Yöntem makalesi

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

DOI:

10.3791/52298

⸱

28 Ocak 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan hastalıkları spesifik nöronal kültürler insan nörolojik hastalıklar için in vitro bir model oluşturmak için gereklidir. Ancak, birincil insan yetişkin nöral kültürlere erişim eksikliği benzersiz zorluklar yükseltir. Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin son gelişmeler (iPSC) hastaya özel IPSC yoluyla deri fibroblastlar nöral kültürleri türetmek için alternatif bir yaklaşım sağlar, ancak bu süreç emek yoğundur, özel uzmanlık ve kaynakların büyük miktarda gerektirir, ve birkaç ay sürebilir. Bu nörolojik hastalıkların çalışma Bu teknolojinin geniş bir uygulama önler. Bu sorunlardan bazılarının üstesinden gelmek için, biz iPSC derivasyon işlemini atlayarak, doğrudan insan yetişkin periferal kanından sinir kök hücreleri elde etmek için bir yöntem geliştirdik. Insan yetişkin periferal kanından zenginleştirilmiş hematopötik projenitör hücrelerin in vitro olarak kültürlendi ve Ekim transkripsiyonel faktörler Sox2 içeren Sendai virüsü vektörleri ile transfekte3/4, Klf4 ve c-Myc. ayrıca, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) içeren insan nöral projenitör ortamı kullanılarak seçilmektedir hücrelerinde morfolojik değişiklikler transfeksiyon ile sonuçlanır. Elde edilen hücreler, Nestin ve Sox2 gibi nöral kök hücre işaretçileri için ekspresyonu ile karakterize edilir. Bu nöral kök hücreler ayrıca nöronların, astroglial ve belirtilen farklılaşma medya oligodendrositlere ayırt edilebilir. Kolayca erişilebilir insan periferal kan örnekleri kullanarak, bu yöntem, nörolojik bozukluklar, in vitro model için nöral hücrelere daha fazla farklılaşması için nöral kök hücrelerini elde etmek için kullanılabilir ve bu hastalıkların patojenezinde ve tedavi ile ilgili çalışmalar ilerleyebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro nöronal kültürler nörolojik hastalıkların çalışmaları için temel bir araç olarak kullanılmıştır. Birincil hayvan (çoğunlukla, kemirgen) bir sinir kültürlerinin 1, 2 ve gliom ve diğer tümörlerinden türetilmiş insan nöral hücre çizgileri, en yaygın olarak kullanılan bu tür çalışmalar bulunmaktadır. Bununla birlikte, kemirgen ve insan hücreleri arasında önemli farklılıklar olduğu kabul edilmiştir. Kemirgenler dayalı birçok bulgular insanlara tercüme edilemez. Ayrıca, kitle genomik bilgiler ve nispeten kolay gen düzenleme ve tüm genom sıralamasını analiz hızlı gelişmeler, eğilim daha dişli birkaç insan nöronal kılan, hastalık eğilimli genler keşfetmek ve belirli hastalıklarda işlevlerini ve rollerini ortaya koymayı amaçlayan bir hücre hatları, sadece kullanım sınırlıdır. Teorik olarak, hasta sinir sisteminin örneklerinden elde edilen insan primer sinir kültürleri en iyi seçimdir ama elde etmek imkansız; dolayısıyla alternatif metODS gereklidir. Son yıllarda, bazı yaklaşımlar iki en ayırt olmak, takip edilmiştir. Üretilmesi uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) kullanılarak fare ve insan somatik hücre tekniğin geliştirilmesi eden 3, 4, nöral hücreler, bunlardan 5-7 den daha farklı olabilir. Ancak, üreten ve IPSC karakterize yoğun emek, teknikleri, ve zaman giriş talepleri, hatta bazen engelleyici. Kısa bir süre sonra, bir başka yaklaşım doğrudan somatik hücre 8, 9 ile ilgili nöronal hücrelerini transforme etmek üzere geliştirilmiştir. Elde edilen nöronlar proliferatif olmayan olduğu için, yoğun çalışmalar ve hücre büyük miktarda gerektirir ilaç tarama, içinde bunun uygulanmasını kısıtlar. Her iki teknikler, nöral kök doğrudan türetme avantajları almak için / somatik hücrelerden progenitör hücreleri hala iPSC üretimi ve karakterizasyonu ama yazarlara sıkıcı sürecini atlar çeşitli gruplar 10-12 tarafından araştırılmaktadırdes sonra nöral farklılaşma için nöral kök hücrelerin iyi bir sayı. Biz daha önce hematopoetik progenitör hücrelerin içine Yamanaka transkripsiyon faktörlerinin giriş izleyen, nöral kök hücreler doğrudan ortamı 13 seçerek bir nöral progenitör hücre kullanılarak oluşturulan olabileceğini göstermiştir. Burada, biz detaylı yöntem rapor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yetişkin Tüm Blood 1. Zenginleştirme Hematopoetik Progenitor Hücreleri

Not: hematopötik projenitör hücreleri ve CD34 + hücreleri yoğunluk gradyan santrifüj göre yöntemler kullanılarak kordon kanı, lökoferez malzeme ve tam kan da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan elde edilmiş periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), saflaştırılabilir. Burada listelenen yöntem örnek olarak tam kan kullanır.

  1. Tüm kandan PBMC izole edilmesi:
    1. Ekin merkezi delikten pipetleme SepMate tüpüne lenfosit ayırma ortamı 4,5 ml ilave edilir.
    2. % 2 insan serumu içeren steril DPBS eşit hacimde kan örneği seyreltin (hac / hac). Örneğin, DPBS +% 2 insan serumu, 5 ml numune 5 mi seyreltin.
    3. Tüpün yan aşağı pipetleme seyreltilmiş örnek ekleyin. Merkezi delikten doğrudan örnek dökmek için değil dikkat edin.
    4. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1200 x g'de santrifüjleyin.
    5. Dikkatle PMBC katmanın üzerinde süpernatant kaldırmak.
    6. Yeni bir tüp içine PBMC katmanı (bulutlu) toplayın.
    7. Frenden ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 150 x g'de,% 2 insan tüpüne serum ve santrifüj içeren Dulbecco fosfat-tamponlu salin (DPBS) 15 ml ilave edilir.
    8. Süpernatant atılır ve% 2 insan serumu ihtiva eden DPBS 15 ml pelletini. Hücrelerin sayısını.
    9. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 690 x g'de santrifüjleyin. Tüpten tüm süpernatantı.
    10. 15 1% antibiyotik içeren Iscove değiştirilmiş Dulbecco ortamı (IMDM) ml (h / h) ve% 10 insan serumu, 1 x 10 7 hücre yeniden süspanse hücreleri (hac / hac).
    11. CD34 + hücreleri izole önce% 5, 37 ° C'de CO2 kuluçka hücreleri O / N inkübe edin.
  2. CD34 Multisort Kit kullanılarak PBMC'lerden CD34 + hücrelerinin pozitif seçim:
    NOT: Hızlı çalışın ve soğuk hücreleri yapmak için önceden soğutulmuş çözümleri kullanmak ve kuafajı önlemekkit talimat başına hücre yüzeyinde ve non-spesifik hücre etiketleme antikorların.
    1. 50 ml'lik bir tüp içinde, tüm PMBCs toplayın ve ortamdaki toplam hücre sayısı.
    2. 10 dakika için 300 xg'de hücreleri santrifüjleyin. Tamamen tüm süpernatantı.
    3. 10 8 boncuk tampon maddesi içinde 300 ul başına hücre (DPBS ihtiva eden% 0.5 insan serumu (h / h) ve 2 mM EDTA) 'ye kadar yeniden süspanse edin.
    4. FcR Engelleme Reaktif 100 ul ekleyin ve CD34 MultiSortMicroBeads 100 ul ekleyin.
    5. İyice karıştırın ve buzdolabında 30 dakika süreyle kuluçkalayın (2-8 ° C).
    6. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de kordon 10 8 hücre başına tampon ve santrifüj 2 ml ekleyerek hücreleri yıkayın. Tamamen süpernatantı.
    7. Tampon 500 ul 10 8 hücrelere kadar yeniden süspanse edin.
    8. Bir MACS Ayırıcı manyetik alan MACS LS kolonu yerleştirin ve boncuk tamponu, 3 ml ile durulama kolon hazırlanmıştır.
    9. Cente üzerine hücre süspansiyonu Uygulasütun r. Etiketsiz hücreleri tercih eğer içinden toplanabilir akacaktır.
    10. Yıkama kolon boncuk tamponu, 3 ml ile üç kez.
    11. Ayırıcıdan gelen sütun çıkarın ve 15 ml'lik bir tüp üzerine yerleştirin.
    12. Kolona boncuk tampon 5 ml ekleyin ve hemen sütuna pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri dışarı floş.
    13. Hücre süspansiyonunun 1 ml'si başına Multisort salıcı ayıraç 20 ul ekle. İyice karıştırın ve buzdolabında 10 dakika süreyle kuluçkalayın (2-8 ° C).
    14. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri 10 7 hücre başına boncuk tamponu 2 ml ve santrifüj - 1 ekleyin. Tamamen süpernatantı.
    15. 10 7 hücre başına boncuk tampon 50 ul süspanse hücreleri.
    16. 10 7 hücre başına Multisort Durdurma Reaktifi 30 ul eklenir ve buzdolabında 15 dakika inkübe edilir.
    17. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri boncuk tampon 5 ml ilave edilir ve santrifüj. Süpernatantı atın.

CD34 + Hücreleri Bağlı Sinir Kök Hücre 2. türetilmesi

  1. CD34 + hücreleri, kültür:
    Not: buzdolabında saklandığında Taze hazırlanmış ortam 7 gün içinde kullanılmalıdır. Önemli CD34 hücreleri kaybı 24 saat sonra gözlenen olabilir ama hücre sayısı sürekli azalır veya çoğalma varsa hücrelerinin çoğalması önemli özellikle gün 5. sonra, fark olmalı, kötü, orta veya CD34 hücrelerinin kalitesini ve hücreleri ya ima bir sonraki aşama için kullanılmamalıdır.
    1. CD34 süspanse Kültür CD34 + hücreleri (insan trombopoietin ihtiva eden (StemSpan SFEM ortamı SCF (TPO, 100 ng / ml), fms-benzeri tirosin kinaz 3 (Flt-3) ligandı (100 ng / ml) ve kök hücre faktörü orta muhafaza 100 ng / ml), interlökin-6 (IL-6, 20 ng / ml) ve interlökin-7 (IL-7, 24-çukurlu plaka içinde 20 ng / ml)) (en fazla 3 x 10 5 / kuyuda % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de oyuk başına ortam) 1 ml'lik.
    2. After 24 saat, yüzen hücreleri toplamak ve herhangi bir bağlı hücre ve hücre enkaz kurtulmak için oda sıcaklığında 110 xg'de hücreleri santrifüj. Süpernatant atılır ve ilave 5 gün için% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de, yeni bir 24 oyuklu plaka (de kadar, 1 x 10 5 /) taze CD34 muhafaza ortamı ve tohum, 1 ml süspansiyon hücrelerin.
    3. CD34 + hücreleri kuyularda (Şekil 1A) alt kısmında yüzen sırasında dikkatli bir şekilde yüzer üst yarısını aspire ortamı her gün yarısı değiştirin.
  2. Sendai virüsü transfeksiyonu:
    1. 5. günde, CD34 hücreleri toplamak ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 170 xg'de hücreleri santrifüj. Süpernatantı atın.
    2. De 1 ml ortam maddesi, 24 oyuklu bir plakada 1 x 10 5 / taze ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
    3. Ilk 10 saniye boyunca bir 37 ° C su banyosu içinde tüpler taban daldırılmasıyla bir cytotune-iPS Sendai yeniden programlama kiti çözülme ve daha sonra tamamen çözülmet RT. Kısaca tüpleri santrifüj ve buz üzerine koydu. Ilgili lot için Analiz Sertifikası (COA) listelenen her virüsün tavsiye hacmini karıştırılmasıyla Sendai virüsü karışımı hazırlayın. İçişleri Bakanlığı 15 tavsiye edilir.
    4. CD34 hücrelerinin her oyuğuna Sendai virüsü karışımı ekleyin. Hafifçe sallayarak kuyu karıştırın. CO,% 5, 37 ° C'de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin.
    5. 24 saat sonra transfeksiyon verimliliği gözlemleyin. Hücre gruplar ve küre oluşumu başarılı transfeksiyon (Şekil 1B) için göstergeler olduğuna dikkat edin.
    6. Dikkatli bir orta üst yarısını aktararak kuyunun orta yarısı değiştirin. Yeni bir kuyudaki hücre küre ise, taze ortam ile aynı miktarını ekleyin.
    7. Adım 2.2.6 yineleyerek gün orta her değiştirin.
  3. Sinir kök hücre indüksiyon:
    Not: Hücre koşullarına bağlı olarak, yaklaşık 5 ila 7 gün sonra transfeksiyon, tek tabaka yapışan hücreler 30 ulaşacak -% 50 kaynaşma (Şekil 1C).
    1. Besin Karışımı, F-12 1x N2 ek,% 0.1 (a / h) sığır serum albümini içeren (DMEM / F12), ((Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı yüzen hücreler ve küreler içeren süpernatanlarm çıkarın ve nöral projenitör ortamın 1 ml ilave BSA),% 1 (h / h) antibiyotikler, bazik fibroblast büyüme faktörü ve 20 ng / ml (bFGF), ve yapışkan hücreler içine, epidermal büyüme faktörü (EGF)), 20 ng / ml olmuştur.
    2. İsteğe bağlı olarak, hafifçe pipetleme hücre küreler ayırmak ve 10 dakika boyunca 170 xg'de hücreleri santrifüj. Süpernatantı ve geri kadar komut başına Matrigel ile kaplanmış bir yeni 24 oyuklu bir plaka içerisinde, sinirsel kök ortamı, 1 ml süspansiyon hücrelerin.
    3. % 80 konfluent genellikle 1 hafta sonra, - hücreler 60 ulaşana kadar her gün orta değiştirin.
    4. Süpernatantı atın ve nöral kök hücre ortamı (serum serbest ortamda, MGK SFM) 1 ml ekleyin. Ardından hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırmakÇok nazik pipetleme.
    5. Hücreleri çıkarın ve 6 oyuklu plakanın bir kuyuya hepsi tohum. Nöral kök hücre ortamının bir 1 mi, her oyuğa 2 mi ortam yapmak ekleyin. CO,% 5, 37 ° C'de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin.
    6. Geçen gün orta her değiştirin.
    7. Hücreler% 60 izdiham ulaştığında, ayırmak ve 1 hücreleri Replate: 2.3.4 ve 2.3.6 adımları izleyerek 3 oranında.
  4. Nöral kök hücrelerin dondurulması:
    1. Nöral kök hücre ortamına% 20 dimetil sülfoksit (DMSO) ilave edilerek orta dondurma nöral kök hücre hazırlayın. Buz üzerinde dondurma orta tutun.
    2. Hafifçe pipetleme ve ardından hücre kazıyıcı kullanarak, 6-çukurlu plaka içindeki hücreleri ayırmak. Hücreleri saymak. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 170 xg'de hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı atın.
    3. 1 x 10 6 / ml nöral kök hücre ortamı hücrelerin tekrar. Hücrelere orta dondurma aynı hacimde ekleyin.
    4. 1 ml (5 x 1 eklemeBir dondurarak saklama viali hücre 0 5 toplam hücre). Talimat aşağıdaki Bay Froster dondurma kabı kullanarak hücrelerin dondurun.

3. Sinir Hücre Farklılaşması

  1. Nöronal hücre farklılaşması:
    1. Nöral kök hücreler% 80 izdiham ulaştığınızda, bir lastik polis ile nöral kök hücreleri ayırmak ve daha sonra yavaşça pipetleme ayırmak.
    2. Hücre sayımı ve nöral kök hücre ortamı içinde 1 x 10 5 ug / ml konsantrasyonu ayarlanır.
    3. Nöronal farklılaşma için, poli-D-lisin / laminin kaplanmış kapak hücreleri plaka, 1 x 10 5/24-yuvalı plakalar içinde kayar. CO,% 5, 37 ° C'de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin.
    4. Sinir farklılaştırma ortamının orta yerine (DMEM 1x N2 ek, 1 x B27 ek, 300 ng / ml cAMP, 0.2 mM C vitamini, nörotrofik faktör (BDNF edilen 10 ng / ml beyin) ve 10 ng / ml, glial hücre içeren / F12 türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF)) after 24 saat. CO,% 5, 37 ° C'de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin.
    5. 2 hafta boyunca haftada iki kez nöral farklılaşma ortamı değiştirin.
  2. Astroglial farklılaşma:
    1. Pipetle nöral kök hücreleri ayırmak.
    2. Hücre sayımı ve 5 x 10 4 hücre / ml hücre konsantrasyonunu ayarlamak. 24 oyuklu plakalar üzerine hücreleri Tohum. CO,% 5, 37 ° C'de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin.
    3. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile DMEM / F12 ortamı yerine ve% 5 CO2 inkübatörü içinde 37 ° C'de kuluçkalayın.
    4. 2 hafta boyunca haftada iki kez orta değiştirin. Hücreler 2 hafta önce izdiham ulaşmak, adımlar 3.2.1 ve 3.2.2 Aşağıdaki hücrelerin Replate.
  3. Oligodendrosit farklılaşması:
    1. Pipetle nöral kök hücreleri ayırmak.
    2. Oligodendrosit farklılaştırılmaktadır 1 ml hücreleri ve tohum poli-L-ornitin kaplı 24 oyuklu plakalar üzerine 1 x 10 5 hücre sayımN2 ek içeren DMEM / F12, trombosit türevli büyüme faktörü-AA (PDGF-AA) 10 ng / ml, nörotrofin-3 (NT-3), 2 ng / ml, sonik kirpi 2 ng / ml içeren tirme ortamı ( Sus), ve triiodotironin (T3 3 nM). CO,% 5, 37 ° C'de 2 kuluçka hücreleri inkübe edin.
    3. 2 hafta boyunca haftada iki kez orta değiştirin.
    4. DMEM / 1xN2 takviyesi ile F12 ve T3 3 nM ve kültür miyelin bazik proteini (MBP) üretimi için bir hafta daha hücreler ortam değiştirin.

4. İmmünofloresan Boyama

  1. % 4 paraformaldehid (PFA) ile değiştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
  2. PFA atın ve PBS% 0.1 Triton X-100 (PBS-T) ile 3 kez, her biri 5 dakika süre ihtiva ile yıkayın.
  3. PBS oda sıcaklığında 10 dakika süre ile,% 0.5 Triton X-100 içeren hücreler geçirgenliği.
  4. PBS-T, oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 keçi serumu içeren hücreler bloke eder.
  5. Karşılık gelen birinci Antibo kuluçkaya bırakılırsoğuk bir odada, oda sıcaklığında ya da O / N, 2 saat boyunca% 0.1 BSA içeren PBS-T ile sulandırılmış kalıplar.
  6. PBS-T, her biri 5 dakika süre ile 3 kez hücreleri yıkayın. Karanlıkta bir karıştırıcı üzerinde 1 saat boyunca% 0.1 BSA içeren PBS-T 400 seyreltme: 1 kullanarak bir fluorokrom ile birleştirilmiş ikincil antikor tekabül eden hücreleri inkübe edin.
  7. Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren PBS-T hücreleri yıkayın.
  8. Oda sıcaklığında 5 dakika her biri PBS-T ile hücreler iki kez daha yıkanır.
  9. Bir mikroskop kullanılarak etiketli hücreleri gözlemleyin ve almak fotoğraflar (Şekil 3).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD34 hücrelerinin kalitesi nöral kök hücre naklinin başarısı için kritik öneme sahiptir. Yüksek kaliteli CD34 hücreleri kültür ilk birkaç gün boyunca çoğalırlar ve sadece kültür damarları (Şekil 1A) alt üzerinde yüzen, sigara yapışık, homojen yuvarlak hücreler olarak görünür. Hücre genişletmek spesifik olmayan hücre agrega hücre kültürü sırasında oluşabilecek ise, zaman (Şekil 1B) üzerinden genişletir agrega, ve dernek başarılı enfeksiyon sonuçları gevşek. Yapışık hücreler genellikle tr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğrudan periferik hematopoetik progenitör hücrelerden sinir kök hücreleri üretmek için detaylı bir protokol sağlanır.

Fibroblast hücreleri ile karşılaştırıldığında, insan periferal kan daha erişilebilir. Sunulan protokol fazla 1 x 10 5 hematopoietik progenitör hücreler veya CD34 pozitif hücreleri kullanarak, tam kan, 10 ml zenginleştirilebilir. LuM trombosit toplayıcı U kirlenme genellikle önlenebilir olmasa da, kolayca düşük hızlı santrifüj ile azaltılabilir ve nöral kök hücre ü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, NIH okul içi fonları tarafından finanse edilmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Lenfosit ayırma ortamıLonza17-829E1x
SepMateKök Hücre Teknolojileri1541515 ml
İnsan serumuInvitrogen34005-100
AntibiyotiklerGibco15240-0621%
CD34 MultiSort KitMiltenyi Biotec130-056-701
EDTACellgro46-034-Cl2 mM
MACS LS sütunuMiltenyi Biotec130-042-401
StemSpan SFEM ortamıKök Hücre Teknolojileri96501x
IMDMKalite Biyolojikler112-035-1011x
TPOPeprotech300-18100 ng/ml
Flt-3Peprotech300-19100 ng/ml
SCFPeprotech300-07100 ng/ml
IL-6Peprotech200-0620 ng/ml
IL-7Peprotech200-0720 ng/ml
IPS Sendai Yeniden Programlama KitiYaşam TeknolojileriA1378001
Hücre sıyırıcıSarstedt83.183
DMSOSigmaD2650
CryoTube şişeleriThermo368632
Mr. Frosty kapThermo5100-0001
DMEM/F12Yaşam Teknolojileri12400-0241x
N2 takviyesiYaşam Teknolojileri17502-0481x
Sığır serum albüminiSigmaA2934%0.1 (a/h)
bFGFPeprotech100-18B20 ng/ml
EGFPeprotechAF-100-15
B27 takviyesiYaşam Teknolojileri17504-0441x
NSC serum içermeyen ortamYaşam TeknolojileriA10509011x
Poli-D-lizin/laminin kaplı lamelBD Bioscences354087
cAMPSigmaA9501300 ng/ml
C VitaminiSigmaA02780,2 mM
BDNFPeprotech450-0210 ng/ml
GDNFPeprotech450-1010 ng/ml
Poli-L-ornitinSigmaP49571x
PDGF-AAPeprotech100-13A10 ng/ml
NT-3Peprotech450-032 ng/ml
ShhPeprotech1314-SH/CF2 ng/ml
T3SigmaT63973 nM
PFASigmaP6148%4
PBSKalite Biyolojik119-069-1011x
Keçi serumuSigmaG9023%4
TritonX-100SigmaT9284
Fare monoklonal anti-NestinMilliporeAB59221:1.000 seyreltme
Anti-SOX2 antikorUygulanan Kök HücreASA0120Kullanıma hazır
Fare anti-β III-tubulin antikoruPromegaG712A1: 1.000 seyreltme
Tavşan anti-GFAP antikoruSigmaG45461:100 seyreltme
Anti-O4 antikoruR& D SistemleriMAB1326IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 keçi anti-tavşan antikoruYaşam teknolojileriA110121:400 seyreltme
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare antikoruYaşam teknolojileriA110011:400 seyreltme
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgM antikoruYaşam teknolojileriA210421:250 seyreltme
DAPISigmaD95421 μ g/ml

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941(2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193(2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
  8. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  9. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
  10. Lee, S. -T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801(2011).
  11. Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  12. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
  13. Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720(2013).
  14. Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
  15. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
  16. Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sendai Vir s TransfeksiyonuPeriferik Kan CD34N ral Progenit r Besiyerimm nofloresan MikroskopiNestin SOX2 EkspresyonuN ronal DiferansiyasyonAstrosit Oligodendrosit retimiDo rudan nd ksiyon Y ntemi

İlgili makaleler