. Fogarty çekiniz.
  9. Dağı ve Reklam Luc kıvrım 1.5 balonun üzerinde stent -derivatizedmm çaplı anjiyoplasti kateter. Teflon tüp aracılığıyla stent yerleştirin ve ortak karotid arter orta bölümünün içine ilerletilmesi. Tüp veya damar duvarına stenti ovuşturarak kaçının.
  10. 30 saniye için 12 atm de stent dağıtmak ve anjiyoplasti kateteri.
  11. Arteriyotomi siteye dış karotid arter proksimalinde-kapalı kravat ve internal karotid arter geçici ligatürün bırakın.
  12. Cildi 4.0 vicryl sütür ve zımba ile katmanlarda operatif yara onarın.
  13. Ayaktan kadar bir ısınma pad üzerinde hayvan kurtarmak ve onun izole kafesine geri dönmek. Ağrı veya rahatsızlık belirtisi tipik olarak işlem sonrası ilk 12 saat ötesinde, ameliyat sonrası hayvanlar tarafından sergilenen birlikte, 72 saat boyunca meloksikam tedavi (0.5 mg / kg, günlük SS) uzantısı düşünün.

Arter Gen İfade 9. Biyoparlaklık Görüntüleme

  1. Önceden tespit edilmiş bir zaman noktalarında (1 gün - 3karotis arter gen-stent yerleştirilmesinden sonra hafta aralığı), izofluran inhalasyon anestezi (oksijen içinde% 2-4 izofluran) kullanılarak sıçan uyutmak.
  2. , Cerrahi zımbaları çıkarın aseptik sitesi hazırlamak ve operatif yara yeniden. Sol karotis arter künt diseksiyon, yeniden kazanç erişim kullanarak ve vagus siniri ve komşu bağ dokusu ayırırım.
  3. PBS içinde% 25 PBS ve Pluronic F-127 içinde bir 50 mg karışımı / ml lusiferin hazırlanması (1: 4 h / h) ve buz üzerinde saklayın. Not: Bu formülasyon, 4 ° C'de viskoz bir solüsyon olarak sunulur ve hemen, 37 ° C'de doku ile temas üzerine jel döner.
  4. Doğrudan karotis arter maruz segmentine soğutulmuş Luciferase / Pluroonic karışımı 200 ul uygulayın ve jel sağlamlık doğrulayın.
  5. IVIS-Spektrum cihazının görüntüleme odasında yatar pozisyonda hayvan koyun ve bir yüz maskesi ile izofluran anestezi korumak.
  6. Acquisiti inkontrol paneli penceresindeki (mesafe itiraz 6,6 cm kamera) konumu "B" seçeneğini (Görüntü, sürüm 4.2 veya daha yüksek Living) ve sırasıyla, "görüş alanı" ve "gruplama" başlıklı açılan menülerden faktör "orta" kutulamanın. Konu yüksekliği kutusuna "2,5 cm" yazın. "Pozlama süresi" kutusuna bir zaman birimi olarak "min" seçin ve "2" sayısal bir değer seçin.
  7. Üç dakika Luciferase / Pluronic jel uygulandıktan sonra, ekranda "Edinme" butonuna tıklayarak görüntü alımı başlatabilirsiniz. NOT: Görüntü kazanım süresi beklenen sinyal gücüne bağlı olarak 1 ila 6 dakika arasında değişebilir.
  8. Görüntüyü aldıktan sonra, tuzlu su ile jel yıkayın ve steril gazlı bez ve pamuk aplikatör ile Periarteriyel alanı siliniz.
  9. Vicryl ve zımba deri ile yarayı kapatmak.
  10. Hayvan kurtarmak ve kendi kafesine geri dönmek. Daha sonra t tekrar görüntülemevakit ifadesi noktaları Stent hareketsiz Reklam vektörlerinin getirdiği arteriyel ifade zaman sürecini incelemek.
  11. Seçenek olarak ise, luciferase sistemik uygulamasının ardından görüntüleme gerçekleştirmek. Uyutmak ve 9,1-9,2 başına hayvan hazırlık. Ameliyat bandı ile bir 24 G kateter ve kateter ile güvenli bir kuyruk ven kateterize.
  12. PBS içinde luciferase çözeltisi (50 mg / ml) hazırlayın ve 10 saniyelik bir aralık boyunca kateterden solüsyonun 1 ml enjekte edilir. Enjeksiyondan sonra bir dakika 9,7-9,8 başı olarak görüntü alımı başlatabilirsiniz. Not: Daha hızlı enjeksiyon oranı (<10 sn) nöbet aktivitesini ve solunum tutuklama sebep olabilir. Nöbetler veya solunum durması görüntüleme sırasında oluşursa hayvan ötenazi edilmelidir.
  13. Adımı 9.10 izleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Vektör Yayın Deneyler

Örneğin stentler gibi endovasküler girişimsel içeren implantlar, yüzeye adenoviral vektörlerin Bağ, kısmen vektörlerini fiziksel hedefleme eksikliği önüne geçmeyi, hastalık bölgesine vektör yakındır. Bununla birlikte, hedef doku transdüksiyonu yoluyla terapötik etkisini elde edebilmek için, vektör, yüzey (Şekil 2) serbest bırakılması gerekir. Hidroliz olabilen bir çapraz-bağlayıcıların kullanımı çapraz bağlayıcı, hidrolizi yolu ile arac...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Sunulan protokol paslanmaz çelik yüzeyleri coatless için adenoviral vektörlerin geri dönüşümlü eki yoluyla elde tabaka aracılı gen aktarımı için operasyonel bir yöntem açıklanır. Vasküler restenoz stent dayalı gen terapisi için özel olarak geliştirilmiş olup, bu teknik biyomateryaller, biyomedikal implant ve gen terapisi alanlarında çok daha geniş bir uygulama alanı vardır.

Sunulan çalışmalar sadece bir prototip, metal alt tabaka olarak paslanmaz çelik yararlanmasına rağmen, PABT gibi ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Bu makalede sunulan protokol geliştirme ve çalışmalar kısmen Amerikan Kalp Derneği Bilim Adamı Geliştirme hibeleri (I.F. 0735110N ve M.C. 10SDG4020003), ABD Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibesi HL 72108 (R.J.L.) ve ABD Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü T32 007915 (S.P.F.) tarafından desteklenmiştir. Anjiyoplasti kateterleri NuMED (Hopkinton, NY) tarafından bağışlanmıştır. Yazarlar, Bayan Susan Kerns'in sekreterlik yardımına teşekkür etmek isterler.

Teşekkürler

Yazarların açıklamak için rekabet eden mali çıkarları yoktur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
316 paslanmaz çelik hasır disklerElecton Mikroskopi BilimleriE200-SS
Jenerik 304 dereceli paslanmaz çelik stentlerLaserageözel sipariş
AdeGFPUniversity of Pennsylvania Vektör ÇekirdeğiAD-5-PV0504
AdLucPennsylvania Üniversitesi Vektör ÇekirdeğiAD-5-PV1028
AdEMPTYPennsylvania Üniversitesi Vektör ÇekirdeğiA858
Cy3(NHS)2GE SağlıkPA23000
Sefaroz 6BSigma-Aldrich6B100-500ML
UV 96 kuyulu plakalarCostar3635
Florometri 96 kuyulu plakalarCostar3915
Hücre kültürü 96 oyuklu plakalarFalcon353072
Tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorür (TCEP)Pierce Thermo Scientific20490
Dithiothreitol (DTT)Pierce Thermo Scientific20290
sulfo-LC-SPDPPierce Thermo Scientific21650
SpektrofotometreMoleküler Cihazlar SpectraMax 190
SpektroflorometreMoleküler CihazlarSpectraMax Gemini EM
Orbital çalkalayıcı inkübatörVWR1575R
Yatay hava akışlı fırınShel Lab1350 FM
Centra-CL2 santrifüj ve nbsp;Uluslararası Ekipman Şirketi426
Dijital girdap karıştırıcıFisher Thermo Scientific02-215-370
Eclipse TE300 floresan mikroskobuNikon TE300
DC 500 CCD kameraLeicaDC-500
7500 Gerçek Zamanlı PCR sistemiUygulamalı Biyosistemlermevcut
IVIS Spectrum biyolüminesans istasyonuPerkins-Elmermevcut
EDTA dipotasyum tuzuSigma-AldrichED2P
Sığır serum albümin fraksiyonu V (BSA)Fisher Thermo ScientificBP1600-100
Ara-20Sigma-AldrichP1379
Dumont forsepsGüzel Bilim Araçları11255-20
A10 hücre hattı ATCCCRL-1476
Sığır aort endotel hücreleriLonzaBW-6002
Luciferin, potasyum tuzuAltın BiyoteknolojiLUCK-1Ge
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
PBS kalsiyum ve magnezyum içermezGibco14190-136
Fetal sığır serumuGemini Biyo-Ürünler100-106
Penisilin / Streptomisin çözeltisiGibco11540-122
DMEM, yüksek glikozCorning cellgro10-013-CV
0.25 Tripsin / EDTAGibco25200-056
QIAamp DNA mikro kitiQiagen56304
Power Sybr Green PCR Master MixUygulamalıBiyosistemler 4367659
MicroAmp Optik 96 kuyulu Reaksiyon PlakasıUygulamalı BiyosistemlerN8010560
MicroAmp Optik Yapışkan FilmUygulamalı Biyosistemler4360954
Sefazolin Apotexmevcut
Loxicom (Meloksikam)Norbrookmevcut
Heparin sodyumAPP İlaçmevcut
Ketavet (Ketamin)VEDCOmevcut
Anased (Xylazine) Lloidmevcut
Forane (Isoflurane) Baxtermevcut
Kavisli Moria iris forsepsGüzel Bilim araçları11370-31
Kavisli ekstra ince Graefe forsepsGüzel Bilim Araçları11152-10
Dumont #5 forsepsGüzel Bilim Araçları11252-20
Vannas yaylı makasGüzel Bilim Araçları15018-10
İnce makas - ToughCutGüzel Bilim Araçları14058-09
Cerrahi makasGüzel Bilim Araçları14101-14
Vicryl sütür (5-0)EthiconJ385
Sütür ipliği (4/0 ipek) Güzel Bilim Araçları18020-40
Michel sütür klipsleriGüzel Bilim Araçları12040-02
Yara genişletici (Lancaster göz spekululası)KLS Martin34-149-07
Sıcak boncuk sterilizatörüGüzel Bilim Araçları18000-45
Michel sütür klipsi aplikatörüGüzel Bilim Araçları112028-12
Insyte Autoguard 24 G IV kateterBeckton-Dickinson381412
2F Fogarty kateterEdwards Lifesciences120602F
Teflon boruVention041100BST
PTA kateterNuMedözel sipariş
Gazlı bez pedleriKendall Healthcare9024
Pamuk aplikatörleriSolon ÜretimWOD1003
SalineBaxter281321
10 ml şırınga (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309604
1 ml şırınga (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309628
#40 bıçaklıOster Makası 78005-314
Transpore cerrahi bant3MMM 15271
Puralube veteriner merhemiPharmadermmevcut
değildeğil% değildeğildeğildeğildeğildeğil değil

Kaynaklar

  1. Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
  2. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
  3. Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
  4. Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
  5. Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
  6. De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
  7. Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
  8. Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
  9. Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
  10. Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
  11. Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
  12. Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
  13. Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
  14. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
  15. Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
  16. Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
  17. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
  18. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
  19. Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
  20. Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
  21. Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
  22. Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
  23. Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
  24. Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
  25. Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
  26. Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
  27. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
  28. Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
  29. Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
  30. Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
  31. Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
  32. Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56(2010).
  33. Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
  34. Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Metalik StentlerGen Sal n ml StentlerBiyol minesans G r nt lemeSprague Dawley S anlarOrtak Karotid ArterBoyut D lama KromatografisiTiyol reaktif Partik ller
Hidrolize Çapraz bağlayıcılar yoluyla Adenoviral vektörler gergin kullanma Metalik Stent Yüzeylerden Vasküler Gen Transferi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.