ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Özet

Burada, ATP'ye bağımlı nükleozom kaymasını katalize etme, 2) nükleozom substratlarıyla etkileşime girme ve 3) ATP'yi nükleozom veya DNA'ya bağımlı bir şekilde hidrolize etme yetenekleri için ATP'ye bağımlı kromatin yeniden modelleme enzimlerini karakterize etmek için kullanılabilecek biyokimyasal tahlilleri açıklıyoruz.

Özet

SNF2 ATPaz ailesinin üyeleri genellikle ATP'ye bağımlı nükleozom yeniden şekillenmesini katalize ederek nükleozom dinamiklerini ve DNA erişilebilirliğini düzenleyen çok alt birimli kromatin yeniden şekillenme komplekslerinin bileşenleri olarak işlev görür. Bu tür komplekslerin bireysel alt birimlerinin çok aşamalı ATP'ye bağlı kromatin yeniden şekillenme reaksiyonuna katkılarının biyokimyasal olarak incelenmesi, reaksiyon ürünlerinin üretimini izleyen ve reaksiyon ara maddelerinin oluşumunu ölçen tahlillerin kullanılmasını gerektirir. Bu JOVE protokolü, kromatin yeniden modelleme komplekslerinin veya çeşitli alt birim kombinasyonlarını içeren alt komplekslerin biyokimyasal aktivitelerini ölçmeye izin veren tahlilleri açıklar. Kromatinin yeniden şekillenmesi, elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) tabanlı bir yöntem kullanılarak bir nükleozomun bir DNA molekülü üzerindeki hareketini izleyen ATP'ye bağımlı bir nükleozom kayma testi kullanılarak ölçülür. Nükleozom bağlanma aktivitesi, benzer bir EMSA tabanlı yöntem kullanılarak yeniden şekillendirilen kompleks bağlı mononükleozomların oluşumunun izlenmesiyle ölçülür ve DNA veya nükleozoma bağımlı ATPaz aktivitesi, DNA veya nükleozomların varlığında ATP'nin ADP ve fosfata dönüşüm oranını ölçmek için ince tabaka kromatografisi (TLC) kullanılarak test edilir. Bu tahlilleri kullanarak, bir kromatin yeniden modelleme kompleksinin alt birimlerinin fonksiyonları, tüm kompleksin aktivitelerini bir veya daha fazla alt birimden yoksun olanlarla karşılaştırarak incelenebilir. İnsan INO80 kromatin yeniden modelleme kompleksi örnek olarak kullanılmıştır; Bununla birlikte, burada açıklanan yöntemler, diğer kromatin yeniden modelleme komplekslerinin çalışmasına uyarlanabilir.

Giriş

SnF2 aile kromatin biçimlenme kompleksleri merkezi SnF2 gibi ATPaz alt birimini ^1,2 içerir. Tek alt-birim enzimler gibi bazı SnF2 gibi ATPaz fonksiyonu, diğer daha büyük bir çoklu alt birim kompleksi katalitik alt-birimi olarak işlev yaparken. Biçimlenme kompleksleri onların faaliyetlerine katkıda kromatinin alt birimlerinin her biçimlenme sürecini incelemek biyokimyasal analizleri gerçekleştirmek için yeteneği gerektiren hangi moleküler mekanizmaların tanıtılması.

İnsan INO80 kompleksi ve diğer enzimler tarafından yeniden yapılanma kromatin ATP'ye bağımlı nükleozom yeniden modelleme, kendi DNA- ve / veya nükleozom bağımlı ATPaz aktivasyonu takiben, nükleozomlann için yeniden şekillenme enzimin bağlanması ile başlayan bir çok-aşamalı bir süreç olarak tasavvur edilebilir nükleozomal DNA ve nükleozomlardan ^1,2 nihai konumlandırılması hakkında yeniden şekillenme enzim translokasyon. ATP'ye bağımlı kromatin değiştirme prosesinin r molekül ayrıntılarını anlamakreaksiyonun her aşaması için kromatin remodeling karmaşık bireysel alt birimlerinin katkıları biçimlenme kendi bireysel adımlar içine reaksiyonu ve tanımı diseksiyonu equires. Bu tür analizler in vitro tanımlanmış moleküler alt tabakalar kullanılarak nucleosome biçimlenme ve diğer faaliyetlerini analiz yeteneği gerektirir.

Önceki bir JOVE protokol, tanımlanmış ait birim bileşimleri ile ³ INO80 kromatin biçimlenme kompleksleri ve subcomplexes oluşturmak için kullanılan prosedürleri tarif. Burada, biz, DNA'ya ve nucleosome-aktive ATPaz ve bu kompleksleri ile ilişkili nucleosome biçimlenme faaliyetlerini bağlayıcı nucleosome kantitatif analizini sağlayan üç biyokimyasal analizler sunmak.

Protokol

1. ATP'ye bağımlı Nükleozom Tadilat Tahliller

Nükleozom remodeling aktiviteleri ATP'ye bağımlı ölçmek için, ya da immüno-INO80 INO80 subcomplexes ATP ve 216 bp, ³² P-etiketli DNA fragmanının bir ucunda yer alan, tek bir nükleozom içeren bir alt-tabaka mononucleosomal, inkübe edilir. Reaksiyon ürünleri daha sonra yerli poli-akrilamid jeli içinde elektroforez işlemine tabi tutulmuştur.

1. ³² P-etiketli, '601' DNA fragmanını meydana getirmek için, gelen amplifiye pGEM-3Z-601 ⁴ oligonükleotitleri olarak 5'-ve 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG kullanan bir uç konuma 601 nükleozom konumlandırma dizisini ihtiva eden bir 216 bp'lik bir DNA fragmanı ileri ve geri primerler.
   1. Tablo 1 de tarif edildiği gibi, bir 100 | il PCR reaksiyonu ayarlayın.
   2. Aşağıdaki programı kullanarak bir termal döngü PCR reaksiyonları gerçekleştirin: 1 dk 96 ° C, followe de94 ° C, 57 ° C, 30 döngü için 72 ° C'de 60 saniye, 30 saniye ile 45 saniye D; 72 ° C 'de, 7 dakika ile biten.
   3. PCR reaksiyon tamamlandıktan sonra, nükleaz içermeyen döndürme kolonları boyunca iki kez, reaksiyon ürünlerinin geçirilmesiyle mümkün bağlanamayan nükleotidleri gidermek.
   4. PCR reaksiyonu, arzu edilen ~ 216 bp'lik bir DNA fragmanı elde onaylamak için% 1.2 agaroz jeli içinde saflaştırılmış PCR ürünü 5 ul çalıştırın.
   5. Saflaştınlmış PCR ürünü, 20-kat 5 ul seyreltin ve bir UV spektrofotometresi kullanılarak DNA konsantrasyonları ölçülür. Ortalama verim ~ 40 ng / ul.
   6. Bir ışıma sayacı içinde arıtılmış PCR ürünü 1 ul radyoaktivite ölçülür. Cpm / ng hesaplayarak etiketleme verimliliği tahmin. Başarılı bir etiketleme reaksiyonu 601 DNA fragmanının ~ 15,000 cpm / ng elde etmesi beklenmektedir.
2. Bir seri seyreltme yöntemi kullanılarak ⁵ etiketli 601 DNA üzerine Hela hücre nükleozom aktarın.
   1. 2 pmol karıştırın³² P-etiketli 601 DNA fragmanı ile HeLa nükleozom 6 ug 1.0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF ve 1 mM ihtiva eden bir tampon maddesi 50 ul ⁽⁵ tarif edildiği gibi hazırlanmıştır) DTT ve 30 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
   2. Sıralı 0.8 M, 0.6 M seyreltin ve 10 mM Tris-HCI (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, sırasıyla 12.5 ul, 20.8 ul, 41.6 ul, seyreltme ile 0.4 M NaCI, ve 1 mM DTT, her bir seyreltmeden sonra 30 ° C de 30 dakika inkübasyon ile.
   3. Bundan başka, bir 30 dakika inkübasyon ile, sonra% 0.1 Nonidet P-40,% 20 gliserol ve 200 ug / ml BSA ihtiva eden aynı tampon 250 ul, 125 ul eklenmesi ile 0.1 M NaCl, sonra 0.2 M ve seyreltin ve son iki dilüsyonu arasında 30 ° C'de ilave edildi. 3 aya kadar 4 ° C 'de mononucleosome tabakayı saklayın.
3. 10 ul bir toplam hacim içinde ATP'ye bağımlı nükleozom kayar reaksiyonları gerçekleştirmek. ReaINO80 nükleozom biçimlenme aktivitesi için en uygun NaCl konsantrasyonu olduğu ölü m bileşenler. Tablo 2'de listelenen 50 mM NaCI (yayınlanmamış sonuçlar) dikkate bulunan NaCI miktarı göz önüne alındığında, 50 mM NaCl, her reaksiyonda toplam konsantrasyonunu ayarlamak nükleozomlardan ve enzim preparatları.
   1. Tahlillerinde başlamadan önce, yerli poli-akrilamid jelleri (18 x 16 cm) attı. % 5 akrilamid içeren, tek bir jel hazırlamak için (akrilamid: bisakrilamid 37,5: 1) ile, 0.5x TBE (45 mM Tris, borat, 1 mM EDTA),% 0.01 amonyum persülfat (BP), ve% 0.001 N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamin (TEMED). Tablo 3'te listelenen bileşenler karışımı jel oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca polimerize olmaya bırakın.
   2. Her bir reaksiyonun gerçekleşmesi için arada, önceden soğutulmuş bir silikonize 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ~ 20 nM ya da INO80 INO80 subcomplex birleştirmek (EB100 tampon miktarı ile ⁽³ tarif edildiği gibi hazırlanmıştır) yeterli Tablo 4) 4.75 ul bir hacim elde edildi. Hemen toz halinde kuru buz veya sıvı azot içinde kalan INO80 içeren fraksiyonların yeniden dondurma.
   3. 'X' faktörü ile yukarı ölçeklendirme, bileşenlerin geri kalanı ile bir usta kokteyl kurmak (nerede reaksiyonlar X = toplam sayı +3). Tek bir 10 ul reaksiyon için gerekli olan her bir bileşenin miktarı, Tablo 5'te listelenmiştir; tarifi yapılacak reaksiyon sayısına göre büyük çapta üretim için gerekmektedir. Bir Pipetman tüp dokunarak veya yukarı pipetle ve aşağı İyice karıştırın ve bir tezgah üstü mikrosantrifuj'de birkaç saniye boyunca tüp spin.
   4. Adım 1.3.2 kurmak reaksiyon tüplerinin her için ana kokteyli 5,25 ul koyun. Yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. 30 ° C ısıtma bloğu ya da su banyosuna reaksiyon tüpleri transfer reaksiyonları başlatmak ve 2 saat süreyle inkübe edin.
   5. Bu arada, rakip DNA içeren kokteyl 'mix kaldırarak' hazırlamakve nukleosomlar, X (reaksiyonlar + 4 X = toplam sayısı) bir faktör tarafından ölçeklendirme. Tek bir reaksiyon karışımı için kaldırma 1,5 ul hazırlamak için gerekli olan her bir bileşenin miktarı, Tablo 6'da listelenmiştir; tarifi yapılacak deneyler sayısına bağlı olarak büyük çapta üretim için gerekmektedir.
   6. Çıkarmadan karışımı 1.5 ul ekleyerek reaksiyonları sonlandırın. İyice karıştırın, aşağı doğru dönmeye ve bir 30 dakika daha 30 ° C'de inkübe edin.
   7. Bununla birlikte, sabit bir tampon dolaşımını sağlamak için, alt odasının iç tarafında bir manyetik karıştırma çubuğu ile tampon olarak 0.5x TBE kullanılarak 4 ° C'de 30 dakika boyunca 100 V'ta elektroforez birimi dikey olarak yerli poliakrilamid jel ön çalıştırın.
   8. , Örnek yük 3x TBE,% 30 gliserol,% 0.25 bromofenol mavisi,% 0.25 ksilen siyanol FF ihtiva eden yükleme boyası 2.5 ul ekleyin. Kısaca örnekleri döner, iyice karıştırın ve yükleme uçları kullanılarak jel üzerine yerleştirin.
   9. Tampon sirkülasyon ile 4 ° C sıcaklıkta 4,5 saat boyunca 200 V'de jel çalıştırın.
   10. Sinyali tespit etmek için, filtre kağıdı iki tabakanın bir yığın jel aktarın. Şeffaf bir plastik sarım ile üst jeli ile filtre kağıdı sarın ve daha sonra arzu edilen süre boyunca 4 ° C'de depolama fosfor ekranına maruz kalmaktadır.
   11. Bir izotop görüntüleme tarayıcı sistemi ile ekran tarama ve uygun yazılım kullanarak verileri analiz.

2. Mononucleosome Bağlanma Analizleri

Mononucleosomes için belirli bir INO80 kompleksinin bağlanma afinitesini tahlil edilmesi için, Adım 1.2 üretilen mononucleosomal alt-tabaka kullanılarak bir elektroforetik mobilite kayma deneyiyle (EMSA), gerçekleştirin.

1. Reaksiyon nükleozom yeniden modelleme deneyleri için anlatıldığı şekilde, fakat reaksiyonlardan ATP kaldırma karışımı ihmal bağlayıcı bağlanma analizleri için karışımları ayarlama; 30 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
2. Her reaksiyon karışımına yükleme boyası 2.5 ul,% 3.5 akrilamid (akrilamid içeren bir yerli poliakrilamid jel için geçerlidir: 3 bis7.5: 1),% 1 gliserol, 0.5x TBE% 0.01 APS ve% 0.001 TEMED.
3. Tampon olarak kullanarak 0.5x TBE tampon sirkülasyon ile 4 ° C 'de 2.5 saat boyunca 200 V'de jel üzerinde çalıştırıldı ve depolama fosfor ekranına maruz kalmaktadır.

3. DNA-bağımlı ve Nükleozom ATPaz Tahliller

20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 60 mM NaCI, 6.6 mM _MgCl2, 0.8 mM EDTA, 0.015% Nonidet P-40,% 2.5 gliserol, 0.1 mg / ml BSA, 1 ihtiva eden 5 ul reaksiyon karışımlarında ATPase deneyleri gerçekleştirmek mM DTT, 0.1 mM PMSF, 2 mM ATP, [α- ^32P] ATP, 2 uCi (3,000 Ci / mmol) eklenmiştir. INO80 kompleksinin her INO80 kompleksi ya da miktar için dairesel plazmid DNA ölçmek için (5000 bp ~ 30 nM) kapalı içeren DNA- ya nucleosome bağımsız ATPaz, bir ölçmek için üç paralel reaksiyonlar, tek içeren EB100 tampon kurmak denenmiştir için DNA- bağımlı ATPaz ve nucleosome-bağımlı ATPaz ölçmek için bir HeLa oligonüklezomlar (~ 185 nM) içeren. Buz üzerinde bütün tepkileri ayarlayın.

1. Her bir reaksiyon için, önceden soğutulmuş yağlanmış bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 2.2 ul bir hacim elde etmek için yeterli EB100 tampon bir miktarı ile ya da immüno INO80 INO80 subcomplexes 10-50 nM birleştirir. Hemen toz halinde kuru buz veya sıvı azot içinde bir INO80 içeren fraksiyonların yeniden dondurma.
2. Bir usta kokteyl ayarlayın. Tek bir reaksiyon için gerekli olan her bir bileşenin miktarı, Tablo 7'de listelenmiştir., X = INO80 preparatların bir sayısının tahlil edilmesi 3 (X + 2) +1 bir unsur tarafından ölçekleme ile tarifi ölçeğinin.
3. 'Sub-Kokteylleri' içeren tampon hazırlamak için sadece, DNA veya nukleosomlar, üç ayrı tüpler içine usta kokteyl 2.5 (X + 2) ul dağıtmak. 0.3 ya da EB100 bölgesinin (X + 2) ul, kapalı, dairesel plazmid DNA (1.5 ug / ml) ya da Hela oligonüklezomlar (1.5 ug / ul) ekleyin ve iyice karıştırın.
4. St kurmak enzim içeren bir reaksiyon tüpüne uygun alt kokteyli 2.8 ul koyunep 3.1. Hafifçe karıştırın aşağı yukarı pipet ve; kabarcıkları tanıtan kaçının.
5. , Reaksiyonlarını başlatmak 30 ° C ısı bloğu reaksiyon tüpleri aktarmak için.
6. En az 1.5 cm uzakta alt kenarı düz bir hat içinde 5, 15, 30, ve inkübasyon 60 dakika sonra, bir selüloz polietilenimin ince tabaka kromatografisi üzerine her tepkime karışımı 0.5 ul nokta (TLC), levha (20 x 10 cm) . Hemen birden çok zaman noktaları, tek bir tüpten alınabilir 30 ° C ısıya bloğuna reaksiyon tüpleri döner. Boyandıktan sonra, bir fön makinesi kullanıyorsanız TLC plakaları kurulayın.
7. TLC plakasının alt 0.5 cm çözelti içinde sokulmasına izin kadar 0,375 M potasyum fosfat (pH 3.5) ihtiva eden bir cam bölmeye TLC plakalarına aktarın.
8. Bölmesi kapağı ve sıvı fazın ön TLC plakalarının üst ulaşana kadar gelişir. Anında iyice bir darbe kurutma makinesi kullanarak plakaları kurulayın.
9. Oda sıcaklığında depolama fosfor ekranına kurutulmuştur, TLC plakaları Açığa.Bir izotop görüntüleme tarayıcı sistemi ile ekran tarama ve radyoaktif ATP substrat ve ADP ürünün miktarını belirlemek.
10. ATP hidroliz miktarının hesaplanması için aşağıdaki formül kullanılarak başlangıç ​​reaksiyon karışımı içinde mevcut olan ATP miktarı ile hidrolize% ATP çarpma: pmol ATP hidroliz = 10 pmol ATP Reaksiyon x başlayarak [ADP / (ATP + ADP)]

Sonuçlar

Rakamlar nükleozom kayar (Şekil 1) ve bağlayıcı (Şekil 2) ve deneyler DNA- veya nükleozom bağlı ATPaz deneyleri (Şekil 3) de dahil olmak üzere INO80 aktivitelerini karakterize etmek için kullanılır biyokimyasal tahlillerde temsili sonuçlar göstermektedir.

Şekil 1 'de gösterilen deney sağlam INO80 komplekslerinin yeteneği FLAG Ies2 veya FLAG INO80E ile arıtılmış INO80 bir 216 bp radyo etiketli DNA parçası üzerine monte mo...

Tartışma

, Ve yeniden modelleme ve / veya enzimler ATPaz kirletici biz deneylerde uyulması, nükleozom şekillenmesi ve ATPaz aktiviteleri INO80 komplekslerin katalitik aktivitesine bağlı sağlamak için, rutin deney nükleozom modelleme ve INO80 komplekslerin katalitik olarak aktif olmayan ATPaz aktivitesi, saflaştırılır Yabani tip INO80 aynı prosedür kullanılarak paralel. INO80 kompleksi ya da subcomplexes farklı preparatlar içinde etkinliklerini karşılaştırmak, deney yöntemi için karmaşık hale ATP ve / veya ATP-bağımsız yeniden şe...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Proteaz İnhibitörü Kokteyl	Sigma	P8340
10x PCR reaksiyon tamponu	Roche Uygulamalı Bilimler
Roche Taq DNA Polimeraz	Roche Uygulamalı Bilim
NucAway Nuclease İçermeyen Döndürme Sütunları	Ambion	Kedisi. # AM10070
ultra saf ATP	USB/Affymetrix	77241 25 UM
sığır serum albümini	Sigma	A9418
% 40 Akrilamid / Bis 37.5: 1	Amresco	0254-500ML
Sonikasyonlu somon sperm DNA'ları ve nbsp;	GE Healthcare	27-4565-01
%10 amonyum persülfat (APS)	Thermo Scientific	17874
benzonaz	Novagen Kedi	. No. 70664
dCTP, [α-32P]- 6.000 Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
PCR termal döngüleyici PTC 200	MJ Araştırma	PTC 200
Hoefer dikey elektroforez ünitesi	Hoefer	SE600X-15-1.5
yağlanmış 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri	Costar	3207
Depolama Fosfor Ekranı	Moleküler Dinamik	63-0034-79
3MM filtre kağıdı	Whatman	28458-005	VWR
Tayfun Fosfor Görüntüleyici	GE Healthcare	8600
ImageQuant yazılımı	GE Healthcare	ver2003.02
TLC Cam Plakalar, PEI-Selüloz F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL Transfer Membranı 7 x 8.4	Millipore IPFL07810
Uç pencereli veya gözleme GM (Geiger-Mueller) probu ile genel amaçlı ölçme ölçer	Biodex	Model 14C