İnsan adipoz kaynaklı stromal hücrelerindeki transkripsiyonel heterojenlik, hücre yüzeyi belirteçleri ve osteojenik genler kullanılarak tek hücre düzeyinde tanımlanabilir. Bu çalışmada, kraniyofasiyal iskelet rekonstrüksiyonunu arttırmak için kullanılabilecek artmış osteojenik potansiyele sahip hücre alt popülasyonlarının izolasyonu için akış sitometrisi kullanan bir protokol tanımlanmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Kemik iliği kaynaklı mezenkimal stromal hücreler (BM-MSC'ler), kök hücre bazlı doku mühendisliği uygulamaları için altın standart olarak kabul edilir. Bununla birlikte, hasat edilmeleri gereken süreç, önemli donör bölge morbiditesi ile ilişkili olabilir. Buna karşılık, adipoz türevli stromal hücreler (ASC'ler) daha kolay bol miktarda bulunur ve daha kolay hasat edilir, bu da onları BM-MSC'lere çekici bir alternatif haline getirir. BM-MSC'ler gibi, ASC'ler de osteojenik soy hücrelerine farklılaşabilir ve kraniyofasiyal iskelet kusurlarında kullanılmak üzere iskelelere tohumlama gibi doku mühendisliği uygulamalarında kullanılabilir. ASC'ler, ASC'ler, vasküler endotel ve duvar hücreleri, düz kas hücreleri, perisitler, fibroblastlar ve dolaşımdaki hücrelerin heterojen bir karışımı olan sindirilmiş yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonundan (SVF) elde edilir. Akış sitometrik analizi, ASC'ler için yüzey işaretleyici profilinin BM-MSC'ler için olana benzer olduğunu göstermiştir. ASC fenotipi için belirteçler oluşturan birkaç yayınlanmış rapora rağmen, bu heterojen popülasyonda osteoprogenitör hücreleri tanımlayan profiller üzerinde hala bir fikir birliği eksikliği vardır. Bu protokol, kritik büyüklükteki kalvarial kusurları onarmak için gelişmiş osteojenik kapasiteye sahip bir ASC alt popülasyonunun nasıl izole edileceğini ve kullanılacağını açıklar.
Giriş
Kök hücre popülasyonlarının heterojen doğası henüz tam olarak anlaşılamamıştır ve klinik olarak etkili kök hücre bazlı terapötik uygulamaların geliştirilmesinin önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Heterojen bir kök hücre popülasyonunu karakterize etmenin en yaygın yollarından biri, hücreleri yüzey işaretleyici ekspresyon profillerine göre ayırmak için floresanla aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) gibi bir hücre sıralama yöntemi kullanmaktır. Sıralama yöntemleri daha karmaşık hale geldikçe, hücrelerin daha belirgin fonksiyonel alt popülasyonlarını tanımlamak mümkün hale gelir. Mikroakışkan tabanlı teknolojiler, tek hücre düzeyinde gen ekspresyonunun analizinde giderek daha sık kullanılmaktadır. Bir mikroakışkan çip içinde çoklanmış kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), etkili ve güvenilir yüksek çözünürlüklü, tek hücreli transkripsiyonel analize olanak tanır. 1-5
arası48 genin tek hücreli transkripsiyonel profillemesinin kullanıldığı önceki bir çalışmada, ASC'ler arasında önemli ölçüde transkripsiyonel heterojenlik gözlenmiştir. 6 Bununla birlikte, MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 genlerinin dağılımı, yüksek osteojenik transkripsiyonel profillere sahip bir hücre kümesi ile güçlü bir ilişki sergilemiştir. Hücreleri bu osteojenik gen ekspresyon profiline göre izole etmek için, yüzey antijen ekspresyon paternleri transkripsiyon paternleri ile ilişkilendirildi ve daha sonra endoglin'in (CD105) yüzey belirteç ekspresyonunun ASC'lerin artmış osteojenik farklılaşma potansiyeli ile yakından ilişkili olduğu keşfedildi. CD105 ekspresyonundan bağımsız olarak, daha önce Chen ve ark. osteoprogenitör hücrelerle ilişkili olduğu gösterilen glikosil-fosfatidilinositol bağlantılı bir membran proteini olan yüzey reseptörü Thy-1'in (CD90) ekspresyonu da osteojenik gen ekspresyonu ile korele edildi. 6,7 Bu bulgular, hücre bazlı kemik dokusu mühendisliği uygulamaları için artan osteojenik kapasiteye sahip daha büyük heterojen ASC havuzu içindeki alt popülasyonları prospektif olarak izole etme fırsatı sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Tüm hasta numuneleri bilgilendirilmiş rıza ile elde edilmiştir ve deneysel protokolleri gözden ve Stanford Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu (Protokol # 2188 # 9999 ve) tarafından onaylanmıştır.
1. Hücre İzolasyonu ve Kültür:
- Genel / lokal anestezi altında karın, kanadını, ve / veya uyluk bölgesi seçmeli lipoaspiration geçiren sağlıklı kadın hastalarda insan deri altı yağ dokusu edinin. Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) onayı insan dokularından TSK izole protokolü elde edilmiş olduğundan emin olun ve bu tür malzemeler ile çalışırken kurumsal güvenlik önlemlerine uyun.
- Lipoaspirated adipoz dokudan SVF elde edilmesi için, ilk olarak 1 x steril fosfat-tamponlu tuzlu su, eşit hacimlerde (PBS) lipoaspirate üç kez yıkayın. Dikkatle aspire ve alt sulu tabaka atın.
- Ben Hank de Kolajenaz 0.075% Tip: kollajenaz sindirim tampon hazırlayınDengeli Tuz Çözeltisi (HBSS). FACS tamponu hazırlayın: 2% FBS, 1% P188 ve PBS içinde% 1 Pen-Strep. Bir piyasada mevcut 0.22 mikron gözenek boyutu hızlı akış polietersülfon filtre kullanarak her iki çözümleri Filtre.
- Yıkandı, yağ dokusu sindirimi için, 37 ° C (yaklaşık 180 sallar / dk) 60 dakika boyunca çalkalanan bir su banyosu içinde güvenli bir şekilde sindirim gemi kolajenaz sindirimi tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin ve koyun.
Not: Bu sallama esnasında maksimum sindirim için izin vermesi, gerekli olandan daha büyük bir hacim sindirim kap kullanmak için en iyi (yani, kolajenaz sindirim tamponu 250 mi, 1 litrelik bir steril şişe içine yıkanmış adipoz dokusu 250 ml) eklenmiştir. - FACS tampon maddesinin eşit hacmi ilave edildikten ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında oturmak için izin enzimatik aktivitesini nötralize. Daha sonra, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 233 x g'de santrifüje tabi tutun.
- Dikkatle aspire ve yüksek yoğunluklu SVF pelet rahatsız etmemek için özen, süpernatant atın.
- RT kırmızı 5-10 ml pelletiniHücre topağı boyutuna göre, liziz tamponunda. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 233 x g'de 5 dakika santrifüj oda sıcaklığında oturup çözeltisi bırakın.
- Aspire yüzer madde ve topak boyutuna göre geleneksel büyüme ortamı 5-10 ml ekleyerek pelletini (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı [DMEM] /% 10 FBS /% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu [Pen-strep]).
- Selüler artığın ayrılması için bir 100 um naylon hücre süzgecinden Süspansiyon filtre edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 233 x g'de santrifüj ve pelet bozmadan süpernatant atılır.
- Topak boyutuna dayalı geleneksel büyüme ortamı 5-10 ml olacak şekilde pelletini.
- 15 cm'lik standart kültür çanak 2 x 10 6 hücre yerleştirin ve 37 ° C /% 21 O 2,% 5 CO 2 birincil kültürleri O / N kurmak. 37 ° C /% 21 O2, büyüme ortamı içinde,% 5 CO2 seviyesinde kendiliğinden farklılaşmasını önlemek için alt konfluent seviyelerde muhafaza edin.
NOT: Tam Hücre yoğunluğuKonfluent 15 cm plaka yaklaşık 4-6 x 10 6 hücre olduğunu.
2. Boyama
- Boyama öncesi 36 saat için 37 ° C /% 21 O2,% 5 CO2, geleneksel bir büyüme ortamı içinde kültür TSK / ayırma.
- (Imalatçının protokolüne göre) Accutase kullanılarak kültür plakalarından Asansör TSK.
- Bir kez (% 2 FBS ve% 1 Pen-strep ile PBS) FACS tamponu ile hücreleri yıkayın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 233 x g'de santrifüjleyin.
- Pelet bozmadan süpernatant atın. FACS tampon 0.5-1 ml hücrelerin tekrar (hücre sayısı ve arzu edilen antikor miktarı ile ilgili olarak).
NOT: hücre süspansiyonu hacmi, FACS antikor üreticinin tavsiyeleri doğrultusunda, antikor konsantrasyonunu belirler. Bununla birlikte, antikor konsantrasyonu titrasyon, 1 için bir başlangıç konsantrasyonu kullanılarak: bir antikor kullanan ilk defa ise, 100, genellikle tavsiye edilir. - Toplam sayısınıBir hemasitometre kullanarak hücreleri.
- 1,5 ml santrifüj tüplerine rezervasyon 100 ul'lik bir boyanmamış örnek ve (kullanılan floresan antikor sayısına göre) tek renkli kontrol için kullanılır.
- (Üreticinin talimatlarına göre, önceden belirlenmiş konsantrasyonlarda) uygun şekilde floresan ile etiketlenmiş monoklonal antikor ekleyin ve ışıktan korunan, buz üzerinde 20-30 dakika boyunca inkübe edin.
- Osteojenik alt popülasyonunu etiketlemek için: 01:50 konsantrasyonunda FACS tamponu içerisinde, anti-CD90 (APC, anti-insan CD90 (Thy1)) ya da anti-CD105 (FITC anti-insan CD105 (endoglin)) seyreltin.
- Diğer hücre popülasyonları (örneğin, hematopoietik ve endotelial hücreler), etiketlemek için: Anti-CD45 (anti-insan CD45 Pasifik mavi), anti-CD34 (anti-insan CD34 APC) ve / veya anti-CD31 (anti-insan CD31 PE seyreltin ) FACS 1:50 arasında bir konsantrasyona kadar tampon.
- Doğrudan konjüge edilmiş antikorlar kullanılarak değil, uygun bir streptavidin-konjuge ikinci bir biyotinlenmiş primer antikor kullanımı1 bir seyreltme örneğin streptavidin PE-Cy7 olarak li antikor: 100.
- Süpernatan aspire, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 233 x g'de FACS tamponu ve santrifüj tüpleri doldurun: inkübasyondan sonra, hücreler iki kez yıkayın.
- Hücre kümeleri kaldırmak için bir 70 mikron naylon hücre süzgecinden 400-500 ul FACS tampon ve filtre örneklerinde hücrelerin tekrar.
- Filtre en FACS tüplerine etiketli hücreler aktarın ve analiz süresince buz üzerinde örnekleri tutmak.
3. floresan aktive edilen hücre sınıflandırma
NOT: Aşağıdaki adımlar önceki floresan-aktive hücrede bilgi sıralama (FACS) veya yetenekli bir teknisyen yardımı zorunlu.
- Ileri dağılım (FSC), yan dağılım (SSC) incelemek için, tasarım analizi araziler uygun FACS yazılımını kullanarak, Fikoeritrin (PE) -Texas Kırmızı, Pasifik Mavi, Fluoresein İzotiosiyanat (FITC), alofikosiyanin (APC) ve diğer fluorofor kullanımıd hücreleri etiketlemek için.
- Hücre sıralayıcı, kısaca girdap hücreleri tekrar süspansiyon her numune içine yerleştirmeden önce.
- Hücre kalıntıları hariç tutmak için ve taban çizgisi otoflüoresan belirlemek için, toplam hücre popülasyonunun kapılarını ayarlamak için lekelenmemiş numune analizi ile başlar.
- Lekesiz numune propidiyum iyodür (PI) ekleyin ve toplam hücre nüfus içindeki canlı hücrelerin nüfusu görselleştirmek için analiz. Bu nüfusun etrafında bir kapı oluşturun.
- Floresan tazminat ayarlamak için her florokrom için tek renkli kontrol örneği analiz.
- Sıralama için kapıları konumunu ayarlamak için lekeli örnek analiz.
- Hücreler ölü hücreleri boyamak için lekeli örnek PI ekleyin.
- Etiketli hücre popülasyonlarının sıralayın. Sıralama 1,5 ml santrifüj tüplerine ya da kültür ortamı içeren konik tüp (15 mi) içine ya.
- El hücre gereken miktarı, elde edildikten sonra sıralama bırakın.
- BizeFACS ing, küçük bir kısmını analiz (örn., 500 hücreler) edinilen hücre popülasyonunun bir saflık kontrolü gerçekleştirecek.
NOT: Bu adım sıralanmış hücre popülasyonlarının saflığını onaylar. İdeal olarak, saflık% 90-95 daha büyük olmalıdır. - 4 ° C'de 5 dakika boyunca 233 x g'de santrifüje hücreler hemen% 10 FBS içeren taze ortam 1 ml sıralama tamamlanmasını ve tekrar süspansiyon, aşağıdaki C.
Not: kullanılan ortamın miktarı, hücre peleti büyüklüğüne göre arttırılabilir. - Jelatin kaplı plakalar üzerinde plaka hücre canlılığını geliştirmek. Nihai hücre verimi, plaka 6-çukurlu plaka içindeki oyuk başına 300,000 hücre, 12 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 100,000 hücre bağlı olarak değişir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İnsan TSK (Şekil 1A, 1B) bir yüksek oranda zenginleştirilmiş popülasyonlarının izole edilmesi geliştirilmiş osteogenez sonuçlar hücreleri için bir marker olarak CD90 kullanılması. TSK Pasifik Mavi-konjüge anti-insan CD45 FITC-konjüge anti-insan CD105 ve APC-konjuge edilmiş anti-insan CD90 ile lekelenmiştir. Sonrası sıralama analizi ile nicelleştirilmiştir olarak sıralama sonra, saflık derecesi, daha büyük% 98 idi.
İki yeni alt popülasyonlar muhtemel izolasyonu için izin tran...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Şu anda, insan adipoz dokusu SVF TSK homojen alt popülasyonlarının izolasyonu arzu hedefi olsa zorlu kalır. Bu tür hücreler, kemik doku oluşumu ve homeostazı incelemek için kullanılabilir gibi pro-osteojenik ASC alt popülasyonlarının izole edilmesi özellikle tercih edilir. Ancak, adipoz doku SVF. Hücre kapasitesi ve farklılaşma potansiyelinin kök açısından bu heterojenite için moleküler temeli hücrelerinin toplanmış nüfus anlaşılmaktadır olamaz 11 önemli heterojenitesini barındıran ve bunun yerine tek bir hüc...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların hiçbiri bu metinde belirtilen ürünler, cihazlar veya uyuşturucu herhangi bir mali ilgi var. Yazarların hiçbiri rapor için herhangi bir rakip mali bir ilgi var.
Teşekkürler
Bu çalışma Sağlık Araştırma hibe R01-DE021683-01 ve Sağlık Araştırması hibe R01-DE019434 National Institutes MTL Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen; MTCDCW Howard Hughes Tıp Enstitüsü Araştırma Bursu ACS Franklin Martin Fakültesi Araştırma Bursu, Çocuk Rejeneratif Tıp Hagey Laboratuvarı ve Stanford Üniversitesi Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü Fakültesi Akademik Ödülü tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Tek Kullanımlık 250 ml Konik Tüpler | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX Takviyesi | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Antiseptik Povidon/İyot Çözeltisi | Purdue | PFC-67618015017 | |
| Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Fetal Sığır Serumu, Sertifikalı, ABD Menşeli | Gibco | 16000-044 | |
| Kollajenaz Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE Hücre Ayrılma Solüsyonu | Kök Hücre Teknolojileri | 7920 | |
| APC Fare Anti-İnsan CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Fare Anti-İnsan CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-İnsan CD45 eFluor 450 (Pasifik Mavisi ikamesi) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-İnsan CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-İnsan CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Streptavidin PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Aria II cihazı | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Yazılımı | BD Biosciences |
Kaynaklar
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298, 580-584 (2002).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).
- Warren, L. A., et al. Transcriptional instability is not a universal attribute of aging. Aging Cell. 6, 775-782 (2007).
- Aalami, O. O., et al. Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults. Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).
- Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).
- Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).
- Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells. Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).
- Levi, B., et al. Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells. Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).
- James, A. W., et al. Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion. PloS one. 4, e1720(2009).
- Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 29, 404-411 (2011).
- Glotzbach, J. P., et al. An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells. PLoS One. 6, e21211(2011).
- Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J. Vis. Exp. , e50585(2013).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
- Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 23, 412-423 (2005).
- McIntosh, K., et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).
- Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation. Journal of translational medicine. 12, 8(2014).
- Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation. Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
