Pretargeted PET Görüntüleme Bioorthogonal Ters Elektron Talep Diels-Alder Katılma Harnessing

Özet

Biyoortogonal ters elektron talebi Diels-Alder sikloilavesi, kanser için etkili ve modüler önceden hedeflenmiş bir PET görüntüleme stratejisi oluşturmak için kullanılmıştır. Bu protokolde, bu metodolojinin adımları, kolorektal kanser hedefli antikor huA33 ve ⁶⁴Cu etiketli bir radyoligand kullanan bir model sistem bağlamında açıklanmaktadır.

Özet

Enfes afiniteleri ve özgüllükleri nedeniyle, antikorlar, PET görüntüleme için kanser hücrelerine radyoizotopların verilmesi için son derece umut verici vektörler haline gelmiştir. Bununla birlikte, antikorların uzun fiziksel yarılanma ömrüne sahip radyonüklidlerle etiketlenmesi gerekliliği, genellikle hedef olmayan dokulara yüksek arka plan radyasyon doz oranları ile sonuçlanır. Bu sorunu aşmak için, ters elektron talebi Diels-Alder siklo ekleme reaksiyonuna dayalı önceden hedeflenmiş bir PET görüntüleme stratejisi kullandık. Metodoloji, antikoru radyoaktiviteden ayırır ve böylece farmakokinetik dezavantajlarından kaçınırken antikorların olumlu özelliklerinden yararlanır. Sistem dört adımdan oluşur: (1) bir mAb-trans-siklookten (TCO) konjugatının enjeksiyonu; (2) antikorun tümörde biriktiği ve kandan temizlendiği bir lokalizasyon süresi; (3) radyoaktif işaretli tetrazinin enjeksiyonu; ve (4) bileşenlerin in vivo tıklama ligasyonu ve ardından fazla radyoligandın temizlenmesi. Eldeki çalışmada sunulan örnekte, yüksek tümör-arka plan kontrastına sahip SW1222 kolorektal kanser tümörlerini tanımlamak için ⁶⁴Cu-NOTA etiketli tetrazin radyoligand ve transsiklookten konjuge insanlaştırılmış antikor (huA33) başarıyla kullanıldı. Ayrıca, ön hedefleme metodolojisi, doğrudan ⁶⁴Cu veya ⁸⁹Zr ile etiketlenmiş radyoimmünokonjugatlar tarafından oluşturulan hedef olmayan dokuya radyasyon dozunun sadece bir kısmında yüksek kaliteli görüntüler üretir. Sonuç olarak, bu protokolün modülerliği, trans-siklookten kısmı herhangi bir içselleştirici olmayan antikora eklenebildiğinden ve tetrazin çok çeşitli radyoizotoplara bağlanabildiğinden, en büyük varlıklarından biridir.

Giriş

Son otuz yılda, pozitron emisyon tomografisi (PET) kanser tanı ve tedavisinde vazgeçilmez bir klinik bir araç haline gelmiştir. Antikorlar uzun kanser biyomarkerların onların zarif yakınlık ve özgüllük nedeniyle tümörlere pozitron yayan radyoizotop teslimi için umut verici vektörleri olarak kabul edilmiştir. Antikorların ^1,2 Ancak, nispeten yavaş in vivo farmakokinetiği çoklu-gün radyoizotop kullanılmasını zorunlu kılmaktadır fiziksel yarı-ömürleri. Kısmi vücut BT aksine - - Bu kombinasyon hastalarda hedef olmayan organlar, radioimmunoconjugates intravenöz ve bu nedenle enjekte edilir çünkü özel klinik önemi olan önemli bir komplikasyon yüksek radyasyon dozları verebilir sonucu emilen dozlarda vücudun her yerinde, sorguya dokuların bakılmaksızın.

Bu sorunu aşmak için, önemli çaba develo ithaf edilmiştirAynı anda kendi içsel farmakokinetik sınırlamaları süpürgelik ederken böylece antikorların avantajlı özelliklerini yararlanarak, radyoizotop ve hedefleme parçasını ayrıştırarak PET görüntüleme stratejilerinin pment. Bu stratejiler, - genellikle pretargeting ya da birkaç aşamalı hedefleme olarak adlandırılan - tipik haliyle dört adımı kullanır: (1) bir antijen ve bir radyo-iki bağlayabilen bir antikorun uygulanması; (2) hedef doku ve kan onun izni antikorun birikimi; (3) bir küçük moleküllü radyoligandın yönetimi; ve (4), fazla radyoligandın hızlı bir temizlenme ile. Bazı durumlarda, ^3-8 ve ardından antikorun Radyoligandın in vivo bağlanması, ek bir temizleme maddesi, herhangi bir antikorun atılımını hızlandırmak amacıyla, aşama 2 ve 3 arasında enjekte Bu tümör bağlamak için henüz ve kanda kalır. ⁵

Genel olarak, tw konuşmapretargeting stratejilerin o tipleri edebiyatının en yaygındır. Her iki klinik öncesi modellerde başarılı olmuş olsa da, onlar da kendi klinik uygulanabilirliği engellemiştir anahtar sınırlamaları sahip. İlk strateji, streptavidin-konjuge antikor ve biyotin ile modifiye edilmiş radyo etiketlerin arasında yüksek afinite ile dayanır; Bununla birlikte, streptavidin ile modifiye edilmiş antikorların bağışıklık çeviri ilişkin endişe verici bir sorun olduğu görülmüştür. ^5,6,9,10 İkinci strateji, aksine, bir kanser, her iki bağlanma genetik olarak inşa edilmiş, bispesifik antikorları kullanır Bu ikinci yol kesinlikle yaratıcı iken biyobelirteç antijen ve küçük molekül radyoaktif işaretli hapten. ^3,11-14, geniş uygulanabilirliği sistemi modülerlik karmaşıklığı, gider ve eksikliği ile sınırlıdır.

Son zamanlarda, biz geliştirdik ve (ters elektron talebi Diels-Alder dayalı I bir pretargeted PET görüntüleme metodolojisini yayınladıEDDA) trans -cyclooctene (TCO) ve tetrazin (Tz arasındaki sikloadisyon reaksiyonu;. Gösterildiği gibi Şekil 1) ¹¹ reaksiyon kendisi yıllardır bilinen olsa da, IEDDA kimya, bir tıklama kimya bioconjugation tekniği olarak son yıllarda bir rönesans yaşadı Ralph Weissleder, Joseph Fox, ve peptidler, antikorlar ve nanopartiküller ile floresan görüntüleme dahil ^12-15 IEDDA Siklokatılma ayarları geniş bir yelpazede uygulanmıştır. diğerleri arasında Peter Conti gruplarının büyüleyici çalışmaları yanı sıra nükleer görüntüleme .. ²⁷ bioorthogonal Ve tıklama kimya türde bir dizi ise - eleştirel - radiohalogens ve radiometals hem ^16-26 ligasyon, verimli, yüksek, temiz, hızlı (k _1> 30.000 M ^-1 sn ^-1), seçici ve bir - Cu-katalize azid-alkin siklokatılma, gerilme-terfi azid-alkin siklokatılma ve Staudinger lig dahilations -. o bütün organizmalar uygulamaları pretargeting çok uygundur IEDDA kimya yapar hızlı reaksiyon kinetiği ve bioorthogonality eşsiz kombinasyonu, hem de bioorthogonal olan bu doğrultuda ^28,29, bu son raporuna dikkat etmek önemlidir bizim laboratuarlar pretargeting için IEDDA kimya uygulamak için ilk değildi:. IEDDA ile pretargeted görüntüleme ilk rapor Rossin çalışmaları, vd ortaya çıktı ve bir ¹¹¹ yılında etiketli tetrazin kullanan bir SPECT metodolojisi özellikli ^30.

Yukarıda ele alındığı gibi, pretargeting yöntemi dört oldukça basit adımları içerir (Şekil 2) sahiptir. Eldeki protokolde, ⁶⁴ Cu NOTA etiketli tetrazin radyoligand ve huA33 antikorun bir TCO modifiye edilmiş konjügat kullanmaktadır kolorektal kanser, PET görüntülemesi için bir pretargeted strateji tarif edilecektir. Ancak, bu yöntemin sonuçta modülerliği kendi gr biridirtrans--cyclooctene kısım olarak eatest varlıklar olmayan içe antikora eklenebilir ve tetrazin radyoaktif muhabir çeşitli eklenebilir.

Protokol

ETİK TABLOSU: anlatıldığı in vivo hayvan deneyleri Tüm onaylanmış protokole ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) etik kurallar altında göre yapıldı.

Tz-Bn-Nota 1. Sentezi

1. Küçük bir tepkime kabında, 600 ul NaHCO ₃ tamponu (0.1 M, pH 8.1) içinde 7 mg _NH2 -Bn-nota (1.25 x 10 ^-2 mmol) ile çözülür. Çözeltinin pH kontrol edin. Gerekirse, CO ₃ 0.1 M _Na-2 az miktar kullanılarak 8.1 solüsyonun pH derecesinin ayarlanması.
2. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.5 mg Tz-NHS (1.25 x 10 ^-3 mmol) _NH2 -Bn-NOTA solüsyonu ekleyin.
   Not: Tz-NHS, kuru ya tartıldı ve kuru DMF ya da DMSO (<50 ul) içindeki bir stok çözeltisi eklenebilir.
3. Elde edilen reaksiyon çözeltisi, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca reaksiyona girmesine izinHafif ajitasyon ile.
4. 30 dakika sonra, reaksiyona girmeyen _NH2 -Bn-nota çıkarmak için ters-fazlı _C18 HPLC kromatografisini kullanarak ürünü temizler. Tz-NHS ve Tz-Bn-NOTA en 525 nm dalga boyunda gözlemlenmiştir ise _NH2 -Bn-NOTA, 254 nm bir dalga boyunda izlenebilir.
   NOT: Tutma süreleri açıkça her laboratuvar (pompalar, sütunlar, tüp, vb) HPLC ekipman kurulumu son derece bağlıdır. Bununla birlikte, bir örnek sunmak için ise 0 gradyanı: 100 MeCN / _H2O 100 (her ikisi de% 0.1 TFA ile birlikte): 0 MeCN / _H2O içinde 25 dakika ve analitik bir 4.6 x 250 mm _C18 kolon kullanılmıştır , Tz-Bn-nota, Tz-NHS ve _NH2 tutma süreleri -Bn-NOTA sırasıyla yaklaşık 15 dakika, 16.5 dakika ve 10 dakika olacaktır. Ürün tek bir çalışma ya da bir yarı-hazırlayıcı veya hazırlayıcı _C18 HPLC kolonu kullanılarak birden çok çalışır, ya da diğer reaksiyon bileşenlerine de saflaştırılabilir. ^1H-NMR, analistenen analitik HPLC ve ESI-MS tamamlanmış Tz-Bn-NOTA ön-maddelerin saflığının doğrulanması için kullanılır ve yöntemlerdir. ¹¹
5. Sıvı azot kullanılarak toplanan HPLC yıkama sıvısı dondurun.
6. Opak alüminyum folyo dondurulmuş toplama tüpü sarın.
7. Bir liyofilize damar O donmuş toplama tüpü yerleştirin / N HPLC mobil faz kaldırmak için.
8. -80 ° C'de karanlıkta saflaştırılmış ürünü (bir katı parlak pembe) saklayın.
   NOT: Bu prosedür kabul edilebilir bir durak noktasıdır. tamamlandıktan Tz-Bn-NOTA ön-madde, bu koşullar altında en az 1 yıl stabildir.

HuA33-TCO immünokonjugatın 2. Hazırlık

1. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 1 mg / ml kuru DMF TCO-NHS'nin (2,7 mM) çözeltisi hazırlayın.
2. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü _içinde, bir 2 mg / ml fosfat tamponlu tuzlu su, 1 ml huA33 arasında (13.3 uM) çözeltisi, pH 7.4 (0.01 M PO ₄ ^3- hazırlamak 0.154 M NaCI).
3. Az miktar 0.1 M _Na-2 CO ₃ (<5 ul) kullanılarak, 8,8-9,0 antikor solüsyonun pH derecesinin ayarlanması. PH değerini izlemek için bir mikroelektrot ile pH kağıdı veya pH metre ya kullanın ve pH, 9.0 üzerinde yükselmeye izin vermemek için dikkatli olun.
4. Antikor çözeltisi doğru pH değerinde sonra, aktive edilmiş ester 8 molar eşdeğer tekabül TCO-NHS bir çözelti hacminin ilave edin. Örneğin, 2 mg / ml huA33 antikor çözeltisi (1.33 x 10 ^-8 mol huA33), 1 ml için 1 mg / ml bir TCO-NHS çözeltisi (1.07 x 10 ^-7 mol TCO-NHS), 7.9 ul ekleyin. Çözelti içinde hacme göre% 5 DMF aşılmamalıdır.
5. Yavaşça mikrosantrifüj tüpü birkaç kez ters yüz edilerek çözelti karıştırılır.
6. Opak alüminyum folyo mikrosantrifüj tüp sarın.
7. Çözelti, hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona izin verin.
8. Oda sıcaklığında 1 saat sonra, bir önceden paketlenmiş tek SIZ kullanılarak elde edilen immünokonjugat arındırmakE dışlama kullanımlık tuz alıcı sütun. Depolama sırasında sütun üzerinde mevcut olan herhangi bir koruyucu çıkarmak için satıcı tarafından tarif edildiği gibi İlk olarak, boyut dışlama sütununa yıkayın. Daha sonra, boyut dışlama sütununa reaksiyon karışımına ilave edildi, 1.5 ml% 0.9 steril tuzlu su ile sütun durulama ve daha sonra, yıkama sıvısı olarak% 0.9 steril tuzlu su içinde 2 ml kullanılarak ürün toplamak.
   NOT: Bu adım, bir 2 ml solüsyon olarak tamamlanan huA33-TCO verecektir.
9. UV-Vis spektrofotometre üzerinde bileşke huA33-TCO konsantrasyonunu ölçün.
10. Daha yüksek bir konsantrasyonu, arzu edildiği takdirde, 50,000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir santrifüj filtre birimi kullanılarak huA33-TCO çözelti konsantre edilir.
    NOT: huA33 ve diğer iyi bilinen antikor (örneğin, bevasizumab, trastuzumab, setuksimab, ve J591) 'in bir dizi konsantre edilmeden çok dayanıklı iken, toplama ve çökelme diğer durumlarda konsantrasyonuna bağlı olabileceğine dikkat etmek önemlidir. Araştırmacılar bu proced çalışılıyorYeni bir antikor ile ure edebiyat veya antikor konsantre olsun veya olmasın ile ilgili söz konusu antikorun kendi bilgi güvenmeli.
11. Karanlıkta 4 ° C'da tamamlanmıştır huA33-TCO immüno saklayın.
    NOT: Bu prosedür kabul edilebilir bir durak noktasıdır. tamamlandıktan mAb TCO konjügat, bu saklama koşulları altında en az 3 ay boyunca stabil olmalıdır.

Tz-Bn-Nota 3. ⁶⁴ Cu Radyo-etiketlenmesi

NOT: protokolün Bu adım işlenmesini ve radyoaktivite manipülasyonu içerir. Veya radyoaktivite ile başka bir işi yapan - - Bu adımları gerçekleştirmeden önce araştırmacılar kendi kurumun Radyasyon Güvenliği Bölümü ile başvurmalısınız. Iyonize radyasyona maruziyeti en aza indirmek için mümkün olan tüm adımları atın.

1. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 0.5 mg / ml (723 uM) t-Bn-nota bir solüsyon hazırlanır.
2. 1.7 mi microC olarakentrifuge tüp, 0.2 M _NH4OAc, pH 5.5 tampon maddesi, 400 ul Tz-Bn-NOTA çözeltisi (5 ug) ve 10 ul _ekle.
3. Uygun radyokimyasal not tutma adına, ölçmek ve önce ve aşağıda protokol (3.4-3.8) olarak izleyen adımlardan sonra bir doz kalibratörü kullanılarak numune radyoaktivite miktarı kaydedin. Bu radyokimyasal verimi doğru kararlılıkla yardımcı olacaktır.
4. Tz-Bn-NOTA çözeltisine ⁶⁴ Cu 2,000 uCi (74 MBq) ekleyin.
   Not: Genellikle, ^[64 Cu] CuCl ₂ 0.1 N HCI küçük bir hacimde (<30 ul) temin edilir, ve bu nedenle sadece küçük miktarlarda (<10 | il), bu stok çözeltisi, radyo-etiketleme reaksiyonu için ihtiyaç vardır. ^[64 Cu] CuCI ₂ stokunun büyük hacimler gerekiyorsa, Radyoetiketleme reaksiyonu genel reaksiyon hacmi artan hoşgörülü olduğunu. Bununla birlikte, radyo-etiketleme, reaksiyon çözeltisinin pH'ı sağlamak için dikkatle izlenmelidiro pH 4.0 altına düşmemesi.
5. Çözelti, hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyona izin verin.
6. Kuluçkadan 10 dakika sonra, ters-fazlı _C18 HPLC kromatografisini kullanarak ürünü temizler. Alıkoyma süreleri Açıkçası her laboratuvar (pompalar, sütunlar, tüp, vb) HPLC ekipman kurulumu son derece bağlıdır. Bununla birlikte, bir örnek sunmak için, eğer bir gradyan 5:95 MeCN / _H2O 95 (her ikisi de% 0.1 TFA ile birlikte): 5 MeCN / _H2O: 15 dak boyunca kullanılan, ⁶⁴ Cu TZ retansiyon süresi Serbest, kompleks ⁶⁴ Cu yaklaşık 2-4 dk çözücü ön Zehir olurken Bn-NOTA civarında 9.8 dakika olmalıdır.
7. Bir dönen buharlaştıncı kullanarak, HPLC yıkama sıvısı çıkarın.
8. % 0.9 steril tuzlu su içinde ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA ürün içinde yeniden çözülür.
   NOT: ⁶⁴ Cu 12.7 saat fiziksel yarılanma ömrü göz önüne alındığında, bu prosedürde kabul edilebilir bir durak noktası değildir. ⁶⁴ sentezini Cu-Tz-Bn-DEĞİL gerçekleştirinBir radyoligandın enjeksiyonundan hemen önce ve Adım 4.5 hemen 3.7 Adım takip.

Vivo Pretargeted PET Görüntüleme 4.

NOT: Protokol Bölüm 3 gibi, protokol, bu adımı işlenmesini ve radyoaktivite manipülasyonu içerir. Bu adımları gerçekleştirmeden önce araştırmacılar kendi kurumun Radyasyon Güvenliği Bölümü ile başvurmalısınız. Iyonize radyasyona maruziyeti en aza indirmek için mümkün olan tüm adımları atın.

1. Ve bir kadın atimik çıplak fare, deri altı implantı 1 x 10 ⁶ SW1222 kolorektal kanser hücreleri bu (9-12 gün aşılamadan sonra) 100-150 mm ³ xenograftlarının içine büyümeye izin verin. ¹¹
2. % 0.9 steril tuzlu su içinde 0.5 mg / ml'lik bir konsantrasyona kadar Protokolü Bölüm 2 huA33-TCO çözeltisi bir kısım seyreltin.
3. Ksenograft taşıyan fare kuyruk venine huA33-TCO çözeltisi 200 ul (100 ug) enjekte.
4. Fare tümör huA33-TCO birikimi için 24 saat izin verin.
5. % 0.9 steril tuzlu su içinde, 1.5 mCi / ml 'lik bir konsantrasyona kadar ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA radyoligand seyreltin.
6. Kuyruk damarına (6.7 MBq / nmol bir özgül etkinliğe varsayarak, ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-nota 1.6 nmol;, 11.1 MBq 300 uCi) ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA radyoligand çözeltisi 200 ul enjekte nakil doku taşıyan kobay fareler.
7. Istenen görüntüleme zaman noktasında (örneğin, 2, 6, 12 ya da 24 saat sonra enjeksiyon), bir% 2 izofluran ile anestezi fare: oksijen gazı karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
8. Küçük hayvan PET tarayıcı yatağının üzerinde fare yerleştirin. Oksijen gazı karışımı:% 1 izofluran kullanarak tarama sırasında anestezi koruyun. Tarayıcı yatakta hayvan yerleştirerek önce, ayak-tutam yöntemi kullanılarak anestezi doğrulamak ve anestezi sırasında kurumasını önlemek için fare gözlerine veteriner merhem uygulayın.
9. Statik aracılığıyla fare PET veri elde350-700 keV enerji penceresi ve 6 nsaniye bir tesadüf zamanlama penceresini kullanarak 20 milyon tesadüf olaylar minimum tarayın. Görüntü yakalanmasını tamamladıktan sonra, gözetimsiz fare bırakmayın ve bilinci kazanmış kadar diğer fareler ile bir kafese koymayın.

Sonuçlar

Deneyin ilk üç adım - Tz-Bn-Nota, huA33 için TCO konjugasyonun sentezi ve Tz-Bn-Nota Radyoaktif (Şekil 3 ve 4) inşa - son derece güvenilir. Yukarıda tanımlanan prosedüre durumunda, Tz-Bn-NOTA yapısı yüksek verim ve saflıkta sentezlendi. ~ huA33 antikoru 4.2 ± 0.6 TCO / mAb ile değiştirilmiş olan, ve Tz-Bn-NOTA,>% 85 bozulma düzeltilmiş verim, ve bir spesifik aktivite>% 99, radyokimyasal saflık saflaştırılmış radyoligand vermek üzere ⁶⁴ Cu ile radyo-etiketli olduğu 6.7 M...

Tartışma

Bu pretargeted PET görüntüleme stratejisinin temel avantajı, doğrudan etiketli antikorlar tarafından üretilen arka plan radyasyon dozunun sadece bir kısmını hedef-arka görüntü kontrast ile tümörlerin ortaya çıkarma yeteneğine sahip olmasıdır. Örneğin, burada açıklanan kolorektal kanser görüntüleme sisteminde, akut biyolojik dağılım deneylerden elde edilen veriler, doğrudan etiketli ⁶⁴ Cu-NOTA-huA33 ve ⁸⁹ Zr-DFO-huA33 ile birlikte ⁶⁴ Cu-tabanlı pretargeting stratejisi için dozimetre hesap...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tetrazin NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Mağazası -80 ° C'de; C
Trans-siklookten NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Mağazası -80 &° C'de; C
p-NH2-Bn-NOTA	Makrosiklik	B-601	-80 &°C'de saklayın; Ç